CN112458081A

CN112458081A - 一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒

Info

Publication number: CN112458081A
Application number: CN202011413179.5A
Authority: CN
Inventors: 任辉; 付监贵
Original assignee: Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co ltd
Current assignee: Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co ltd
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-03-09

Abstract

本发明公开了一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，裂解液成分包括硫氰酸胍/盐酸胍、非离子表面活性剂、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸，其中非离子表面活性剂包括曲拉通X‑100、吐温20、乙基苯基聚乙二醇一种或多种；结合液为异丙醇，与裂解的体积比为1∶1，磁珠为氧化硅羟基纳米磁珠。本发明试剂盒采用纳米磁珠提取法，使用异丙醇作为结合液，使样本裂解、核酸与磁珠结合一步进行，步骤简便易行，能够实现快速、高通量，9min即可完成病毒核酸自动化的提取过程。本发明试剂盒可用于血浆、血清、鼻咽拭子、尿液、分泌液、病毒浓缩液、细胞培养液上清、病毒保存液等样本病毒RNA和DNA的提取。

Description

一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸提取纯化技术领域，具体涉及一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒。

背景技术

目前，提取核酸的方法主要有传统的酚/氯仿有机液相抽提法、碱裂解法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取法、非传统的螯合树脂法、玻璃粉吸附法、硅胶膜吸附柱法。采取传统的酚/氯仿有机液相抽提法有毒有机溶剂会对人体造成伤害且步骤多、操作繁琐；碱裂解法大多用于DNA的提取，且产物含有杂质不利于下游检测实验，此外对RNA的提取效果也较差。硅胶膜吸附柱法需要使用离心机多次离心，单管操作不便于自动化仪器操作，难以实现自动化。

纳米磁珠由核心氧化铁磁性微粒和表面活性功能基团的二氧化硅材料复合而成，磁珠表面可修饰-COOH、-OH等活性功能基团。近年来，磁珠法被广泛应用于不同生物样本的核酸提取纯化，其提取纯化方法简单，无需离心，易于实现自动化。

但是，许多病毒磁珠法核酸提取试剂盒价格较高，使用β-巯基乙醇等有毒有害试剂，裂解、结合分步进行不易自动化，对RNA提取效果较差等问题。因此，一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒的出现，以实现快速、高通量、自动化的提取纯化病毒核酸DNA/RNA。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明公开的一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒。采用胍盐和非离子表面活性剂作为裂解液主要成分，使用异丙醇作为结合液，可实现样本裂解、核酸与磁珠结合一步进行，病毒核酸提取得率高；可实现快速、高通量、自动化的提取纯化病毒核酸。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，包括裂解液、异丙醇、氧化硅羟基纳米磁珠、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K溶液、转运RNA；

所述氧化硅羟基纳米磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，直径为100～1000nm、浓度为50mg/mL；

所述裂解液包括：2～10M硫氰酸胍/盐酸胍、1～10％曲拉通X-100、1～10％吐温20、1～10％乙基苯基聚乙二醇、0.001～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。

作为本发明进一步改进的实施方式，所述洗涤液包括洗涤液I和洗涤液II；

所述洗涤液I包括：1～5M GuHCl、0.1～2M NaCl、0.05～5％吐温-20、异丙醇30～60％；所述洗涤液II为0.01～0.5M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸，3～4倍体积乙醇

作为本发明进一步改进的实施方式，所述洗脱液为Nuclease-free Water。

本发明提供的一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，以实现快速、高通量、自动化的提取纯化病毒核酸。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化。利用特制的样本保存液，保护病毒核酸，提高样本检出率；采集后的样本可常温运输，减少冷链运输产生的成本。

本发明可满足大量病毒样本中提取高质量的DNA/RNA，用于后续检验；提取操作方便、快捷，不需使用大型仪器，可配合多型号的核酸自动提取仪自动提取DNA，可大量、快速、有效地提取病毒样本中的DNA/RNA。

附图说明

图1为本发明具体例1提供的试剂盒提取产物荧光定量PCR扩增图；

图2为本发明具体例2提供的又一试剂盒提取产物荧光定量PCR扩增图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。

下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。

为了达到本发明的目的，本发明提供一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒。

本发明实施例公开的基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，包括裂解液、异丙醇、氧化硅羟基纳米磁珠、洗涤液_I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K溶液、转运RNA；

其中，氧化硅羟基纳米磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，直径为100～1000nm、浓度为50mg/mL；

裂解液包括：2～10M硫氰酸胍/盐酸胍、1～10％曲拉通X-100、1～10％吐温20、1～10％乙基苯基聚乙二醇、0.001～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。

在本发明实施例中，洗涤液包括洗涤液I和洗涤液II；

洗涤液I包括：1～5M GuHCl、0.1～2M NaCl、0.05～5％吐温-20、异丙醇30～60％；所述洗涤液II为0.01～0.5M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸，3～4倍体积乙醇。

在一些实施例中，裂解液包括：4-6M GuHCl、1-5％Triton X-100、1～5％吐温-20、1～5％NP-40、0.001～0.05M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.01M乙二胺四乙酸。所述蛋白酶K浓度为10mg/mL，转运RNA浓度为1μg/μL，纳米磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球直径为1000nm、浓度为50mg/mL。

在一些实施例中，所述洗涤液I包括：1～3M GuHCl、0.1～1M NaCl、0.5～3％吐温-20、异丙醇40～50％；所述洗涤液II为0.01～0.3M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.01M乙二胺四乙酸，3～4倍体积乙醇。

在一些实施例中，洗脱液包括：洗脱液为Nuclease-free Water。

具体例1

本发明的血清/血浆样本中DNA病毒核酸提取方法的一种实施例，包括如下步骤：

1、样本准备：以HBV质控品作为DNA病毒代表样本，使用阴性血浆稀释、阴性血清稀释成10⁵个/mL，作为待测样本备用。

2、病毒DNA提取：

(1)取一个新的1.5mL离心管，加入200μL待测样本，再依次加入40μL蛋白酶K，400μL裂解液，1μL转运RNA，200μL异丙醇和20μL纳米磁珠，调整合适的转速漩涡振荡混合均匀，并将离心管置于55℃加热15min(每隔5min颠倒数次)。然后将离心管置于磁性分离器上静置1min，用移液器吸去上清液。

(2)加入600μL洗涤液I，用移液器缓慢吹打磁珠10次或漩涡震荡10s，使磁珠充分重悬，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

(3)加入600μL洗涤液II，用移液器缓慢吹打磁珠10次或漩涡震荡10s，使磁珠充分重悬，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

(4)重复步骤(3)一次。

(5)保持离心管于磁性分离器上，将其置于超净工作台中风干至磁珠表面无明显光泽(6～8min)。

(6)加入20μL Nuclease-free Water，用移液器缓慢吹打磁珠50次或漩涡震荡1min，使磁珠充分重悬，于55℃加热5min后，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的离心管中，此即为纯化得到的病毒DNA，可保存于-20℃。

3、样本的荧光定量PCR检测

(1)取商品化的乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(上海复星长征医学科学有限公司)，PCR检测反应体系反应程序设置参考试剂盒说明书

4、HBV样品提取产物PCR检测结果如表1、图2。

表1荧光定量PCR检测HBV样品提取结果(CT值)

实验结果：参见图1和表1所示，图1为荧光定量PCR检测HBV样品提取结果，由表1和图1可以看出，本发明提取血清血浆样本中的病毒DNA浓度高而且重复性好。

具体例2

本发明试剂盒可配合核酸自动化提取仪，能够快速高通量的提取样本中的病毒RNA的一种实施例，包括如下步骤：

1、以新型冠状病毒N基因假病毒作为RNA病毒代表样本，加入病毒保存液稀释成10⁵个/mL，作为待测样本备用。

2、使用天隆科技有限公司NP968核酸自动提取仪，使用时孔位添加试剂说明如下：

第1、7孔：样本200μL、蛋白酶K 40μL、裂解液400μL、1μL转运RNA、异丙醇200μL；

第2、8孔：洗涤液I 600μL；

第3、9孔：洗涤液II 600μL；

第4、10孔：洗涤液II 600μL；

第5、11孔：磁珠20μL；

第6、12孔：Nuclease-free Water 100μL。

3、NP968核酸自动提取仪程序设置如表2：

表2 NP968核酸自动提取仪程序设置

4、样本的荧光定量PCR检测

样本的荧光定量PCR检测引物、探针参考中国疾病预防控制中心的发布新型冠状病毒核酸检测序列，PCR检测反应体系配置和程序设置参考PrimeDirect Probe RT-qPCRMix(TAKARA，RR650A)试剂盒。

5、2019-nCOV假病毒提取产物PCR检测结果如表3。

表7 2019-nCOV假病毒荧光定量PCR检测结果(CT值)

样品	本发明试剂盒	竞品试剂盒
			1	29.25	30.26
2	29.17	30.56
			3	29.64	30.84
4	29.70	30.10
			平均值	29.44	30.44
平均偏差	0.27	0.33
			CV值(％)	0.91	1.08

实验结果：参见图2和表3所示，图2为荧光定量PCR检测2019-nCOV假病毒样品提取结果，由表3和图2可以看出，本发明提取的病毒RNA比竞品试剂盒的病毒CT值要高1个，说明本发明试剂盒的病毒RNA的提取提取效率高于竞品试剂盒。

本发明技术关键点包括：

(1)提取裂解液非离子表面活性剂试剂的优化；

(2)结合液成分和加入比例优化；

(3)提取纯化自动化仪器程序的开发。

本发明提供的一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，产生如下的有益效果：

1)本发明通过优化试剂和试剂配比，采用高浓度胍盐、非离子表面活性剂作为裂解液主要成分，异丙醇作为结合液，使样本裂解、核酸与磁珠结合一步进行，不需离心机等大型仪器，能够从200μL拭子样本中提取高拷贝数的病毒核酸，提高了后续检测的灵敏度。

2)本发明试剂盒可配合自动化使用，提取32个病毒样本只需9min左右；裂解液与异丙醇、纳米磁珠预先放置于预装板特定孔中，减少相应操作步骤，提高单位时间样品提取通量。

以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述病毒核酸提取试剂盒包括裂解液、异丙醇、氧化硅羟基纳米磁珠、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K溶液、转运RNA。

2.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括：硫氰酸胍/盐酸胍、非离子表面活性剂、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸。

非离子表面活性剂包括曲拉通X-100、吐温20、乙基苯基聚乙二醇一种或多种。

3.根据权利要求2所述的基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括：2～10M硫氰酸胍/盐酸胍、1～10％曲拉通X-100、1～10％吐温20、1～10％乙基苯基聚乙二醇、0.001～0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸。

4.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，加入的异丙醇与裂解的体积比为1∶1。

5.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述氧化硅羟基纳米磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米磁性微球，直径为100～1000nm、浓度为50mg/mL。

6.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括洗涤液I和洗涤液II。

所述洗涤液I包括：1～5M GuHCl/GuSCN、0.1～2M NaCl、0.05～5％吐温-20、异丙醇30～60％；所述洗涤液II为0.01～0.5M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1M乙二胺四乙酸，3～4倍体积乙醇。

7.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无核酸酶水。

8.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，本发明保存液可用于血浆、血清、鼻咽拭子、尿液、分泌液、病毒浓缩液、细胞培养液上清、病毒保存液等样本病毒RNA和DNA的提取，可适用于核酸提取仪自动化提取病毒样本核酸。