CN108424908A - 一种核酸释放剂及乙肝病毒核酸释放方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸释放剂及乙肝病毒核酸释放方法，该核酸释放剂包括：质量体积百分比为0.02‑0.2％的Gemini季铵盐表面活性剂、50‑300mM的氢氧化钾和0.2‑2ml/100ml的异丙醇，余量为无菌水。本发明的微量核酸释放剂，能快速破坏病原体外壳蛋白结构，并使血清蛋白等干扰PCR扩增的物质封闭、沉淀且使乙肝病毒DNA发生络合作用而充分析出。本发明具有使用安全，操作简便，制造成本低廉的优点。本发明用于直接对血清、血浆或全血标本中乙肝病毒DNA的释放，无需加热，无需离心，只需一步加样，即可完成DNA的释放和提取。本发明实现了乙肝病毒核酸提取与扩增‑荧光PCR定量检测的一步法操作，从根本上解决了多步核酸提取法带来的核酸丢失和污染问题。

Description

一种核酸释放剂及乙肝病毒核酸释放方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种核酸释放剂及乙肝病毒核酸释放方法。
背景技术
目前，核酸提取方法主要有四种：(1)传统煮沸法：碱性裂解液直接与含病原液体混合，高温裂解，离心获取核酸。(2)浓缩煮沸法：先用多聚糖浓缩沉淀病原，然后加碱性裂解液高温裂解，离心获取核酸。(3)离心柱法：采用硅胶膜或玻璃纤维膜吸附、纯化、洗脱获取核酸。(4)磁珠法：采用硅粉或聚乙二烯包被的磁珠吸附、纯化、洗脱获取核酸。
第(1)(2)种方法提取时需要多次换管离心等步聚，样本处理时间长，得率偏低；离心柱法好于第(1)(2)种方法，但步聚仍繁多，提取效率低；磁珠法提取步聚简单，回收率高，易于自动化提取，但产品价格十分昂贵，目前应用并不广泛。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸释放剂及乙肝病毒核酸释放方法，以解决上述现有技术的问题。
为达到上述目的，本发明提供了一种核酸释放剂，所述核酸释放剂包括：质量体积百分比为0.02-0.2％的Gemini季铵盐表面活性剂、50-300mM的氢氧化钾和0.2-2ml/100ml的异丙醇，余量为无菌水。
本发明还提供了一种乙肝病毒核酸释放方法，其包括以下步骤：将上述的核酸释放剂与含乙肝病毒的待测样本混合均匀后，室温下静置一段时间，即得到目的核酸。
上述的乙肝病毒核酸释放方法，其中，所述核酸释放剂与待测样本的体积比为1：1-3。
上述的乙肝病毒核酸释放方法，其中，所述待测样本为血清、血浆或全血。
上述的乙肝病毒核酸释放方法，其中，所述混合均匀的方法为用移液枪插入混合溶液底部吸打多次。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的微量核酸释放剂，能快速破坏病原体外壳蛋白结构，并使血清蛋白等干扰PCR扩增的物质封闭、沉淀且使乙肝病毒(HBV)DNA发生络合作用而充分析出。本发明具有使用安全，操作简便，制造成本低廉的优点。本发明用于直接对血清、血浆或全血标本中乙肝病毒DNA的释放，无需加热，无需离心，只需一步加样，即可完成DNA的释放和提取。本发明实现了乙肝病毒核酸提取与扩增-荧光PCR定量检测的一步法操作，从根本上解决了多步核酸提取法带来的核酸丢失和污染问题。
附图说明
图1为HBV-DNA定量参考品1(1x107IU/ml)、2(1x106IU/ml)，3(1x105IU/ml)、4(1x104IU/ml)的扩增曲线图；
图2为HBV-DNA的定量参考品的标准曲线图；
图3为本发明测试的HBV-DNA浓度为1.3x106的测试的10个反应的扩增曲线图；
图4为本发明测试的10例临床HBV阳性样本的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施例对本发明作进一步的描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。
本发明提供了一种核酸释放剂，所述核酸释放剂包括：质量体积百分比为0.02-0.2％的Gemini季铵盐表面活性剂、50-300mM的氢氧化钾和0.2-2ml/100ml的异丙醇，余量为无菌水。
Gemini季铵盐表面活性剂是新一代的双子表面活性剂，能快速破坏病原体外壳蛋白结构，并使血清蛋白等干扰PCR扩增的物质封闭、沉淀且使HBV DNA发生络合作用而充分析出。
本发明还提供了一种乙肝病毒核酸释放方法，其包括以下步骤：将上述的核酸释放剂与含乙肝病毒的待测样本混合均匀后，室温下静置一段时间，即得到目的核酸。优选地，所述核酸释放剂与待测样本的体积比为1：1-3。在一些实施例中，所述待测样本为血清、血浆或全血。优选地，所述混合均匀的方法为用移液枪插入混合溶液底部吸打多次。
本发明可用于HBV-DNA定量检测，操作步聚为：
将乙型肝炎病毒(HBV)核酸测定试剂盒中各组份恢复室温，震荡，瞬时离心。根据待测样本的数量，按比例(HBV PCR反应液40ul+内标0.2ul/人份)取相应量的HBV-PCR反应液、内标混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
准备相应数量的PCR反应管，每管加入5ul本发明核酸释放剂，再加入待检样品(血清或血浆)5-15ul，用移液枪插入PCR管底部吸打4次以混匀，室温静止4分钟后加入40.2ul上述PCR-mix，瞬时离心，置于ABI7500/Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪扩增，荧光定量PCR反应条件如表1所示。
表1荧光定量PCR反应条件
检测结果具有良好的重复性和特异性，能准确反映血清中病毒的含量，可使乙肝病毒DNA定量检测实现一步法。
图1为HBV-DNA定量参考品1(1x107IU/ml)、2(1x106IU/ml)，3(1x105IU/ml)，4(1x104IU/ml)的扩增曲线图。
图2为HBV-DNA的定量参考品的标准曲线图。将HBV定量参考品1-4的浓度输入仪器软件中进行分析，仪器软件以定量参考品相应浓度的Log10对数值为横坐标，以测定的Ct值为纵坐标给出标准曲线，结果显示，标准曲线的相关系数R2＝0.999490＞0.98，表明定量结果有效。
图3显示的是本发明测试的HBV-DNA浓度为1.3x106的测试的10个反应，Ct值结果如表2所示，Ct值的变异系数(CV＝1.11％)≤5％，表明检测结果具有良好的精密度。
表2反应的Ct值结果
反应 Ct值
1 21.3862
2 21.3665
3 21.5528
4 21.5036
5 21.0800
6 21.4785
7 21.5007
8 22.0217
9 21.5221
10 21.6657
图4显示的是本发明测试的10例临床HBV阳性样本的结果，FAN通道出现标准扩增曲线，且Ct值＜37，同时内标JOE通道出现标准扩增曲线，且Ct值＜40，均可明显判为阳性样本。
现有的核酸释放剂所采用的表面活性剂(如莎梵婷等)，不仅价格昂贵(如10mg莎梵婷的价格为2815元)，造成实验成本大幅增加；同时还为代谢产物，不可避免引入杂质，对后续实验造成影响。本发明采用Gemini季铵盐表面活性剂作为核酸释放剂的主要组份，其不仅价格十分低廉(10mgGemini季铵盐表面活性剂的价格仅为0.003元)，使单次的实验成本几乎可以忽略不计；同时，Gemini季铵盐表面活性剂为化学合成产物，组份清楚，不会对后续实验造成影响。
此外，本发明所提供的核酸释放剂及乙肝病毒核酸释放方法在定量检测未知样本中的核酸含量时，其操作简单，免去了传统提取技术中的离心，弃上清和转管等操作，只需在释放剂中加入样品一步即可完成DNA的提取过程，在很大程度上简化了实验步聚，减少了核酸的丢失(因为提取过程没有中间步聚)，整个操作过程只需要10分钟左右，不但操作快速，简便，更重要的避免了操作过程中的污染问题。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (5)

1.一种核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂包括：质量体积百分比为0.02-0.2％的Gemini季铵盐表面活性剂、50-300mM的氢氧化钾和0.2-2ml/100ml的异丙醇，余量为无菌水。
2.一种乙肝病毒核酸释放方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的核酸释放剂与含乙肝病毒的待测样本混合均匀后，室温下静置一段时间，即得到目的核酸。
3.如权利要求2所述的乙肝病毒核酸释放方法，其特征在于，所述核酸释放剂与待测样本的体积比为1：1-3。
4.如权利要求2所述的乙肝病毒核酸释放方法，其特征在于，所述待测样本为血清、血浆或全血。
5.如权利要求2所述的乙肝病毒核酸释放方法，其特征在于，所述混合均匀的方法为用移液枪插入混合溶液底部吸打多次。
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