CN116334073A - 一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法，属于分子生物学检测领域。本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，包括蛋白酶K、裂解液、磁珠悬浮液、漂洗液1、漂洗液2和洗脱液。本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，在提取时，无需暂停机器加入异丙醇，即可完成核酸与磁珠的结合，省时省力。同时自动化漂洗无需干燥等待，最快20分钟内即可获得高质量的核酸。本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，对裂解液和漂洗液进行了改进，均无需加入乙醇或异丙醇。且实施例4表6的数据显示：本发明提取试剂盒的平均Ct值相比现有技术(CN202110831513.7)低2个Ct值，回收效率要高于现有技术(CN202110831513.7)4倍左右。

Description

一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法，属于分子生物学检测领域。
背景技术
血液作为临床上常见的一种检测样本，在基因疾病诊断以及治疗上的作用不可小觑。从血液中获得宿主的核酸是目前临床以及科研中最为常见的一种手段。其中，核酸的浓度以及纯度对于下游众多检验的准确性和可靠性至关重要。
目前核酸提取的方法有最初的溶液法、抽提法和柱式法，及近些年广泛流行的磁珠法等其他方法。磁珠法的核酸提取优化与传统方法比较，最主要的优势主要表现在三个方面。第一：高通量、自动化。可以同时匹配多通道提取仪器，多个样本同时进行提取，减少手动操作中的误差以及样本的挥发和降解；第二，耗时少，操作简单。大多数提取耗时均在1h以内，便可获得多样本核酸，操作简单，无需多步骤操作；第三：利用磁珠与目的核酸的特异性结合，获得的核酸纯度高、浓度好。
目前市面上大多数的核酸提取均离不开醇类试剂，其作为一种重要的核酸助沉剂，它的作用是无法完全替代的。但作为有机溶剂，乙醇和异丙醇都具有一定的毒性，长期使用会对人体产生一定的危害，且均属于易燃、易爆、易挥发的试剂。故使用无醇的试剂替代已是大势所趋，是维护生物安全重中之重。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法，将无醇试剂与磁珠相结合并应用于核酸提取，去除醇类试剂，提取操作过程更加简洁和安全。
在本发明的第一方面，提供了一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒。
所述的试剂盒，包括蛋白酶K、裂解液、磁珠悬浮液、漂洗液1、漂洗液2和洗脱液；
所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL；
所述裂解液为Buffer ML，含100～500mM Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷)，0.5-1mMEDTA(乙二胺四乙酸)，3～6M的盐酸胍，2～5％Triton X-100，0.05％-0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)，0.2M-0.35M山梨醇和3-10％Tween-20，pH为6.5～8.5；进一步地，所述裂解液含0.5MTris-HCL(三羟甲基氨基甲烷)，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.3M山梨醇，4M的盐酸胍，3％Triton X-100，3％Tween-20，0.1％SDS，pH为7.5。
所述磁珠悬浮液中的磁珠为超顺磁微球，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/mL，pH为5.0；
所述漂洗液1为Buffer PW1，含有：10％-30％ PEG-8000，1-2M盐酸胍，pH7-8的20-50mM Tris-HCL和2-5M NaCl；进一步地，所述漂洗液1含30％PEG-8000，1M盐酸胍，pH7.5的30mM Tris-HCL和3M Nacl。
所述漂洗液2为Buffer PW2，含有：10％-20％ PEG-8000，pH7-8的20-50mM Tris-HCL和2-5M NaCl；进一步地，所述漂洗液2含20％PEG-8000，pH7.5的20mM Tris-HCL和2MNacl。
所述洗脱液为Buffer BE，含1～50mM Tris-HCL和1～10mM EDTA，pH为7.5～9.0。进一步地，所述洗脱液含5mM Tris-HCL和2mM EDTA，pH为8.0。
在本发明的第二方面，提供了如第一方面所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒的使用方法，所述方法配合核酸提取仪使用，包括如下步骤：
1)将新鲜放置涡旋振荡仪上震荡混匀10秒后，取300ul血液；
2)按照下表向深孔板内添加试剂：
Figure BDA0004143898040000031
3)将加入试剂的深孔板和磁套按照下列顺序放于CWE3200仪器上；
4)运行相应提取程序，约20分钟后结束。
在本发明的第三方面，提供了如第一方面所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒的使用方法，所述方法为手动提取，包括如下步骤：
1)取300μL血液样本放置1.5ml离心管中，再加入200μL裂解液、20μL蛋白酶K和20μL磁珠悬浮液，涡旋震荡混匀；
2)将水浴锅或恒温混匀仪预热至65℃，震荡幅度1700rpm，孵育20分钟；
3)将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；
4)加入500μL漂洗液1，涡旋震荡混匀后，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；
5)加入500μL漂洗液2，涡旋震荡混匀后，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液.重复一次；
6)离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，向离心管中加入80μL洗脱液后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于56℃、1600rpm的恒温混匀上震荡洗脱10分钟；
7)将离心管固定于磁力架上静置2分钟，所得上清即为核酸提取产物，转移至离心管中-20℃保存备用。
本发明具有如下技术效果：
1)目前针对磁珠法血液样本的核酸提取，大致分为裂解、结合、漂洗、洗脱四个步骤。目前在结合这一步骤，现有技术均采用醇类，进行结合助沉核酸，如乙醇或异丙醇。同时需要匹配机器进行自动化提取的话，在这一步需暂停仪器，人工加入醇类试剂。操作复杂繁琐，不便捷。本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，在提取时，无需暂停机器加入异丙醇，即可完成核酸与磁珠的结合，省时省力。同时自动化漂洗无需干燥等待，最快20分钟内即可获得高质量的核酸。
2)本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，对裂解液和漂洗液进行了改进，均无需加入乙醇或异丙醇。且实施例4表6的数据显示：本发明提取试剂盒的平均Ct值相比现有技术(CN202110831513.7)低2个Ct值，回收效率要高于现有技术(CN202110831513.7)4倍左右。
附图说明
图1为提取产物琼脂糖凝胶电泳结果。
图2为本发明实施例4的提取试剂盒与对比例试剂盒(即现有技术CN202110831513.7)提取样本Ct值的FAM通道对比图。
图3为本发明实施例4的提取试剂盒与对比例试剂盒(即现有技术CN202110831513.7)提取样本Ct值的ROX通道对比图。
具体实施方式
本发明中的所有试剂原材料均采购于上海国药集团化学试剂有限公司。
实施例1
本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，包括蛋白酶K、裂解液、磁珠悬浮液、漂洗液1、漂洗液2和洗脱液；
蛋白酶K的浓度为20mg/mL；
裂解液为Buffer ML，含0.5M Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷)，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.3M山梨醇，4M的盐酸胍，3％Triton X-100，3％Tween-20，0.1％SDS，pH为7.5；
磁珠悬浮液中的磁珠为超顺磁微球，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/mL，pH为5.0；
漂洗液1为Buffer PW1，含30％PEG-8000，1M盐酸胍，30mM Tris-HCL(PH7.5)，3MNacl。
漂洗液2为Buffer PW2，含20％PEG-8000，20mM Tris-HCL(PH7.5)，2M Nacl。
洗脱液为Buffer BE，含5mM Tris-HCL，2mM EDTA，pH为8.0。
实施例2.手动提取
利用实施例1的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，手动提取DNA的方法，包括如下步骤：
1)取300μL血液样本放置1.5ml离心管中，再加入200μL裂解液、20μL蛋白酶K和20μL磁珠悬浮液，涡旋震荡混匀；
2)将水浴锅或恒温混匀仪预热至65℃，震荡幅度1700rpm，孵育20分钟；
3)将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；
4)加入500μL漂洗液1，涡旋震荡混匀后，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；
5)加入500μL漂洗液2，涡旋震荡混匀后，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液.重复一次；
6)离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液。向离心管中加入80μL洗脱液后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于56℃、1600rpm的恒温混匀上震荡洗脱10分钟；
7)将离心管固定于磁力架上静置2分钟，所得上清即为核酸提取产物，转移至离心管中-20℃保存备用。
实施例3.提取仪提取(配合康为CWE3200 32通道核酸提取仪使用)
利用实施例1的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，配合提取仪提取DNA的方法，包括如下步骤：
1)将新鲜放置涡旋振荡仪上震荡混匀10秒后，取300ul血液。
2)按照下表向深孔板内添加试剂：
Figure BDA0004143898040000071
3)将加入试剂的深孔板和磁套按照下列顺序放于CWE3200仪器上。
将磁套与96DW深孔板放入CWE3200 32通道核酸提取仪中，运行“Blood DNA程序”：
Figure BDA0004143898040000072
Figure BDA0004143898040000081
4)约20分钟后程序运行结束，将96 DW深孔板和磁套从仪器中取出，把“6&12Colume”中的洗脱产物转移至离心管中-20℃保存备用。
分别用14个血液样本经过以上操作步骤后，表1为提取DNA浓度和纯度数据；图1为提取产物琼脂糖凝胶电泳结果。图1中为1％琼脂糖凝胶电泳(取提取产物5ul，加入1ul 6xLoading Buffer混合后，加入1％浓度琼脂糖凝胶电泳中，120V，30min)
表1 DNA提取浓度和纯度
样本类型 Conc(ng/ul) A260/A280 A260/A230
血液样本1 86.3 1.97 1.73
血液样本2 62.7 1.83 1.53
血液样本3 71.9 1.83 1.7
血液样本4 66.8 1.86 1.75
血液样本5 75.7 1.94 1.8
血液样本6 69.2 1.97 1.7
血液样本7 65.2 1.98 1.75
血液样本8 60.3 2.01 1.69
血液样本9 73.5 1.78 1.7
血液样本10 59.7 1.7 1.72
血液样本11 60.9 1.82 1.7
血液样本12 62.3 1.79 1.69
血液样本13 59.9 1.82 1.73
血液样本14 65.4 1.85 1.76
从表1和图1可以看出，本发明配合核酸提取仪使用能够高效地提取血液样本中的DNA，并且提取产物得率高，片段完整性高，可用于PCR、基因分型等下游检测。
实施例4：本发明核酸提取试剂盒与现有技术同类产品的对比(“适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液及核酸提取试剂盒”，申请号：202110831513.7)对比如下：
1)配方对比：参见表2和表3，其中表2为本发明提取试剂盒中的试剂配方，表3为对比例试剂盒(即现有技术CN202110831513.7)的提取试剂配方。
表2
Figure BDA0004143898040000091
表3
Figure BDA0004143898040000092
Figure BDA0004143898040000101
2)试剂性能对比：
试剂准备：按上述配方分别配制足量本发明与现有技术(CN202110831513.7)的核酸提取试剂；
样本准备：采取EDTA采血管采集的血液，室温放置，充分混匀备用；
根据康为世纪Human Genomic DNA Quantification Kit说明书要求，将提取到的两组样本分别使用该试剂盒在Bio-Red CFX上检测，按表4种的反应体系配制PCR Mix
在Bio-Red CFX实时荧光定量PCR仪上运行表5中的程序：
表4
Figure BDA0004143898040000102
Figure BDA0004143898040000111
表5
Figure BDA0004143898040000112
程序运行结束后，导出数据，关闭仪器
数据分析：样本提取Ct值的数据统计参见表6，经过对比发现针对检测的2个通道中，采用本实施例试剂盒提取的血液样本Ct值均比对比例试剂盒(即现有技术CN202110831513.7)提取的血液样本Ct值平均低2个Ct，参见图2-图3，分别为本实施例试剂盒与对比例试剂盒(即现有技术CN202110831513.7)提取血液样本Ct值对应2个通道的对比图。结果显示：本发明血液样本提取试剂盒回收率高于现有技术(CN202110831513.7)无醇提取试剂盒的回收率。
表6
Figure BDA0004143898040000113
表6的数据显示：本发明的提取试剂盒的平均Ct值相比现有技术(CN202110831513.7)低2个Ct值，回收效率要高于现有技术(CN202110831513.7)4倍左右。
以上实例仅为本发明所优选的实施例，是为了更好地解释并证明本发明的原理和实际应用，不用于限制本发明，本技术领域的技术人员对具体实施例做出一系列的修改、补充或替代等，均应属于本发明地保护范围。

Claims (9)

1.一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒，包括蛋白酶K、裂解液、磁珠悬浮液、漂洗液1、漂洗液2和洗脱液；
所述裂解液为Buffer ML，含100～500mM Tris-HCL，0.5-1mM EDTA，3～6M的盐酸胍，2～5％Triton X-100，0.05％-0.1％SDS，0.2M-0.35M山梨醇和3-10％Tween-20，pH为6.5～8.5；
所述漂洗液1为Buffer PW1，含有：10％-30％PEG-8000，1-2M盐酸胍，pH7-8的20-50mMTris-HCL和2-5M NaCl；
所述漂洗液2为Buffer PW2，含有：10％-20％PEG-8000，pH7-8的20-50mM Tris-HCL和2-5M NaCl；
所述洗脱液为Buffer BE，含1～50mM Tris-HCL和1～10mM EDTA，pH为7.5～9.0。
2.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
3.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液含0.5M Tris-HCL，1mM EDTA，0.3M山梨醇，4M的盐酸胍，3％Triton X-100，3％Tween-20，0.1％SDS，pH为7.5。
4.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液中的磁珠为超顺磁微球，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/mL，pH为5.0。
5.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液1含30％PEG-8000，1M盐酸胍，pH7.5的30mM Tris-HCL和3M Nacl。
6.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液2含20％PEG-8000，pH7.5的20mM Tris-HCL和2M Nacl。
7.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液含5mM Tris-HCL和2mM EDTA，pH为8.0。
8.如权利要求1-7任意一项所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法配合核酸提取仪使用，包括如下步骤：
1)将新鲜放置涡旋振荡仪上震荡混匀10秒后，取300ul血液；
2)按照下表向深孔板内添加试剂：
Figure FDA0004143898030000021
3)将加入试剂的深孔板和磁套按照下列顺序放于CWE3200仪器上；
4)运行相应提取程序，20分钟后结束。
9.如权利要求1-7任意一项所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法为手动提取，包括如下步骤：
1)取300μL血液样本放置1.5ml离心管中，再加入200μL裂解液、20μL蛋白酶K和20μL磁珠悬浮液，涡旋震荡混匀；
2)将水浴锅或恒温混匀仪预热至65℃，震荡幅度1700rpm，孵育20分钟；
3)将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；
4)加入500μL漂洗液1，涡旋震荡混匀后，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；
5)加入500μL漂洗液2，涡旋震荡混匀后，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液.重复一次；
6)离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，向离心管中加入80μL洗脱液后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于56℃、1600rpm的恒温混匀上震荡洗脱10分钟；
7)将离心管固定于磁力架上静置2分钟，所得上清即为核酸提取产物，转移至离心管中-20℃保存备用。
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