CN114457069A - 一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒及使用方法，该试剂盒包括裂解液、蛋白酶K、磁珠液、洗涤液A、洗涤液B及洗脱液；其中所述裂解液包含高离序盐，去污剂，ph5.0‑8.0的缓冲液。该试剂盒可对多生物样本（全血、血清、血浆、唾液、咽拭子及粪便）、多病原体（RNA/DNA病毒、细菌、支原体、衣原体）的核酸进行高得率、高纯度提取，无需进行预处理，且该发明也适用于全自动化核酸提取。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，特别是一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒及使用方法。
背景技术
由于分子生物学技术的不断发展，分子生物学技术检测病原体感染已成为疾病诊断中不可或缺的重要工具。在临床病原体检测中，分子生物学技术的应用可以提高检测结果的准确性，对疾病的快速检测起到极为重要的作用。
随着核酸检测的广泛应用，核酸提取技术也在飞速发展，但目前市面上现有的病原体核酸提取试剂盒中，试剂盒中具有以下弊端：1.生物样本类型单一：仅可提取体液或全血样本；2.病原体类型单一；仅可提取病毒或细菌核酸3.样本预处理操作繁琐：需对细菌或全血样本进行预处理。
对此本发明开发了一种核酸提取效率高，操作简单，适用于自动化核酸提取的病原体核酸提取试剂盒，并且可对各种生物样本中（全血、血清、血浆、唾液、咽拭子及粪便）存在的各种类型的病原体（DNA/RNA病毒、细菌、支原体、衣原体）进行核酸提取，并无需对其进行预处理。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒及使用方法。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、蛋白酶K、磁珠液、洗涤液A、洗涤液B及洗脱液；
首先，所述裂解液包括高离序盐，去污剂，ph5.0-8.0缓冲液。其中高离序盐浓度为1.2-5M，选自异硫氰酸胍、盐酸胍或高氯酸锂中的一种或多种；去污剂占裂解液总体积的5-20%，选自Triton x-100、吐温-20、NP-40或SDS中的一种或多种；ph5.0-8.0缓冲液浓度为0.05M-0.2M，选自三羟甲基氨基甲烷、乙酸钠或柠檬酸钠中的一种；此外还包括5mm-50mmEDTA。
所述蛋白酶K、磁珠液，均为外购产品，其中蛋白酶K浓度为10-50mg/mL；磁珠液浓度为25-50mg/mL。
所述洗涤液A包含：高浓度无机盐，醇类。
其中高浓度无机盐浓度为2M-4.2M，选自氯化钠、碘化钾或氯化钾中的一种或多种；醇类选自乙醇和异丙醇中的一种或多种。
所述洗涤液B为60-80%醇类。
所述洗脱液为0.1%焦碳酸二乙酯。
其次，本发明还提供了一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒的使用方法，具体操作步骤如下：
在生物样本中加入裂解液与蛋白酶K，40-70℃裂解1min，加入磁珠液混匀1-10min。
将步骤1）的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液，并加入0.5-1mL的洗涤液A，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液。
向步骤2）离心管内加入0.5-1mL的洗涤液B，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液（此步骤重复1次）；
将磁珠置于空气中干燥5-10min，待磁珠表面无残留液体后，加入50-100洗脱液,55-85℃温育5-10min（中途每2-3min混匀一次），后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，将核酸液转移至新的离心管中备用。
利用本发明的技术方案制作的一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒及使用方法，无需对生物样本进行预处理，可直接对其进行核酸提取，可提取多种样本内的多种病原体核酸，涉及的生物样本和病原微生物的类型多，从而节约成本，实现一种试剂盒多种用途，且可使用全自动化核酸提取仪对大批量样本进行核酸提取，节省时间且提高提取效率，更适用于临床样本检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中唾液样本乙流病毒核酸提取本发明试剂盒与对照试剂盒1、2结果对比图；
图2为本发明实施例1中全血样本乙流病毒核酸提取本发明试剂盒与对照试剂盒1、2结果对比图；
图3为本发明实施例1中血浆样本乙流病毒核酸提取本发明试剂盒与对照试剂盒1、2结果对比图；
图4为本发明实施例2中全血样本腺病毒核酸提取与对照试剂盒1、2结果对比图；
图5为本发明实施例2中全血样本大肠杆菌核酸提取与对照试剂盒1、2结果对比图；
图6为本发明实施例2中全血样本支原体核酸提取与对照试剂盒1、2结果对比图；
图7为本发明实施例3中全血样本腺病毒手提试剂盒与机提试剂盒的结果比对图；
图8为本发明实施例4的结构示意图；
图9为本发明实施例4的剖视结构示意图。
图中，1、试剂盒；2、试剂密封盖；3、上密封凸环；4、下密封凸环；5、上密封胶垫；6、下密封胶垫；7、啮合环；8、啮合环槽；9、环形密封槽；
具体实施方式
实施例1：多种生物样本乙流病毒核酸提取
本发明适用于多种生物样本中病原体的核酸提取（全血、唾液、血清、血浆、拭子、粪便），故本实施例对该生物样本其中3例进行进一步说明，将乙流病毒用阴性生物样本进行稀释，均稀释至102copies/mL，阴性生物样本包括：全血、唾液、血浆。
提取核酸的具体步骤如下：
1）在200μL生物样本中加入500μL裂解液，20μL蛋白酶K，45℃裂解1min，加入磁珠液混匀5min。
2）将步骤1）的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液，并加入0.7mL的洗涤液A，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液。
3）向步骤2）离心管内加入0.8mL的洗涤液B，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液（此步骤重复1次）
4）将磁珠置于空气中干燥5min，待磁珠表面无残留液体后，加入65μL洗脱液,70℃温育6min（中途每2-3min混匀一次），后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，将核酸液转移至新的离心管中备用。
提取完成后，取上述乙型流感核酸RNA提取液5μL作为模板，使用荧光定量PCR仪进行扩增，本发明的核酸提取试剂盒与对照试剂盒检测乙流结果如表1所示
表1：实施例1结果-ct值对比
根据表1结果和图1、图2、图3所示，本发明试剂盒对不同生物样本类型的乙流病毒核酸进行提取，核酸提取效果均优于对照试剂盒1和对照试剂盒2。
实施例2：全血样本中多种病原体核酸提取
本发明适用于多种病原体核酸提取（RNA/DNA病毒、细菌、支原体、衣原体），故本实施例对该病原体类型其中3例进行进一步说明，将全血样本作为阴性样本对病原体进行稀释，病原体包括：腺病毒、大肠杆菌、支原体。（其中腺病毒、支原体均稀释至104copies/mL,大肠杆菌OD600为0.12）
提取核酸的具体步骤如下：
1）在200μL生物样本中加入500μL裂解液，20μL蛋白酶K，45℃裂解1min，加入磁珠液混匀5min。
2）将步骤1）的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液，并加入0.7mL的洗涤液A，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液。
3）向步骤2）离心管内加入0.8mL的洗涤液B，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液（此步骤重复1次）
4）将磁珠置于空气中干燥5min，待磁珠表面无残留液体后，加入65μL洗脱液,70℃温育6min（中途每2-3min混匀一次），后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，将核酸液转移至新的离心管中备用。
提取完成后，取上述核酸提取液5μL作为模板，使用荧光定量PCR仪进行扩增，本发明的核酸提取试剂盒与对照试剂盒检测结果如表2所示
对提取后的核酸进行定量与纯度检测，以全血样本提取NDA病毒腺病毒核酸为例，取5μL样本，以上述洗脱液作为空白检测，使用超微量紫外分光光度计测定样本A260/A280数值并利用比值检测核酸纯度，与对照试剂盒进行比对，结果如表3所示
表2： 实施例2结果-ct值对比
表3：实施例2结果-浓度与纯度对比
根据表2、表3和图4、图5、图6结果所示，本发明试剂盒对相同生物样本类型的不同病原体核酸进行提取，结果均优于对照试剂盒1和对照试剂盒2；且本发明从全血样本中提取到的核酸得率与对照试剂盒1、对照试剂盒2核酸相比核酸得率最高，且A260/A280比值也在1.8-2.0范围内，说明核酸纯度也较好，故可说明本发明的核酸提取效果很好。
实施例3：
本发明同时适用于手动核酸提取与全自动化核酸提取，可进行大批量样本的核酸提取，故本实施例将结合手动核酸提取与自动化核酸提取全血样本中的腺病毒结果进行进一步说明，本实施例将全血样本作为阴性样本将腺病毒稀释至104copies/mL进行核酸提取。
手动提取核酸的具体步骤如下：
1）在200μL生物样本中加入500μL裂解液，20μL蛋白酶K，45℃裂解1min，加入磁珠液混匀5min。
2）将步骤1）的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液，并加入0.7mL的洗涤液A，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液。
3）向步骤2）离心管内加入0.8mL的洗涤液B，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液（此步骤重复1次）
4）将磁珠置于空气中干燥5min，待磁珠表面无残留液体后，加入65μL洗脱液,70℃温育6min（中途每2-3min混匀一次），后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，将核酸液转移至新的离心管中备用。
全自动化核酸提取程序如下表4
表4：全自动化核酸提取程序
提取完成后，取上述核酸提取液5μL作为模板，使用荧光定量PCR仪进行扩增，本发明的核酸提取试剂盒手提与机提结果如表5所示
同时对提取后的核酸进行定量与纯度检测，使用超微量紫外分光光度计测定样本A260/A280数值并利用比值检测核酸纯度，对本发明的手提试剂盒与机提试剂盒结果进行比对，结果如表6所示
表5：实施例3结果-ct值对比
表6：实施例3结果-浓度与纯度对比
根据表5、表6和图7的结果所示，本发明的手提核酸试剂盒与全自动化核酸提取试剂盒结果保持一致，整个核酸提取过程仅需20min，用时较少。若需要对大批量样本进行同时提取时，可使用全自动化进行核酸提取，大批量样本的核酸提取全程也仅需20min，可广泛用于临床样本病原体的核酸提取，从而提高病原体临床检测的效率。
实施例4
该试剂盒1包括：试剂盒1、试剂密封盖2以及密封结构；
密封结构包含：上密封凸环3、下密封凸环4、上密封胶垫5、下密封胶垫6、啮合环7、啮合环7槽；
啮合环7槽设置于试剂盒1中心开口部位，啮合环7位于试剂密封盖2上，上密封凸环3、下密封凸环4分别设置于试剂密封盖2与试剂盒1的端面开口上，试剂盒1、试剂密封盖2分别开设有环形密封槽9，啮合环7与啮合环7槽之间通过螺纹啮合，上密封胶垫5、下密封胶垫6分别位于试剂盒1端面开口与试剂密封盖2上。
需要说明的是，试剂密封盖2通过其上的啮合环7啮合进入到试剂盒1端面的啮合环7槽内部，并且，在啮合的过程中，上密封凸环3与下密封凸环4都相应穿过上密封胶垫5、下密封胶垫6的开口后进入到试剂密封盖2与试剂盒1的啮合环7槽中。
具体的，上密封胶垫5、下密封胶垫6均具有与环形密封槽9匹配的环形开口。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、蛋白酶K、磁珠液、洗涤液A、洗涤液B及洗脱液；
所述解液包含：高离序盐，去污剂，ph5.0-8.0的缓冲液；
其中所述高离序盐浓度为1.2-5M，选自异硫氰酸胍、盐酸胍或高氯酸锂中的一种或多种；
所述去污剂占裂解液总体积的5%-20%，选自Triton x-100、吐温-20、NP-40或SDS中的一种或多种；
ph5.0-8.0缓冲液浓度为0.05M-0.2M，选自三羟甲基氨基甲烷、乙酸钠或柠檬酸钠中的一种；
还包括5mm-50mmEDTA。
2.根据权利要求1所述的磁珠法病原体核酸提取试剂盒的洗涤液A，其特在于包含：高浓度无机盐，醇类；
其中所述高浓度无机盐浓度为2M-4.2M，选自氯化钠、碘化钾或氯化钾中的一种或多种；所述醇类选自乙醇和异丙醇中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的磁珠法病原体核酸提取试剂盒的洗涤液B，其特在于包含60-80%醇类。
4.根据权利要求1所述的磁珠法病原体核酸提取试剂盒的洗脱液，其特在于包含0.1%焦碳酸二乙酯。
5.根据权利要求1所述的磁珠法病原体核酸提取试剂盒的蛋白酶K、磁珠液，均为外购产品；
所述蛋白酶K浓度为10-50mg/mL；所述磁珠液浓度为25-50mg/mL。
6.根据权利要求1-6任意项所述的磁珠法病原体核酸提取试剂盒的使用方法，其特征在于，提取方法具体步骤如下：
在生物样本中加入裂解液与蛋白酶K，40-70℃裂解1min，加入磁珠液混匀1-10min；
将步骤1）的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液，并加入0.5-1mL的洗涤液A，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液；
向步骤2）离心管内加入0.5-1mL的洗涤液B，混匀后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，使用无菌吸头弃掉上清液（此步骤重复1次）
将磁珠置于空气中干燥5-10min，待磁珠表面无残留液体后，加入50-100洗脱液,55-85℃温育5-10min（中途每2-3min混匀一次），后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附完全后，将核酸液转移至新的离心管中备用。
7.根据权利要求1所述一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒，其特征在于，还包括：试剂盒、试剂密封盖以及密封结构；
所述密封结构包含：上密封凸环、下密封凸环、上密封胶垫、下密封胶垫、啮合环、啮合环槽；
所述啮合环槽设置于试剂盒中心开口部位，啮合环位于试剂密封盖上，所述上密封凸环、下密封凸环分别设置于试剂密封盖与试剂盒的端面开口上，所述试剂盒、试剂密封盖分别开设有环形密封槽，所述啮合环与啮合环槽之间通过螺纹啮合，所述上密封胶垫、下密封胶垫分别位于试剂盒端面开口与试剂密封盖上。
8.根据权利要求7所述一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒，其特征在于，所述上密封胶垫、下密封胶垫均具有与环形密封槽匹配的环形开口。
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