CN112795564A - 一种快速总核酸提取方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速总核酸提取方法及试剂盒，主要用于生物样本中核酸的提取，属于核酸检测技术领域。该试剂盒包括提取液、洗涤液、洗脱液和96孔板，所述的提取液包括裂解液和磁珠；所述的提取液、洗涤液和洗脱液预先分装在96孔板中。本发明调整了试剂盒的组分以及组分的配方，减少了组分数量、减少了操作步骤，缩短了提取流程时间；同时试剂盒采取预分装的形式，可以直接在核酸提取仪上使用，操作更简便，避免了手动分装出错的问题，整体提高了提取效率。本发明还涉及一种采用该试剂盒的快速总核酸提取方法，该方法操作更简便，提高了核酸的提取效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速总核酸提取方法及试剂盒，主要用于生物样本中核酸的提取，属于核酸检测技术领域。
背景技术
随着核酸检测技术的不断进步，从生物样本中提取核酸的方法也在不断进步，而核酸提取试剂即是进行核酸检测之前需要用到的样本前处理试剂，决定了提取到的核酸质量，也影响着完成整个核酸检测所需要的时间。
目前市场上核酸提取试剂盒种类繁多，应用场景也不一而同。随着核酸提取仪的逐渐兴起，采用磁珠法的核酸提取试剂盒越来越多，其主要组分通常包括裂解液、洗涤液1、洗涤液2、磁珠和洗脱液，这些组分以不同体积分装于试剂瓶或试剂管中，组成了不同的试剂盒。现有大多的核酸提取试剂盒操作步骤如下：
1.在离心管中加入100μl样本；
2.再加入1mL裂解液，振荡混匀；
3.在50℃恒温孵育30分钟后，加入15μl磁珠，用移液器上下吹打混匀；
4.室温放置10分钟；
5.将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附后，吸弃上清；
6.将离心管从磁力架上取下，加入1mL洗涤液1用移液器上下吹打混匀；
7.将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时，吸弃上清；
8.不要移动离心管，轻柔加入1mL洗涤液2，静置30秒后再吸弃上清；
9.取下离心管后放置在65℃恒温中开盖干燥1min；
10.加入70μl事先在65℃预热的洗脱液到离心管中，振荡混匀或用移液器吹打混匀，65℃恒温孵育5分钟；
11.将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附后小心将核酸溶液转移至新的离心管中。
可以看出，现有的试剂盒主要缺陷在于：
第一、组分通常是瓶装或管装，在应用于核酸提取仪时，需要手工按照说明书指定的体积分装到96孔板里，不仅操作麻烦，而且96孔板孔数较多，且孔与孔之间间隔小，在手工分装时容易发生装错孔的情况，从而得出错误的试验结果；
第二、现有的核酸提取试剂盒组分较多，核酸提取过程需要经历裂解和两次洗涤，最后再洗脱，组分越多意味着步骤越多、流程耗时越长、核酸损失越多，进而核酸的得率也越低。
因此，本发明所要解决的问题是提供一种快速总核酸提取方法及试剂盒，其操作更简便、操作步骤更少，整体提高提取效率。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种快速总核酸提取试剂盒，该试剂盒提取核酸操作更简便、提取效率更高。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种快速总核酸提取试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括提取液、洗涤液、洗脱液和96孔板，所述的提取液包括裂解液和磁珠；所述的提取液、洗涤液和洗脱液预先分装在96孔板中。试剂盒将裂解液与磁珠预先混合形成提取液，减少了试剂盒组分数量，减少了操作步骤；96孔板上以一列八个孔为一个单位，分别装上一定量的提取液、洗涤液和洗脱液，每个组分预装的量和列数根据试剂盒规格确定，这样的预先分装避免了手工分装时搞错孔的问题；在产品包装形式上，传统的瓶装或管装固然具有使用的灵活性，无论测试多少样本，只需吸取相应的体积进行分装即可，但在实际应用中，考虑到荧光定量PCR仪的使用效率，通常会攒齐一定数量的样本，集中测试，因此将试剂预分装到96孔板中，更具效率。
优选地，所述提取液的裂解液含有Tris、EDTA、异硫氰酸胍和TritonX-100；所述的洗涤液为乙醇溶液；所述的洗脱液含有Tris和EDTA。Tris，三羟甲基氨基甲烷，是一种常用的缓冲液成分，通常与盐酸配比形成Tris-HCl缓冲液；EDTA，乙二胺四乙酸，是一种常用的螯合剂，常用做核酸酶、蛋白酶的抑制剂；异硫氰酸胍是一种强力蛋白变性剂，可使蛋白二级结构消失，与核酸分离；TritonX-100，聚乙二醇辛基苯基醚，是一种常用的表面活性剂，表面活性剂可以破坏细胞的膜结构。
优选地，所述试剂盒中的提取液包括5-50μl的磁珠，更优选的磁珠量为10μl。
优选地，所述试剂盒中的洗涤液乙醇浓度为70％-80％(体积比例)，更优选为80％。
优选地，所述试剂盒提取液的裂解液含有0.1M Tris、0.2M EDTA、3M异硫氰酸胍和2.5％Triton X-100(体积比)。M为mol/L的简写，即一升溶液中某物质的摩尔量。
本发明还提供一种采用所述快速总核酸提取试剂盒的快速总核酸提取方法，该快速总核酸提取方法包括以下步骤：
A.往含有提取液的孔中加入样本；
B.往孔中插入磁棒套，上下振荡混匀，加热至65℃孵育5-15分钟；
C.往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
D.将磁珠转移至含有洗涤液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
E.再次往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
F.将磁珠转移到含有洗脱液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
G.在65℃孵育5分钟后，再次插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠后移走，剩余即为提取完成的核酸样品。
优选地，所述步骤B中的孵育时间为10分钟。
优选地，所述的提取液为400μl，所述的洗涤液为400μl，所述的洗脱液为50-100μl，所述的样本为200μl。更优选地，所述的洗脱液为80μl。
也就是说，优选地，所述快速总核酸提取试剂盒中，提取液预先装量为400μl，洗涤液预先装量为400μl，洗脱液预先装量为50-100μl。
由于核酸存在于细胞内部，外部受细胞膜保护，对于真核生物，还受细胞核的核膜保护，即便是原核生物的病毒，外部也包裹着核衣壳。在做核酸检测时，需要破坏细胞结构，使核酸暴露出来。裂解液中的表面活性剂可以破坏膜结构，而异硫氰酸胍是强力蛋白变性剂，可使蛋白二级结构消失，与核酸分离。裂解液中异硫氰酸胍和表面活性剂的用量对裂解的效果影响巨大，但裂解液与样本的比例也非常关键。传统提取试剂通常使用过量裂解液，认为裂解液越多、裂解越充分，但实际上裂解液过量会导致核酸浓度降低，影响得率。通过优化裂解液用量，可以提高核酸得率，同时减少裂解液用量，也方便后续洗涤纯化。在磁珠方面，研究人员常常关注磁珠的表面基团修饰和用量，但忽略了磁珠的沉降时间和吸附速率。通过选择最合适的沉降时间和吸附速率，可以大大提高核酸的得率。
在洗涤上，传统提取试剂都是洗涤两次，可以提高纯度。但实际上，对于下游应用于PCR的核酸样本，纯度要求并不高。纯化的目的主要是减少核酸样本中影响PCR的抑制物浓度。洗涤两次固然提高了纯度，但同时核酸的损失也很大。减少一次洗涤，使得核酸得率上升，在最终PCR检测时，可使用较少体积的核酸样本，变相减少了PCR反应液中抑制物的浓度。在实际应用中，并不影响PCR检测的结果。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：该快速总核酸提取试剂盒调整了试剂盒的组分以及组分的配方，减少了组分数量、减少了操作步骤，缩短了提取流程时间；同时试剂盒采取预分装的形式，可以直接在核酸提取仪上使用，操作更简便，避免了手动分装出错的问题，整体提高了提取效率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：
磁珠吸附时间和沉降时间的选择试验。
分别取四份不同磁珠，标注为磁珠1、磁珠2、磁珠3和磁珠4，制成悬浮液，各吸取10μl加入到600μl超纯水中，按照表一所示吸附时间吸附一定时间，涡旋震荡，室温静置，并在表一中记录沉降时间。
表一：
从结果可以看出，磁珠2的沉降时间和吸附时间都更合适，与核酸的接触更加充分，对整个提取的时间也更加优化，所以选择磁珠2和磁珠吸附时间60秒即1分钟。
实施例二：
磁珠用量选择试验。
准备五份不同的快速总核酸提取试剂盒，其中磁珠先不加入，提取液中的裂解液含有0.1M Tris、0.2M EDTA、3M异硫氰酸胍和2.5％Triton X-100，洗涤液为80％的乙醇溶液，洗脱液为Tris和EDTA缓冲液。将磁珠按照5μl、10μl、20μl、30μl、40μl五个不同的量加入，与裂解液构成五份不同的的提取液，分别按照以下步骤进行核酸提取：
A.往含有400μl提取液的孔中加入200μl大肠杆菌培养液样本；
B.往孔中插入磁棒套，上下振荡混匀，加热至65℃孵育10分钟；
C.往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
D.将磁珠转移至含有400μl洗涤液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
E.再次往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
F.将磁珠转移到含有80μl洗脱液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
G.在65℃孵育5分钟后，再次插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠后移走，剩余即为提取完成的核酸样品。提取出来核酸用分光光度计测试，并换算成对应的浓度，结果如表二:
从结果可以看出，磁珠用量10μl是最好的，提取的核酸浓度是最高的，因此优选磁珠用量为10μl。
实施例三：
裂解液用量选择试验。
准备五份不同的快速总核酸提取试剂盒，其中裂解液先不加入，提取液中含有10μl的磁珠，洗涤液为80％的乙醇溶液，洗脱液为Tris和EDTA缓冲液。将裂解液按照1000μl、600μl、400μl三个不同的量加入，与磁珠构成三份不同的的提取液，分别按照以下步骤进行核酸提取：
A.往含有提取液的孔中加入200μl大肠杆菌培养液样本；
B.往孔中插入磁棒套，上下振荡混匀，加热至65℃孵育10分钟；
C.往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
D.将磁珠转移至含有400μl洗涤液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
E.再次往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
F.将磁珠转移到含有80μl洗脱液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
G.在65℃孵育5分钟后，再次插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠后移走，剩余即为提取完成的核酸样品。
提取出来核酸用分光光度计测试，并换算成对应的浓度，结果如：
表三:
从结果可以看出，以200μl大肠杆菌培养液作为样本时，对应的裂解液用量为400μl时，获取的核酸浓度最高，因此选择裂解液用量为400μl。
实施例四：
鼻拭子样本总核酸提取试验。
取一个鼻拭子，伸入鼻腔，至鼻咽处，轻轻左右旋转鼻拭子，然后取出，放入病毒保存液中，振荡洗脱，制成样本。
准备好本发明所述的快速总核酸提取试剂盒，其中，所述的提取液包含400μl裂解液和10μl磁珠，所述的裂解液含有0.1M Tris、0.2M EDTA、3M异硫氰酸胍和2.5％Triton X-100，所述的洗涤液为80％的乙醇溶液，所述的洗脱液为Tris和EDTA缓冲液。按照以下步骤进行核酸提取：
A.往含有提取液的孔中加入200μl样本；
B.往孔中插入磁棒套，上下振荡混匀，加热至65℃孵育10分钟；
C.往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
D.将磁珠转移至含有400μl洗涤液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
E.再次往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
F.将磁珠转移到含有80μl洗脱液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
G.在65℃孵育5分钟后，再次插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠后移走，剩余即为提取完成的核酸样品。
另取200μl样本按照对照试剂盒方法操作，提取核酸样品。
提取出来核酸样品用分光光度计测试，并换算成对应的浓度，结果如表四:
| 试剂盒 | 本发明试剂盒 | 对照试剂盒 |
| 核酸浓度 | 2.25ng/μl | 2.02ng/μl |
结论：本发明试剂盒在提取鼻拭子样本时，提取获得的核酸浓度与对照试剂盒相当，但整体操作时间缩短。
实施例五：
大肠杆菌培养液样本总核酸提取试验。
吸取大肠杆菌培养液作为样本。
准备好本发明所述的快速总核酸提取试剂盒，其中，所述的提取液包含400μl裂解液和10μl磁珠，所述的裂解液含有0.1M Tris、0.2M EDTA、3M异硫氰酸胍和2.5％Triton X-100，所述的洗涤液为80％的乙醇溶液，所述的洗脱液为Tris和EDTA缓冲液。按照以下步骤进行核酸提取：
A.往含有提取液的孔中加入200μl样本；
B.往孔中插入磁棒套，上下振荡混匀，加热至65℃孵育10分钟；
C.往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
D.将磁珠转移至含有400μl洗涤液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
E.再次往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
F.将磁珠转移到含有80μl洗脱液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
G.在65℃孵育5分钟后，再次插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠后移走，剩余即为提取完成的核酸样品。
另取200μl样本按照对照试剂盒方法操作，提取核酸样品。
提取出来核酸样品用分光光度计测试，并换算成对应的浓度，结果如表五:
| 试剂盒 | 本发明试剂盒 | 对照试剂盒 |
| 核酸浓度 | 156.25ng/μl | 101.25ng/μl |
结论：本发明试剂盒在提取大肠杆菌培养液样本时，提取获得的核酸浓度高于对照试剂盒，并且整体操作时间缩短。
实施例六：
白色念珠菌培养液样本总核酸提取试验。
吸取白色念珠菌培养液作为样本。
准备好本发明所述的快速总核酸提取试剂盒，其中，所述的提取液包含400μl裂解液和10μl磁珠，所述的裂解液含有0.1M Tris、0.2M EDTA、3M异硫氰酸胍和2.5％Triton X-100，所述的洗涤液为80％的乙醇溶液，所述的洗脱液为Tris和EDTA缓冲液。按照以下步骤进行核酸提取：
A.往含有提取液的孔中加入200μl样本；
B.往孔中插入磁棒套，上下振荡混匀，加热至65℃孵育10分钟；
C.往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
D.将磁珠转移至含有400μl洗涤液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
E.再次往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
F.将磁珠转移到含有80μl洗脱液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
G.在65℃孵育5分钟后，再次插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠后移走，剩余即为提取完成的核酸样品。
另取200μl样本按照对照试剂盒方法操作，提取核酸样品。
提取出来核酸样品用分光光度计测试，并换算成对应的浓度，结果如表六:
| 试剂盒 | 本发明试剂盒 | 对照试剂盒 |
| 核酸浓度 | 10.8ng/μl | 3.56ng/μl |
结论：本发明试剂盒在提取白色念珠菌样本时，提取获得的核酸浓度明显高于对照试剂盒，并且整体操作时间缩短。
虽然已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种快速总核酸提取试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括提取液、洗涤液、洗脱液和96孔板，所述的提取液包括裂解液和磁珠；所述的提取液、洗涤液和洗脱液预先分装在96孔板中。
2.根据权利要求1所述的快速总核酸提取试剂盒，其特征在于：所述提取液的裂解液含有Tris、EDTA、异硫氰酸胍和TritonX-100；所述的洗涤液为乙醇溶液；所述的洗脱液含有Tris和EDTA。
3.根据权利要求1所述的快速总核酸提取试剂盒，其特征在于：所述的提取液包括5-50μl的磁珠。
4.根据权利要求3所述的快速总核酸提取试剂盒，其特征在于：所述的提取液包括10μl的磁珠。
5.根据权利要求2所述的快速总核酸提取试剂盒，其特征在于：所述乙醇溶液为浓度70％-80％的乙醇溶液。
6.根据权利要求2所述的快速总核酸提取试剂盒，其特征在于：所述的裂解液含有0.1MTris、0.2M EDTA、3M异硫氰酸胍和2.5％Triton X-100。
7.一种采用权利要求1-6所述任意一项快速总核酸提取试剂盒的快速总核酸提取方法，其特征在于：该快速总核酸提取方法包括以下步骤：
A.往含有提取液的孔中加入样本；
B.往孔中插入磁棒套，上下振荡混匀，加热至65℃孵育5-15分钟；
C.往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
D.将磁珠转移至含有洗涤液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
E.再次往磁棒套中插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠；
F.将磁珠转移到含有洗脱液的孔中，抽出磁棒，磁棒套上下振荡混匀；
G.在65℃孵育5分钟后，再次插入磁棒，静置1分钟，吸附磁珠后移走，剩余即为提取完成的核酸样品。
8.根据权利要求7所述的快速总核酸提取方法，其特征在于：所述步骤B中的孵育时间为10分钟。
9.根据权利要求7所述的快速总核酸提取方法，其特征在于：所述的提取液为400μl，所述的洗涤液为400μl，所述的洗脱液为50-100μl，所述的样本为200μl。
10.根据权利要求9所述的快速总核酸提取方法，其特征在于：所述的洗脱液为80μl。
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