CN111607590B - 适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法及试剂盒，提取试剂盒含有裂解结合液、磁珠溶液、消化酶、核酸释放剂、洗涤液、缓冲液。与常规的病毒核酸提取方法相比较，本方法操作步骤简单、安全，一次性加入裂解结合液和磁珠等组分，实现了裂解和结合同时进行，可以达到DNA和RNA共提；根据后续实验需要，可选择性保留DNA和/或RNA，且抑制物质残留少。试剂盒可采用预分装方式，结合核酸自动提取仪使用，整个流程下来仅需40min左右；无氯仿苯酚等有毒试剂。

Description

适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，特别涉及一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法及试剂盒。

背景技术

随着分子生物学技术的兴起与发展，基因组学和蛋白组学逐渐成为研究的热点。基因组水平的研究对于遗传发育、流行病检测、病理变化、生理变化、微生物鉴别诊断等多领域都有着重要影响。基因测序和分子诊断作为分子生物学的重要应用分支，与传统疾病诊断方法相比有着不可替代的优势，合理的样本保存和提取是研究的重要基础保障，对后续的检测分析有重要影响。

血液是人体重要的体液组成部分，与人的生理和病理变化密切相关，常被用来进行相关疾病的诊断。随着分子生物学在分子诊断领域的广泛应用，血液除用于血常规检测外，正逐渐用于疾病的预测和遗传学分析。作为研究的基础，稳定的核酸提取对于基因组学研究是十分重要的。传统的血液提取核酸的方法有很多种类型，如酚氯仿抽提法、盐酸胍裂解过柱法、氯化钠沉淀法等。

比如中国专利CN 106906207A公开了一种核酸提取试剂方法，利用Gu-HCl、Tris-HCl、EDTA、异丙醇、SDS、Triton-100、β-巯基乙醇和柠檬酸钠进行裂解吸附，LiCl、NaCl、MOPS、乙醇等进行洗脱；中国专利申请CN 106867992A公开了一种全血DNA提取方法，裂解液包括异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸三钠、Tween 20，洗涤液包括异硫氰酸胍、Tris-HCl、NaCl和无水乙醇，此类方法需要依靠高浓度的胍盐进行裂解，低温时容易结晶，还需要异丙醇、无水乙醇等试剂配合使用，操作程序复杂繁琐。

中国专利CN 104611324A公开了一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法，裂解液由月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、TE组成，高温裂解后高速离心用于核酸检测。此方法快速简便，但由于血液成分复杂，粗提取方法会影响到核酸提取纯度和产量，对低浓度的样本的应用效果也较差，也难以后续长时间保存核酸。

中国专利申请CN104560959A公开了一种饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒及方法，该方法以氯化钠为蛋白沉淀液，需要冷冻和高温等多个步骤，操作复杂，耗时长，且产物难以干净去除盐离子。

换言之，目前虽然有各式各样的核酸提取方法，但均存在着或多或少的技术缺陷亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法及试剂盒，无需高浓度胍盐，通过裂解液和核酸释放剂来释放核酸，操作简单；可以采用不同的清洗步骤来获取DNA和RNA；通过与磁珠结合，实现快速高效全血核酸提取，且试剂盒中的提取试剂预分装于深孔板，配合核酸提取仪使用即可可实现全自动核酸提取，使用时只需加入适量样本，放入仪器即可自动完成核酸的提取纯化。

本发明的目的在于提供一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取试剂盒，该试剂盒与市面现有试剂盒相比组分简单，试剂毒性小、污染小，核酸提取效率高，无需复杂操作即可获取DNA、RNA核酸。

本发明的目的在于提供一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法，该磁珠法全血提取方法操作步骤简单、安全，一次性加入裂解结合液和磁珠等组分，实现了裂解和结合同时进行，可以达到DNA和RNA共提；根据后续实验需要，可选择性保留DNA和/或RNA，且抑制物质残留少。试剂盒可采用预分装方式，结合核酸自动提取仪使用，整个流程下来仅需40min左右；无氯仿苯酚等有毒试剂。

本发明提供一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取试剂盒，该试剂盒包括预分装的如下试剂：

裂解结合液，其中裂解结合液包括30-70um GuSCN、5-50mMTris-HCl、1-20mMEDTA、0.5-3M NaCl、质量百分比浓度为1-10％的PEG8000、质量百分比浓度为0.1-5％的TritonX-100；

磁珠溶液，其中磁珠溶液包括磁珠和缓冲液；

消化酶；

核酸释放剂；

第一洗涤液，其中第一洗涤液包括0.5-3M NaCl，2-5％PEG8000，20-50％乙醇；

第二洗涤液，其中第二洗涤液包括10-200mMTris-HCI、1-20mM EDTA、质量百分比浓度为0.1-5％的Triton X-100、1-3M NaCI、50-80％乙醇；

第三洗涤液，其中第三洗涤液包括10-200mMTris-HCI、1-20mM EDTA、质量百分比浓度为0.1-5％的Triton X-100、2-5M LiCI、50-80％乙醇；

第四洗涤液，其中第四洗涤液包括10-200mM Tris-HCI、1-20mM EDTA；

洗脱液，其中洗脱液包括5-50mM Tris-HCI、1-20mM EDTA

值得一提的是，本方案还提供仅带有第二洗涤液或第三洗涤液的试剂盒(其他试剂均包含)，若该试剂盒仅带有第二洗涤液，则用于进行DNA和RNA共提取或仅提取DNA；若该试剂盒仅带有第三洗涤液，则用于仅提取RNA。

具体的，在一特定实施例中，本方案提供的磁珠法全血核酸提取试剂盒中的裂解结合液中含有50mM GuSCN、25mM Tris-HCl、10mM EDTA、1.5M NaCl、质量百分比浓度为5％的PEG 8000、质量百分比浓度为3％的Triton X-100，其中磁珠为硅羟基或羧基修饰的磁珠，优选的，磁珠浓度为0.2-1mg/ml，可以是0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1；其中消化酶选择胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K的其中一种，优选的，选择蛋白酶K，且蛋白酶K浓度为80-120mg/ml，蛋白酶K浓度可以是85、90、95、100、105、110、115；核酸释放剂可以是β巯基乙醇或类似物；第一洗涤液包括1.5M NaCl，3％PEG8000，35％乙醇；第二洗涤液包括100mMTris-HCI、10mM EDTA、质量百分比浓度为3％的Triton X-100、3M NaCI、75％乙醇；第三洗涤液包括100mMTris-HCI、10mM EDTA、质量百分比浓度为3％的Triton X-100、3M LiCI、70％乙醇；第四洗涤液包括100mM Tris-HCI、10mM EDTA；洗脱液包括25mM Tris-HCI、10mM EDTA。该磁珠法全血核酸提取试剂盒在本发明中定义为试剂盒1。

本方案提供的适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取试剂盒的裂解结合液中Tris-HCl的浓度可以是10/15/20/25/30/35/40/45mM；EDTA的浓度可以是2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/16/17/18/19mM；NaCl的浓度可以是1/1.5/2/2.5M，PEG 8000的质量百分比为2/3/4/5/6/7/8/9％；Triton X-100的质量百分比可以是1/1.5/2/2.5/3/3.5/4/4.5；第一洗涤液中的NaCl的浓度为1/1.5/2/2.5M，PEG 8000的质量百分比为2/3/4％，乙醇的百分比为25/30/35/40/45％；第二洗涤液和第三洗涤液中的Tris-HCI的浓度为20/30/40/50/60/70/80/90/100/110/120/130/140/150/160/170/180/190mM，EDTA的浓度可以是2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/16/17/18/19mM，Triton X-100的质量百分比可以是1/1.5/2/2.5/3/3.5/4/4.5，乙醇的百分比为25/30/35/40/45/50/55/60/65/70/75％，其中第三洗涤液中的LiCI的浓度为2.5/3/3.5/4/4.5M，其中第二洗涤液中的NaCI的浓度为1.5/2/2.5M：第四洗涤液的Tris-HCI的浓度为20/30/40/50/60/70/80/90/100/110/120/130/140/150/160/170/180/190mM、EDTA的浓度可以是2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/16/17/18/19mM；洗脱液中Tris-HCI的浓度为10/15/20/25/30/35/40/45mM，EDTA的浓度可以是2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/16/17/18/19mM。

对应该试剂盒，本方案提供一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法，包括以下步骤：

取裂解结合液，磁珠溶液，消化酶溶液以及核酸释放剂，加入检测样本后混匀离心，得到混合溶液；将混合溶液置于消化酶对应适宜温度下同时进行裂解和磁珠吸附，得到磁珠吸附核酸溶液；往磁珠吸附核酸溶液中添加洗涤液进行纯化处理，得到纯化核酸溶液；往纯化核酸溶液中加入洗脱液，得到纯化核酸；其中检测样本为全血或血清或血浆样本，其中裂解结合液包括30-70mM GuSCN，5-50mM Tris-HCl、1-20mM EDTA、0.5-3M NaCl、质量百分比浓度为1-10％的PEG8000、质量百分比浓度为0.1-5％的Triton X-100

具体的，本方案提供一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法，包括以下步骤：

1、样本准备步骤：在离心管中加入100-300ul检测样本，其中检测样本是全血或血清或血浆样本，加入400-800ul的裂解结合液、10-50ul的磁珠溶液、10-50ul的消化酶溶液、20-100ul的核酸释放剂，涡旋震荡至样本混匀，然后颠倒5-10次，置于掌上离心机上离心，此处控制低速短时间的离心条件，起到将震荡时冠盖的残留液体离心到管底的效果，得到混合溶液；

其中裂解结合液、磁珠溶液、消化酶溶液、核酸释放剂选自其上的提取试剂盒，其成分和比例参见其上说明。

2、裂解结合步骤：将步骤1制备的样本置于消化酶合适的温度裂解结合5-15min，转移至磁力架上静置1-5min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，得到磁珠吸附核酸溶液；

其中在本方案中，消化酶溶液选择为蛋白酶K，本申请人采购的蛋白酶K最适温度为60℃，因此在裂解结合步骤中将步骤1制备得到的样本置于60摄氏度下裂解；

3、清洗步骤：将步骤2的离心管从磁力架上取下，加入500-1000ul的第一洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体；

4、清洗步骤：根据用户的需求选择加入第二洗涤液或第三洗涤液，震荡混匀后将离心管置于磁力架上进行磁珠吸附，吸弃液体，随后加入第四洗涤液震荡混匀，将离心液置于磁力架上进行磁珠吸附，吸弃液体；

其中若进行DNA和RNA共提取或仅提取DNA时，将步骤3离心管中加入500-1000ml第二洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。加入500-1000ul第四洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，室温晾干1-5min，以减少试剂残留的干扰；

若仅提取RNA时，将步骤3离心管中加入500-1000ml第三洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，加入500-1000ul第四洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，室温晾干1-5min，以减少试剂残留的干扰；

5、洗脱步骤：从磁力架上取下离心管，加入50-1000ul洗脱液，涡旋震荡后静置2min，将离心管转移至磁力架上静置2min至磁珠完全吸附，将洗脱核酸转移至新的离心管中。

具体的，以选择试剂盒1为例进行方法步骤的阐述，本方案提供一种磁珠法全血核酸提取方法，包括以下步骤：在2ml离心管中加入200ul全血，加入600ul的裂解结合液、25ul的磁珠溶液、25ul的蛋白酶K溶液、50ul的核酸释放剂，涡旋震荡至样本混匀，然后颠倒8次，置于掌上离心机短时间离心；将其上制备的样本置于60℃裂解结合10min，转移至磁力架上静置3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体；若客户仅需要提取DNA时，往其上离心管中加入750ml第二洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。加入750ul第四洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，若客户仅需要提取RNA时，往其上离心管中加入750ml第三洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。加入750ul第四洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，室温晾干1-5min；随后从磁力架上取下样本管，加入500ul洗脱液，涡旋震荡后静置2min，将离心管转移至磁力架上静置2min至磁珠完全吸附，将洗脱核酸转移至新的离心管中。

本方案提供的磁珠法核酸提取方法，主要采用蛋白酶K和核酸释放剂进行核酸的裂解；添加少量异硫氰酸胍和EDTA来抑制酶对核酸的降解，保证提取核酸的稳定性，同时避免产物中存在过量胍盐残留，传统高浓度的胍盐会造成后续PCR扩增或测序效率降低；Triton X-100作为表面活性剂，能促进细胞裂解作用；PEG是非离子型的水溶性聚合物，能与蛋白质发生伍配，达到一定浓度时，PEG会产生粘附，对全血中高浓度的蛋白质有吸附和絮凝作用。NaCI和PEG8000作为重要组分能析出核酸并修饰蛋白质，核酸在高盐浓度下会与蛋白质分离并析出附着于磁珠表面，减少血液中大量蛋白质对核酸提取的干扰；磁珠吸附析出的核酸；经过第一洗涤液时，部分析出蛋白质会溶解而核酸仍保持吸附。用户可以根据需要选择第二洗涤液或第三洗涤液来决定提取核酸类型，采用第二洗涤液可实现DNA和RNA共提取，采用第三洗涤液时DNA会溶于洗涤液，进一步得到高纯度RNA，减少基因组核酸对后续检测的影响，能减少非目标检测片段的干扰，提高提取的纯度和浓度。用户也可以选择结合相关核酸酶使用，进一步减少非目的核酸浓度，达到减少干扰的作用。

相较现有技术，本技术方案具有以下的特点和有益效果：不同于常规裂解液中胍盐浓度需要2-4M以上，本方案仅需要50mM的胍盐作为核酸抑制剂，即，本方案采用的胍盐浓度极低，独创地采用PEG在高氯化钠浓度下析出核酸并修饰蛋白质，且配合磁珠法减少了蛋白质对核酸提取的干扰；整个核酸提取方法具有方法简单安全，无需自备异丙醇等溶剂，核酸提取浓度高完整度好纯度高的效果，且该试剂盒和自动核酸提取仪配合使用可实现一步加样得到DNA和RNA，整个方法耗时30-40min，安全高效，适用于大批量样本的高效处理，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中人基因组18S rRNA引物PCR扩增示意图。

图2为本发明实施例中人基因组18S rRNA引物和RSVA引物扩增示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：本方案提供人基因组DNA的方案和手工法提取人基因组DNA的比对。

本试验中涉及到的仪器设备：奥盛的金属浴(60℃加热)，掌上离心机，ABIStepone荧光定量仪，Nanodrop测定核酸浓度。

以同一批次全血为样本进行检测，将全血均匀地分为两组进行检测，当然本方案选择的样本可以是人全血、血清或血浆：

实验组：

在1.5ml离心管中将200ul全血(在检测前混合均匀)，加入500ul裂解结合液，20ul蛋白酶K溶液，30ul核酸释放剂，20ul的磁珠溶液，涡旋震荡至样本混匀，期间每隔1分钟上下颠倒10次，置于掌上离心机上进行低速短时间离心；将上述制备得到的样本置于60℃裂解结合10min，转移到磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，加入600ul的第一洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架2min，磁珠完全吸附后吸弃液体；加入600ul第二洗涤液，震荡混匀，将离心架置于磁力架上2min，磁珠完全吸附后吸弃液体，加入600ul第四洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上2min,磁珠完全吸附后吸弃液体，打开管盖，室温干燥3分钟，至磁珠表面无明显液体；从磁力架上取下离心管，移去磁力架，加入100ul洗脱液，涡旋震荡后静置5min至磁珠完全吸附，吸取上清到干净离心管中，此为纯化后的DNA溶液。

对照组：

在1.5ml离心管中将200ul混合均匀的检测样品(样品在检测前充分混匀)与500ul裂解结合液、20ul蛋白酶K溶液、30ul核酸释放剂混合，立即高速涡旋振荡混匀约30秒，以确保反应液充分混匀，本方案选用的是西安天隆的核酸提取试剂盒；将其上制备的样本60℃孵育10分钟，期间颠倒混匀，使样本充分裂解；向上述裂解液中加入20ul磁珠和20ul RNaseA酶，立即高速涡旋震荡混匀，以确保磁珠与DNA能够充分结合，室温静置5分钟，期间每隔1分钟上下颠倒混匀10次，始终使管内磁珠分布均匀；将离心管置于磁力架，颠倒混匀，静置约2分钟至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；移去磁力架，加入600ul第一洗涤液，立即涡旋振荡以确保洗涤充分，将离心管置于磁力架，静置约2分钟至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；重复步骤；移去磁力架，加入600ul第二洗涤液，立即涡旋振荡以确保洗涤充分。将离心管置于磁力架，静置约2分钟至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；移去磁力架，加入600ul第四洗涤液，立即涡旋振荡以确保洗涤充分，将离心管转移至磁力架上，静置约2分钟直至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内残留液体。；打开管盖，室温干燥3分钟，至磁珠表面无明显液体；移去磁力架，加入100ul洗脱液，涡旋震荡后静置2min；用离心机短暂离心，将离心管置于磁力架上，静置约5分钟直至磁珠全部吸附到管壁，吸取上清到干净离心管中，此为纯化后的DNA溶液。

核酸测定：

将实验组和对照组得到的采用Nanodrop进行核酸测定，观察DNA核酸浓度、A260/A280比值，并采用人18S基因引物进行扩增比较，得到数据如下表一，结果图如图1所示：

表一核酸测定结果

样本	核酸(ng/uL)	A260/A280	A260/A230	A260	A280
						本发明	30.539	1.805	2.044	2.891	1.563
对照试剂	20.065	1.855	2.342	2.401	1.295

从图中可以看到：相同的样本和样本加入量，本发明提取的基因组DNA在纯度上A260/A280达到1.8左右，符合要求，且浓度高于对照试剂盒。

实施例2：本方案提供人基因组DNA和病毒RNA的方案和手工法提取人基因组DNA和病毒RNA的比对：

本试验中涉及到的仪器设备：奥盛的金属浴(60℃加热)，掌上离心机，ABIStepone荧光定量仪，Nanodrop测定核酸浓度。

以同一批次全血为样本进行检测，将全血均匀地分为两组进行检测，当然本方案选择的样本可以是人全血、血清或血浆：

实验组：

在1.5ml离心管中将200ul混合均匀的样本(200ul全血样本中加入10^⁴TCID₅₀合胞病毒A(RSVA)灭活病毒)，加入500ul裂解结合液，20ul蛋白酶K溶液，30ul核酸释放剂，20ul的磁珠溶液，涡旋震荡至样本混匀约30秒，期间每隔1分钟上下颠倒10次，置于掌上离心机上低速短时间离心；将上述制备得到的样本置于60℃裂解结合10min，转移到磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，加入600ul的第一洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架2min，磁珠完全吸附后吸弃液体；加入600ul第二洗涤液，震荡混匀，将离心架置于磁力架上2min，磁珠完全吸附后吸弃液体，加入600ul第四洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上2min,磁珠完全吸附后吸弃液体，打开管盖，室温干燥3分钟，至磁珠表面无明显液体；从磁力架上取下离心管，移去磁力架，加入100ul洗脱液，涡旋震荡后静置5min至磁珠完全吸附，吸取上清到干净离心管中，此为纯化后的DNA溶液。

对照组：

在1.5ml离心管中将200ul混合均匀的样品(样品在测试前混合均匀)与500ul裂解结合液、20ul蛋白酶K溶液、30ul核酸释放剂混合，立即高速涡旋振荡混匀约30秒，以确保反应液充分混匀；将其上制备的样本60℃孵育10分钟，期间颠倒混匀，使样本充分裂解；向上述裂解液中加入20ul磁珠和20ul RNase A酶，立即高速涡旋震荡混匀，以确保磁珠与DNA能够充分结合，室温静置5分钟，期间每隔1分钟上下颠倒混匀10次，始终使管内磁珠分布均匀；将离心管置于磁力架，颠倒混匀，静置约2分钟至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；移去磁力架，加入600ul第一洗涤液，立即涡旋振荡以确保洗涤充分，将离心管置于磁力架，静置约2分钟至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；重复步骤；移去磁力架，加入600ul第二洗涤液，立即涡旋振荡以确保洗涤充分。将离心管置于磁力架，静置约2分钟至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；移去磁力架，加入600ul第四洗涤液，立即涡旋振荡以确保洗涤充分。将离心管置于磁力架，静置约2分钟至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；将离心管转移至磁力架上，静置约2分钟直至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内残留液体，打开管盖，室温干燥3分钟，至磁珠表面无明显液体；移去磁力架，加入100ul洗脱液，涡旋震荡后静置2min；用离心机短暂离心，将离心管置于磁力架上，静置约5分钟直至磁珠全部吸附到管壁，吸取上清到干净离心管中，此为纯化后的DNA溶液。

DNA核酸和病毒RNA检测：

本方案的对照组和试验组均采用两个重复样本进行试验，对应每组试验有两个试验数据，采用Nanodrop进行核酸测定，观察DNA核酸浓度、A260/A280比值，并采用人18S基因引物和RSVA引物进行扩增比较，本得到的结果如表2所示，图如图2所示：

表2核酸DNA和病毒RNA测定结果

如图2所示，本发明试剂方法提取的核酸浓度和纯度更高，扩增结果显示核酸提取效率提高5-10倍，对DNA和RNA的提取均取得较好的效果。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

裂解结合液，其中裂解结合液由50mM GuSCN，25mM Tris-HCl、10 mM EDTA、1.5 MNaCl、质量百分比浓度为5%的PEG8000、质量百分比浓度为3%的Triton X-100组成；

磁珠溶液，其中磁珠溶液包括磁珠和缓冲液；

消化酶；

核酸释放剂；

第一洗涤液，其中第一洗涤液包括1.5M NaCl，3% PEG8000，35％乙醇；

第二洗涤液，其中第二洗涤液包括100mMTris-HCI、10 mM EDTA、质量百分比浓度为3%的Triton X-100、3 M NaCI、75%乙醇；

第四洗涤液，其中第四洗涤液包括100 mM Tris-HCI、10 mM EDTA；

洗脱液，其中洗脱液包括25 mM Tris-HCI、10 mM EDTA。

2.根据权利要求1所述的适用于全血，血清或血浆的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，试剂盒中的试剂采用预分装的形式。

3.根据权利要求1所述的适用于全血，血清或血浆的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，磁珠为硅羟基或羧基修饰的磁珠，消化酶选择蛋白酶K。

4.一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

取裂解结合液，磁珠溶液，消化酶溶液以及核酸释放剂，加入检测样本后混匀离心，得到混合溶液；将混合溶液置于消化酶对应的适宜温度下同时进行裂解和磁珠吸附，得到磁珠吸附核酸溶液；往磁珠吸附核酸溶液中添加洗涤液进行纯化处理，得到纯化核酸溶液；往纯化核酸溶液中加入洗脱液，得到纯化核酸；其中检测样本为全血或血清或血浆样本，其中裂解结合液由50mM GuSCN，25mM Tris-HCl、10 mM EDTA、1.5 M NaCl、质量百分比浓度为5%的PEG8000、质量百分比浓度为3%的Triton X-100组成；

洗涤液包括第一洗涤液、第二洗涤液以及第四洗涤液，其中第一洗涤液包括1.5MNaCl，3% PEG8000，35％乙醇，其中第二洗涤液包括100mMTris-HCI、10 mM EDTA、质量百分比浓度为3%的Triton X-100、3 M NaCI、75%乙醇，其中第四洗涤液包括100 mM Tris-HCI、10 mM EDTA，其中洗脱液包括25 mM Tris-HCI、10 mM EDTA。

5.根据权利要求4所述的一种适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法，其特征在于，往磁珠吸附核酸溶液中添加第一洗涤液后震荡混匀并置于磁力架上静置1-3min，加入第二洗涤液后震荡混匀并置于磁力架上静置1-3min，磁珠完全吸附后吸弃液体，加入第四洗涤液后震荡混匀并置于磁力架上静置1-3min，磁珠完全吸附后吸弃溶液。

Images