CN115247170A - 一种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒及自动化运行程序 - Google Patents
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Abstract
本发明第一方面提供了一种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒,该试剂盒包括:裂解结合液、磁珠悬浮液、蛋白酶K、洗液1、洗液2、洗脱液。本发明第二方面提供了一种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒的自动化运行程序,通过磁珠吸附、病毒核酸裂解、磁吸、震荡清洗、洗脱等步骤获得所需的病毒核酸提取。本发明的第三方面提供了一种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒及自动化运行程序在检测PCR、酶切、分子杂交、文库构建等核酸制备中的用途。该试剂盒可以同时提取DNA/RNA并实现裂解与结合同步进行,从而大幅度缩短裂解时间,进而进一步缩短病毒核酸提取时间。
Description
技术领域
本发明属于分子生学领域,具体是指一种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒及自动化运行程序。
背景技术
核酸提取技术是病毒分子生物学研究的基础,现已广泛应用于病原微生物检测、临床疾病诊断、环境微生物检测、食品安全检测以及法医学鉴定等众多领域。在提取过程中要遵循以下原则:提取尽可能充分,保证一级结构的完整性,避免蛋白质、脂类物质和多糖等生物大分子的污染,并且尽可能缩短和简化提取流程。一种提取效率高、时间短、操作简单的核酸提取试剂已成为快速分子诊断技术的关键。
目前,磁珠法技术越来越主导核酸提取市场,运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。通过Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样品中的DNA和RNA分离出来。
常规的病毒核酸试剂盒整套提取反应时间普遍较长,检测耗时长是限制分子诊断临床筛查能力的重要因素。核酸提取作为分子诊断的前置步骤,缩短其耗时对于提高分子诊断筛查能力是至关重要的。目前自动化磁珠法核酸提取普遍用时在20分钟以上,其中主要包括裂解(结合)、清洗(晾干)、洗脱三步。常规的裂解结合孵育时间长,一般需要孵育8min-15min,常规的提取全程序在吸磁、清洗、晾干耗时约8min-10min,导致整体提取时间的延长;常规的的洗脱前需要将洗脱液加入后50-70℃孵育,孵育时间5分钟左右,耗时较长。
因此本领域技术人员一直在改进各种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒及其对应的自动化运行程序来提高病毒的检测效率,缩短检测时间。
发明内容
本发明提供了一种快速自动化磁珠法核酸提取试剂盒及运行程序,该提取方法可解决现有磁珠法核酸提取过程时间较长的问题,缩短了自动化提取时间,提供了一种自动化快速磁珠法核酸提取的方法:
本发明第一个目的提供了一种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒,该试剂盒包括:裂解结合液、磁珠悬浮液、蛋白酶K、洗液1、洗液2、洗脱液。
解液结合液,主要由浓度为30mM-60mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(简写为:Tris-HCL)、Tris-HCL的PH为8.0-8.5,体积分数为0.02%-0.1%的Antifoam 204和30%-70%的异丙醇组成;此外,裂解结合液还含有以下至少一种成分:质量分数为0.05%~5%的N-月桂酰肌氨酸钠(NLS)、浓度为2-6M的盐酸胍、浓度为2-6M的异硫氰酸胍、质量百分比为0.1-5%的十二烷基磺酸钠(简写为SDS)、质量百分比为5%-15%的聚乙二醇(简写为:PEG)、体积分数为1%-5%Triton X-100。
进一步地,裂解结合液中Tris-HCL浓度为35-50mM、所述Tris-HCL的PH为8.0-8.3。
进一步地,裂解结合液中含有体积分数为0.02%-0.1%的Antifoam 204。
进一步地,裂解结合液中含有体积分数为30%-50%异丙醇。
进一步地,裂解结合液中含有浓度为2-4M的盐酸胍。
进一步地,裂解结合液中含有浓度为2-4M的异硫氰酸胍。
进一步地,裂解结合液中含有质量分数为0.05%~3%的NLS。
进一步地,裂解结合液中含有质量百分比为0.1-2%的SDS。
进一步地,裂解结合液中含有质量百分比为5%-10%的PEG。
进一步地,裂解结合液中含有体积分数为1%-3%Triton X-100。
进一步地,病毒核酸提取试剂盒的磁珠悬浮液的浓度为2-20mg/mL。
进一步地,病毒核酸提取试剂盒的磁珠悬浮液的磁珠为羟基磁珠或羧基磁珠中的一种。
进一步地,磁珠的粒径介于100~500nm之间。
进一步地,磁珠为羧基磁珠。
进一步地,磁珠粒径介于300~500nm。
进一步地,磁珠与裂解结合液可按照任意比例混合。
优选地,磁珠悬浮液与裂解结合液的体积混合比例为1:9~1:6。
进一步地,病毒核酸提取试剂盒的中蛋白酶K溶液的浓度为15-100mg/mL。
优选地,蛋白酶K溶液的浓度为15-50mg/mL。
进一步地,病毒核酸提取试剂盒的洗液1含有体积分数为40%-60%的乙醇溶液。
进一步地,洗液1还含有浓度为0.5-4M的盐酸胍和/或体积分数为0.5%-1%的Triton X-100。
进一步地,洗液1中乙醇含量为50%-60%(体积分数)。
进一步地,洗液1中Triton X-100的含量为0.5%-0.65%(体积分数)。
进一步地,洗液1中盐酸胍的浓度为0.5-2M。
进一步地,病毒核酸提取试剂盒的洗液2为体积分数为50%-80%的乙醇溶液。
进一步地,洗液2为体积分数为70%-80%的乙醇溶液。
进一步地,病毒核酸提取试剂盒的洗脱液为纯水。
本发明的第二个目的一种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒的自动化运行程序,具体包括一下步骤:
步骤A1、磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好50μL-200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为6-40s。
步骤A2、磁吸后将磁珠置于已预装好含有150μL-300μL样品、20-50μL蛋白酶K、300-500μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55-60℃混合孵育2-8min,磁吸6-40s。
步骤A3、磁吸后将磁珠置于已预装好含有300μL-500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗5-80s,磁吸6-40s。
步骤A4、磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL-800μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗5-80s,磁吸6-40s。此时,仪器程序开始启动6号孔位加热模式,加热温度设置为60-92℃,优选70-92℃。
步骤A5、磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL-800μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗5-80s,磁吸6-40s,静置晾干1-5min。
步骤A6、将磁珠置于已预装好含有50μL-100μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1-5min,磁吸6-40s。
步骤A7、将磁珠移至96孔深孔板1/7号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。
进一步地,本发明提供的自动化程序对于待检测样品的加入量并没有特别的限制。但为了使检测效果达到最优,待检测样品的加入量为100μL~300μL。
优选地,待检测样品的加入量为200μL。
进一步地,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:3-1:2。
进一步地,洗液1中非离子型表面活性剂为去垢剂;
进一步地,去垢剂为Triton X-100;
进一步地,裂解结合液的孵育时间2min-4min。
进一步地,自动化提取程序磁棒吸磁时间为6-30s。
进一步地,提取程序步骤过程4中,本发明在洗液2第二次清洗磁珠的同时设定仪器的6号孔位开始加热,提高仪器快速提取工作效率。
进一步地,6号孔的加热温度为85℃-92℃。
本发明的第三方面,提供了前述快速病毒核酸提取试剂盒在自动化仪器设备的应用及用途,在检测PCR、酶切、分子杂交、文库构建等核酸制备中的用途。
本发明技术方案,具有如下优点:
1、本发明特有的裂解结合液,可快速捕获核酸分子。在提取核酸时利用高浓度的蛋白质变性剂异硫氰酸胍,迅速破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,释放出核酸。选用异硫氰酸胍作为一种强变性剂,它既没有RNA酶活性也没有DNA酶活性,可同时提取DNA/RNA。蛋白酶K在温度为50-55℃时酶活性最佳,有助于细胞的裂解,从而获得完全裂解充分的细胞样品,实现裂解与结合同步进行,提高病毒核酸的捕获效率。洗液1中非离子表面活性剂Triton X-100的加入,在清洗过程中作为一种去垢剂,使得清洗后获得纯度更高的核酸产物,有利于提高核酸的质量,保证后续操作的准确性。
2、本发明针对现有提取核酸的自动化程序时间较长的缺陷,进一步改进,运行程序上与常规传统磁珠法核酸提取方法相比,实验步骤简便,纯化程序时间仅需6.5min左右。无需单独加入结合液,裂解与结合同时进行,传统的裂解结合孵育时间长,一般需要孵育8min-15min,本发明特有的裂解结合液仅需2-4min即可达到细胞的完全裂解及核酸快速吸附于磁珠表面。同时本发明经提取程序优化后,缩短了磁珠吸磁、清洗及晾干的时间。传统的洗脱前需要将洗脱液加入后50-70℃孵育,孵育时间5分钟左右,耗时较长。本发明在洗液2第二次清洗磁珠的同时设定仪器的6号孔位开始提前加热,提高仪器快速提取工作效率。
3、本发明提供的试剂盒及自动化运行程序提取速度快,6.5min即可完成32个样品的核酸提取;
4、本发明自动化运行程序在洗脱时间的缩短,传统至少需要5min,本发明仅需3-4min;
5、裂解结合液中加入特定有效含量的Antifoam 204,其可减少裂解结合液震荡时产生的泡沫,提高磁珠与液相的接触面积,有利于提高核酸被磁珠吸附的概率,缩短孵育时间。
附图说明:
图1、本申请一个优选实施例的新型冠状病毒假病毒样品检测结果示意图;
图2、本申请另外一个优选实施例的新型冠状病毒假病毒样品检测结果示意图。
具体实施方式
具体详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明。
实施例1:基于新型冠状病毒假病毒样品检测不同裂解结合液提取效率:
步骤1、新型冠状病毒假病毒样处理:新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒核酸标准物质样品购买自广州邦德盛生物科技有限公司。将假病毒液稀释为500copies/mL,分装样品,分别加入96孔预装板中,在不同的裂解结合液的体系下进行裂解消化。
步骤2、制备裂解结合液
常规方法制备裂解结合液,本发明的不同裂解结合液组分均采用市售原料,裂解结合液组分中包括:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL),Antifoam 204,异丙醇,盐酸胍,异硫氰酸胍,N-月桂酰肌氨酸钠(NLS),十二烷基磺酸钠(SDS),聚乙二醇(PEG),Triton X-100。不同组合的裂解结合液配比如下表1所示:
表1、不同组合的裂解结合液配比
序号 | Tris-HCL | Antifoam-204 | 异丙醇 | 盐酸胍 | 异硫氰酸胍 | NLS | SDS | PEG | Triton X-100 |
1 | 50mM | 0.05% | 40% | 4M | — | 2% | — | 10% | 5% |
2 | 50mM | 0.05% | 40% | — | 4M | 1% | — | — | — |
3 | 45mM | 0.1% | 40% | 4M | — | — | 0.5% | 12% | 3% |
4 | 45mM | 0.1% | 40% | — | 4M | 0.1% | — | 8% | — |
5 | 40mM | 0.075% | 35% | 4M | — | 1% | 0.5% | 10% | 4% |
6 | 40mM | 0.075% | 35% | — | 4M | 2% | 0.1% | — | 5% |
7 | 35mM | 0.1% | 30% | 4M | — | 0.5% | 0.1% | 10% | 2% |
8 | 35mM | 0.1% | 30% | — | 4M | 2% | — | 10% | 3% |
9 | 30mM | 0.05% | 30% | 4M | — | 3% | — | — | 5% |
10 | 30mM | 0.05% | 30% | — | 4M | 3% | 0.5% | 12% | — |
11 | 50mM | 0.1% | 30% | 3M | — | 2% | — | 10% | 5% |
12 | 50mM | 0.1% | 30% | — | 3M | 1% | — | — | 5% |
13 | 45mM | 0.05% | 30% | 3M | — | — | 0.5% | 12% | — |
14 | 45mM | 0.05% | 30% | — | 3M | 0.1% | 1% | 8% | 3% |
15 | 40mM | 0.05% | 30% | 3M | — | 1% | 0.5% | 10% | 3% |
16 | 40mM | 0.05% | 30% | — | 3M | 2% | — | — | 4% |
17 | 35mM | 0.075% | 35% | 3M | — | 0.1% | — | 8% | — |
18 | 35mM | 0.075% | 35% | — | 3M | 1% | 0.5% | 10% | — |
19 | 30mM | 0.1% | 40% | 3M | — | 2% | 0.1% | — | 5% |
20 | 30mM | 0.1% | 40% | — | 3M | — | — | 12% | 5% |
21 | 50mM | 0.075% | 40% | 2M | — | 3% | 1% | 8% | — |
22 | 50mM | 0.075% | 40% | — | 2M | 2% | — | 10% | — |
23 | 45mM | 0.05% | 40% | 2M | — | 0.05% | 0.1% | — | 3% |
24 | 45mM | 0.05% | 40% | — | 2M | 2% | 0.1% | 10% | 4% |
25 | 40mM | 0.1% | 35% | 2M | — | 2% | — | 10% | 3% |
26 | 40mM | 0.1% | 35% | — | 2M | 2% | — | — | 3% |
27 | 35mM | 0.75% | 35% | 2M | — | — | 0.5% | 12% | — |
28 | 35mM | 0.75% | 35% | — | 2M | 0.1% | 1% | 8% | — |
29 | 30mM | 0.05% | 30% | 2M | — | 1% | 0.5% | 10% | — |
30 | 30mM | 0.05% | 30% | — | 2M | 2% | 0.1% | — | 3% |
本申请所有实施例中使用的磁珠均为二氧化硅羧基磁珠,可通过一般商业渠道购买。
步骤3、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、450μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育6min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗60s,磁吸20s。洗液1由1M的盐酸胍、体积分数为0.5%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为70℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗60s,磁吸20s,静置晾干4min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱3min,磁吸30s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
然后将上述方法对新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,具体提取过程设置参考传统自动化程序,如下表2所示:
表2、不同组合裂解结合液核酸提取对比测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
步骤4、提取效果检测:
对上述30组自动化程序下提取的核酸浓度进行检测,分析不同裂解结合液配比提取效率,采用荧光定量PCR法进行结果分析,检测基因包括新冠1ab基因,新冠N基因,新冠E基因,以及人源内参基因Rnase P,结果如表3所示。
表3实施例1不同裂解结合液配比提取效率检测结果表
裂解结合液序号 | CT值 | CT值 | CT值 | 平均CT值 |
1 | 28.37 | 27.94 | 27.76 | 28.02 |
2 | 26.63 | 25.85 | 25.75 | 26.08 |
3 | 26.32 | 26.78 | 26.49 | 26.53 |
4 | 27.27 | 27.74 | 26.35 | 27.12 |
5 | 26.01 | 26.04 | 25.36 | 25.80 |
6 | 25.77 | 25.73 | 25.91 | 25.80 |
7 | 27.51 | 26.83 | 27.12 | 27.15 |
8 | 25.14 | 25.36 | 24.85 | 25.12 |
9 | 26.64 | 26.70 | 26.43 | 26.59 |
10 | 27.05 | 27.39 | 27.19 | 27.21 |
11 | 25.88 | 26.21 | 25.49 | 25.86 |
12 | 25.96 | 25.85 | 25.61 | 25.81 |
13 | 26.19 | 25.91 | 26.08 | 26.06 |
14 | 27.22 | 26.21 | 27.20 | 26.88 |
15 | 25.44 | 25.78 | 26.13 | 25.78 |
16 | 26.63 | 26.6 | 25.86 | 26.36 |
17 | 27.38 | 27.37 | 27.81 | 27.52 |
18 | 26.03 | 25.97 | 26.43 | 26.14 |
19 | 28.15 | 27.59 | 27.41 | 27.72 |
20 | 26.29 | 27.56 | 26.23 | 26.69 |
21 | 28.04 | 27.62 | 27.53 | 27.73 |
22 | 25.31 | 26.56 | 25.19 | 25.69 |
23 | 26.07 | 26.46 | 26.20 | 26.24 |
24 | 27.87 | 27.37 | 27.74 | 27.66 |
25 | 25.82 | 25.85 | 25.85 | 25.84 |
26 | 27.85 | 27.89 | 28.21 | 27.98 |
27 | 25.10 | 25.23 | 25.12 | 25.15 |
28 | 25.66 | 26.14 | 25.93 | 25.91 |
29 | 28.04 | 27.62 | 27.53 | 27.73 |
30 | 26.88 | 26.35 | 26.74 | 26.65 |
根据表3的数据结果分析可见,裂解结合液均可有效提取样品中的核酸,PCR效果良好。
实施例2:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号1组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2.5。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为0.65%的Triton X-100和60%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗30s,磁吸30s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,提取过程设置参考实施例1中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表4所示:
表4、实施例2中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例3:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号2组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2.5。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为0.65%的Triton X-100和60%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗30s,磁吸30s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例1中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表5所示:
表5、实施例3中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例4:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号3组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2.5。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为0.65%的Triton X-100和60%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗30s,磁吸30s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例1中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表6所示:
表6、实施例4中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例5:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号4组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2.5。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。洗液1由1M的盐酸胍、体积分数为0.5%的Triton X-100和40%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗30s,磁吸30s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例1中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表7所示:
表7、实施例5中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例6:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号5组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2.5。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。洗液1由1M的盐酸胍、体积分数为0.5%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗30s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗30s,磁吸30s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例1中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表8所示:
表8、实施例6中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例7:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号6组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、450μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。洗液1由0.6M的盐酸胍、体积分数为0.65%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸30s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例2中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表9所示:
表9、实施例7中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例8:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号7组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、450μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。洗液1由0.6M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸30s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例2中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表10所示:
表10、实施例8中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例9:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号8组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、450μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。洗液1由0.6M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸30s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例2中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表11所示:
表11、实施例9中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例10:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号9组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、450μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸30s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例2中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表12所示:
表12、实施例10中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例11:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号10组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为20mg/mL的50μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为20s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、450μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸20s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为70%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸30s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例2中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表13所示:
表13、实施例11中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例12:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号11组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为20mg/mL的50μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和60%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例6中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表14所示:
表14、实施例12中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例13:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号12组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为20mg/mL的50μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和60%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例6中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表15所示:
表15、实施例13中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例14:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号13组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为30mg/ml的25μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和60%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例6中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表16所示:
表16、实施例14中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例15:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号14组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为30mg/ml的25μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。洗液1由1.5M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和55%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例6中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表17所示:
表17、实施例15中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例16:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号15组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。洗液1由1.5M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和55%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗20s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗20s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例6中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表18所示:
表18、实施例16中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例17:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号16组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。洗液1由1.5M的盐酸胍、体积分数为0.8%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗12s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例11中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表19所示:
表19、实施例17中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例18:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号17组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。洗液1由1.5M的盐酸胍、体积分数为0.8%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗12s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例11中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表20所示:
表20、实施例18中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例19:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号18组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为20mg/mL的50μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗12s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例11中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表21所示:
表21、实施例19中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例20:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号19组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为20mg/mL的50μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗12s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例11中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表22所示:
表22、实施例20中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例21:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号20组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为15s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为0.8%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗12s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为85℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗12s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例11中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表23所示:
表23、实施例21中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例22:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号21组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为0.8%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为90℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗9s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例16中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表24所示:
表24、实施例22中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例23:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号22组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。洗液1由1.5M的盐酸胍、体积分数为0.65%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为90℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗9s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例16中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表25所示:
表25、实施例23中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例24:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号23组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为90℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗9s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例16中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表26所示:
表26、实施例24中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例25:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号24组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为90℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗9s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例16中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表27所示:
表27、实施例25中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例26:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号25组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2.5min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。洗液1由2M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗9s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为90℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗9s,磁吸20s,静置晾干2min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱2min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例16中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表28所示:
表28、实施例26中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例27:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号26组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为0.5%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为92℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗6s,磁吸20s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例21中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表29所示:
表29、实施例27中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例28:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号27组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为0.65%的Triton X-100和50%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为92℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗6s,磁吸20s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例21中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表30所示:
表30、实施例28中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例29:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号28组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、400μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55℃混合孵育3min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为0.8%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为92℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗6s,磁吸20s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例21中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表31所示:
表31、实施例29中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例30:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号29组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。洗液1由0.5M的盐酸胍、体积分数为0.8%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为92℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗6s,磁吸20s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例21中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表32所示:
表32、实施例30中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例31:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测,根据实施例1中裂解结合液序号30组分配比,进一步优化快速提取核酸运行程序步骤。
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2min,磁吸15s。此时,裂解结合液中异丙醇体积与总体积比为1:2。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。洗液1由0.6M的盐酸胍、体积分数为1%的Triton X-100和56%的乙醇组成。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为92℃。洗液2为80%的乙醇溶液。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗6s,磁吸20s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例21中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表33所示:
表33、实施例31中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
实施例2-31中新型冠状病毒假病毒自动化磁珠法核酸提取效率检测:N基因的检测(选用联合医学新型冠状病毒试剂盒进行核酸提取效率检测)RT-PCR体系如表34所示:
表34、实施例2-31中RT-PCR体系表
PCR反应液 | 18.3μL |
酶混合液 | 1.7μL |
模板 | 20μL |
总计 | 40μL |
反应程序如表35所示:
表35、实施例2-31中RT-PCR反应程序表
新型冠状病毒假病毒样品检测结果见下表36:
表36、实施例2-31中新型冠状病毒假病毒样品检测结果表
实施例 | CT值 | CT值 | CT值 | 平均CT值 |
2 | 27.12 | 26.05 | 26.99 | 26.72 |
3 | 24.85 | 25.91 | 25.24 | 25.33 |
4 | 26.43 | 26.05 | 26.66 | 26.38 |
5 | 27.19 | 26.72 | 27.3 | 27.07 |
6 | 25.49 | 25.61 | 26.03 | 25.71 |
7 | 25.61 | 26.62 | 25.83 | 26.02 |
8 | 26.08 | 27.38 | 25.98 | 26.48 |
9 | 27.23 | 26.68 | 26.56 | 26.82 |
10 | 26.13 | 27.87 | 25.78 | 26.59 |
11 | 25.86 | 26.92 | 26.48 | 26.42 |
12 | 27.81 | 27.83 | 27.45 | 27.69 |
13 | 26.43 | 25.93 | 26.05 | 26.14 |
14 | 27.41 | 26.26 | 27.65 | 27.11 |
15 | 26.23 | 27.17 | 27.12 | 26.84 |
16 | 27.53 | 25.25 | 27.67 | 26.82 |
17 | 25.19 | 26.67 | 26.12 | 25.99 |
18 | 26.29 | 27.22 | 26.35 | 26.62 |
19 | 27.74 | 27.62 | 27.515 | 27.63 |
20 | 25.85 | 25.83 | 25.85 | 25.84 |
21 | 28.21 | 27.87 | 27.95 | 28.01 |
22 | 25.12 | 25.65 | 25.19 | 25.32 |
23 | 25.93 | 25.90 | 26.25 | 26.03 |
24 | 27.53 | 27.83 | 27.65 | 27.67 |
25 | 26.74 | 26.65 | 26.54 | 26.64 |
26 | 27.76 | 28.15 | 27.98 | 27.96 |
27 | 26.39 | 26.12 | 26.75 | 26.42 |
28 | 27.11 | 26.98 | 27.71 | 27.27 |
29 | 25.89 | 26.53 | 25.21 | 25.88 |
30 | 27.51 | 27.85 | 26.79 | 27.38 |
31 | 26.79 | 27.02 | 25.95 | 26.59 |
实施例32:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测(与国内某厂家磁珠法核酸提取试剂进行性能比较),根据实施例16中裂解结合液、洗液1、洗液2等试剂组分进行自动化提取,运行程序步骤如下:
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2min,磁吸15s。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为92℃。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗6s,磁吸20s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例26中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表37所示:
表37、实施例32中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
3、N基因的检测(选用联合医学新型冠状病毒试剂盒进行核酸提取效率检测)
RT-PCR体系如表38所示:
表38、实施例32中RT-PCR体系表
PCR反应液 | 18.3μL |
酶混合液 | 1.7μL |
模板 | 20μL |
总计 | 40μL |
反应程序如表39所示:
表39、实施例32中RT-PCR反应程序表
如图1所示,与对照试剂盒相比,对照磁珠法核酸提取试剂盒提取时间为25min,本发明提取总过程时间为6.5min。本发明针对新型冠状病毒假病毒样品提取效率更高。
实施例33:新型冠状病毒假病毒样品快速自动化提取效率检测(与国内某厂家磁珠法核酸提取试剂进行性能比较),根据实施例31中裂解结合液、洗液1、洗液2等试剂组分进行自动化提取,运行程序步骤如下:
1、核酸的提取
1)磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好浓度为5mg/mL的200μL的磁珠进行吸附,磁吸时间为10s。
2)磁吸后将磁珠置于已预装好含有200μL样品、浓度为15mg/ml的50μL蛋白酶K、300μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,60℃混合孵育2min,磁吸15s。
3)磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。
4)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗6s,磁吸15s。此时,仪器程序开始启动6/12号孔位加热模式,加热温度设置为92℃。
5)磁吸后将磁珠置于已预装好含有700μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗6s,磁吸20s,静置晾干1.5min。
6)将磁珠置于已预装好含有50μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1min,磁吸20s。
7)将磁珠移至96孔深孔板1号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。将包含有洗脱的核酸溶液转移至新的离心管中,完成核酸提取。并于适当条件保存。
2、将上述新型冠状病毒假病毒样品进行自动化磁珠法核酸提取,各裂解结合液配比设置3次重复,运行程序设置参考实施例中自动化程序,进一步优化,运行程序步骤如下表40所示:
表40、实施例33中裂解结合液核酸提取测试自动化程序表
混合速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速;
磁吸速度*:1-3慢速,4-6中速,7-10快速。
3、N基因的检测(选用联合医学新型冠状病毒试剂盒进行核酸提取效率检测)
RT-PCR体系如表41所示:
表41、实施例33中RT-PCR体系表
PCR反应液 | 18.3μL |
酶混合液 | 1.7μL |
模板 | 20μL |
总计 | 40μL |
反应程序如表42所示:
表42、实施例33中RT-PCR反应程序表
如图2所示,与对照试剂盒相比,对照磁珠法核酸提取试剂盒提取时间为25min,本发明提取总过程时间为6.5min。此外,本发明针对新型冠状病毒假病毒样品提取效率更高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (30)
1.一种基于磁珠法的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述提取试剂盒包括如下试剂:裂解结合液、磁珠悬浮液、蛋白酶K、洗液1、洗液2、洗脱液。
2.如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述裂解结合液中包含:羟甲基氨基甲烷盐酸盐、Antifoam 204和异丙醇。
3.如权利要求2所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为30mM~60mM。
4.如权利要求2所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述Antifoam 204的体积分数为0.02%~0.1%。
5.如权利要求2所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述异丙醇的体积分数为30%~70%。
6.如权利要求2所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述裂解结合液中还含有以下至少一种成分:N-月桂酰肌氨酸钠、盐酸胍、异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠、聚乙二醇、Triton X-100。
7.如权利要求6所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述N-月桂酰肌氨酸钠的质量分数为0.05%~5%。
8.如权利要求6所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述盐酸胍的浓度为2~6M。
9.如权利要求6所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述异硫氰酸胍的浓度为2~6M。
10.如权利要求6所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述十二烷基磺酸钠的质量百分比为0.1%~5%。
11.如权利要求6所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述聚乙二醇的质量百分比为5%~15%。
12.如权利要求6所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述Triton X-100体的积分数为1%~5%。
13.如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述磁珠悬浮液的浓度为5~20mg/mL。
14.如权利要求13所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述磁珠悬浮液中的磁珠为羟基磁珠或羧基磁珠中的一种。
15.如权利要求14所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述磁珠的粒径为100~500nm。
16.如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述磁珠悬浮液与所述裂解结合液的体积混合比例为1:12~1:6。
17.如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述蛋白酶K溶液的浓度为15~100mg/mL。
18.如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述洗液1含有体积分数为40%~60%的乙醇溶液。
19.如权利要求18所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述洗液1中还含有浓度为0.5-4M的盐酸胍和/或体积分数为0.5%~1%的Triton X-100。
20.如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述洗液2为体积分数为50%~80%的乙醇溶液。
21.如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述洗脱液为纯水。
22.一种病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述提取试剂盒包括如下试剂:裂解结合液、磁珠悬浮液、蛋白酶K、洗液1、洗液2、洗脱液,其中所述解液结合液包含:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,Antifoam 204,异丙醇,N-月桂酰肌氨酸钠,异硫氰酸胍和Triton X-100,其中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH为8.0~8.5,浓度40mM;所述Antifoam 204的体积分数为0.05%,所述异丙醇的体积分数为30%,所述N-月桂酰肌氨酸钠的质量分数为2%,所述异硫氰酸胍的浓度为2-6M,所述Triton X-100的体积分数为4%,所述磁珠悬浮液中含有100~500nm的羟基磁珠或羧基磁珠,所述磁珠悬浮液的浓度为5-20mg/mL,所述磁珠悬浮液和所述裂解结合液的体积混合比例为1:11,所述蛋白酶K溶液的浓度为15~100mg/mL,所述洗液1含有体积分数为40%-60%的乙醇溶液,浓度为0.5~4M的盐酸胍和体积分数为0.5%~1%的Triton X-100,所述洗液2为体积分数为50%~80%的乙醇溶液,所述洗脱液为纯水。
23.一种改进的病毒核酸提取试剂盒,其特征在于,所述提取试剂盒包括如下试剂:裂解结合液、磁珠悬浮液、蛋白酶K、洗液1、洗液2、洗脱液,其中所述解液结合液包含:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,Antifoam 204,异丙醇,N-月桂酰肌氨酸钠,异硫氰酸胍,十二烷基磺酸钠和Triton X-100,其中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH为8.0~8.5,浓度30mM;所述Antifoam 204的体积分数为0.05%,所述异丙醇的体积分数为30%,所述N-月桂酰肌氨酸钠的质量分数为2%,所述异硫氰酸胍的浓度为2M,所述十二烷基磺酸钠的质量百分比为0.1%,所述Triton X-100的体积分数为3%,所述磁珠悬浮液中含有100~500nm的羟基磁珠或羧基磁珠,所述磁珠悬浮液的浓度为5-20mg/mL,所述磁珠悬浮液和所述裂解结合液的体积混合比例为1:11,所述蛋白酶K溶液的浓度为15-100mg/mL,所述洗液1含有体积分数为40%~60%的乙醇溶液,浓度为0.5~4M的盐酸胍和体积分数为0.5%~1%的Triton X-100,所述洗液2为体积分数为50%~80%的乙醇溶液,所述洗脱液为纯水。
24.采用权利要求1-23中任一项权利要求所述的病毒核酸提取试剂盒的自动化运行程序,其特征在于,所述自动化运行程序包括以下步骤:
步骤A1、磁棒将已经加入96孔深孔板2/8号孔已预装好50μL~200μL的磁珠悬浮液进行吸附,磁吸时间为6~40s;
步骤A2、磁吸后将磁珠置于已预装好含有150μL~300μL样品、20~50μL蛋白酶K、300~500μL裂解结合液的96孔深孔板1/7号孔位,55~60℃混合孵育,磁吸6~40s;
步骤A3、磁吸后将磁珠置于已预装好含有300μL~500μL洗液1的96孔深孔板3/9号孔位,震荡清洗5~80s,磁吸6~40s;
步骤A4、磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL~800μL洗液2的96孔深孔板4/10号孔位,震荡清洗5~80s,磁吸6~40s;同时仪器程序开始启动6号孔位加热模式,加热温度设置为60~92℃;
步骤A5、磁吸后将磁珠置于已预装好含有500μL~800μL洗液2的96孔深孔板5/11号孔位,震荡清洗5~80s,磁吸6~40s,静置晾干1~5min;
步骤A6、将磁珠置于已预装好含有50μL~100μL洗脱液的96孔深孔板6/12号孔位,震荡洗脱1~5min,磁吸6~40s;
步骤A7、将磁珠移至96孔深孔板1/7号孔位丢弃,完成核酸提取,程序结束。
25.如权利要求24所述的病毒核酸提取试剂盒的自动化运行程序,其特征在于,所述样品的加入量为100μL~300μL。
26.如权利要求25所述的病毒核酸提取试剂盒的自动化运行程序,其特征在于,所述样品的加入量为200μL。
27.如权利要求24所述的病毒核酸提取试剂盒的自动化运行程序,其特征在于,所述裂解结合液的孵育时间2min~8min。
28.如权利要求24所述的病毒核酸提取试剂盒的自动化运行程序,其特征在于,所述裂解结合液的孵育时间2min~4min。
29.如权利要求24所述的病毒核酸提取试剂盒的自动化运行程序,其特征在于,所述磁吸的时间为6~30s。
30.采用权利要求1-23中任一项权利要求所述的病毒核酸提取试剂盒的应用,在检测PCR、酶切、分子杂交、文库构建中的应用。
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