CN104560959A - 一种饱和氯化钠法快速批量提取血液dna的试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒和方法。该试剂盒包括红细胞裂解液、去蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液、洗脱液和蛋白酶K溶液；其中，所述红细胞裂解液包含8.29g/L的NH₄Cl，31g/L的KHCO₃和0.37g/L的Na₂EDTA，pH 7.2-7.4；所述去蛋白液为20％SDS；所述去蛋白沉淀液为饱和NaCl；所述调节结合液为异丙醇；所述洗脱液为70％乙醇；所述蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml。利用发明中的试剂盒提取血液DNA的方法，所提DNA含量高、纯度高，提取速度快，不采用有毒试剂，并对提取的基因组DNA进行PCR扩增检测，提取的血液DNA能够满足后续的很多分子生物学实验的要求。

Description

一种饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种饱和氯化钠法快速提取血液DNA的试剂盒，还涉及用此试剂盒从血液样品中提取DNA的方法。

背景技术

不同来源的材料因材料起始量、细胞结构及其成分的不同，所提取的基因组DNA有很大差异。因此，充足的材料起始量对提取足够用于后续实验的基因组DNA非常关键。很多动物学实验中，通过采集少量的动物血液就可以获得大量的基因组DNA，而且采集方式快速，从而进行很多的分子遗传育种研究。因此，血液样品的基因组DNA的有效提取成为实现上述领域的目标的关键性步骤。

目前，提取血液DNA基因组的方法各式各样，但是大部分需要频繁使用有毒试剂(如苯酚、氯仿、异戊醇)，而且容易带来安全问题。现在常用的基因组DNA分离纯化方法是SDS/苯酚/氯仿抽提法，该方法在提取各种材料的基因组DNA时具有一些本身的优点，但该方法存在提取少量血液样品时面临无法有效提取DNA、操作步骤非常繁琐等缺点。针对以上分离纯化技术的问题，现在分离纯化DNA大都采用离心柱法，即通过内嵌玻璃纤维素膜吸附从样品中裂解出的DNA，漂洗杂质后再将DNA洗脱下来。离心柱法虽然能够提取DNA并保证其纯度，但是其提取的DNA产量普遍不高，无法满足大批量动物分子遗传分析、法医检测、考古分析和医学检测等领域的要求。此外，离心柱法使用到一些有毒试剂，如苯酚、氯仿等，不利于实验人员的身体健康；同时，离心柱法在整个提取DNA的过程中耗时较多，影响了下一歩分析检测的速度。

作为相对安全且效果足够好的饱和氯化钠法提取血液基因组DNA的方法却没有专用试剂盒，于是我们基于饱和氯化钠法去除蛋白质从而快速提取血液DNA而发明了本试剂盒。

发明内容

为了使血液基因组DNA提取变得更简便、快捷，本发明提供一种饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒，以便于实验过程能够节省更多的时间和人力。本发明的另一个目的在于提供一种使用试剂盒从血液样品中大批量快速提取DNA的方法，该方法耗时短，不使用有毒试剂，所提DNA含量和纯度较高。

本发明中，饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒，包括红细胞裂解液、去蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液、洗脱液和蛋白酶K溶液；

其中，所述红细胞裂解液包含8.29g/L的NH₄Cl，31g/L的KHCO₃和0.37g/L的Na₂EDTA，pH 7.2-7.4；所述去蛋白液为10％SDS；所述去蛋白沉淀液为饱和NaCl；所述调节结合液为异丙醇；所述洗脱液为70％乙醇；所述蛋白酶K溶液浓度为20mg/l。

本发明所述红细胞裂解液主要用于裂解红细胞释放胞内物质；所述蛋白酶K和去蛋白液10％SDS主要作用是裂解细胞膜、核膜，使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液里面，10％SDS能有效的去除蛋白质，并且保证基因组DNA不会损失；所述蛋白沉淀液饱和NaCl主要用于沉淀和去除蛋白质组分；所述调节结合液异丙醇主要用于沉淀基因组DNA；所述洗脱液70％乙醇主要用于洗涤沉淀DNA并去除残留的一些其他杂质，从而纯化基因组DNA。使用时能有效减少操作时间，突出了更快更高效提取血液基因组DNA的的理念。

本发明还提供一种用所述试剂盒快速批量提取血液DNA的方法，包括以下步骤：

(1)裂解细胞：在血液样品中加入所述红细胞裂解液，所述蛋白酶K溶液，所述去蛋白液，充分混匀，放入水浴锅中56℃左右消化；

其中，优选的，所述血液样品与所述红细胞裂解液的体积比为1：40，所述红细胞裂解液、所述蛋白酶K溶液和所述去蛋白液的体积比为20-30：1-1.5：8-10。

(2)沉淀蛋白质：向已消化完成的血液样品中加入所述去蛋白沉淀液，震荡摇匀后，离心，留上清液；

(3)沉淀DNA：将所述上清液中加入所述调节结合液，摇匀离心，弃上清液留DNA沉淀；

(4)纯化DNA：将所述DNA沉淀用所述洗脱液洗涤，洗涤干净后，离心得DNA样品。作为优选的，所述DNA沉淀用所述洗脱液重复洗涤。

优选的，该提取方法提取的DNA风干，并用双蒸水或1×TE缓冲液溶解，于4℃、-20℃或-80℃冰箱保存备用。

优选的，本发明中离心条件为12000rpm，4℃离心10min。

本发明所述方法采用饱和氯化钠法，通过红细胞裂解液、蛋白酶K(20mg/ml)、去蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液和洗脱液从血液样品中快速提取基因组DNA。其中，SDS(十二烷基硫酸钠)是阴离子表面活性剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再加入饱和氯化钠溶剂，能使蛋白质变性并沉淀下来，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质，液相的分离变得十分快捷方便。去除蛋白质的上清液中加入异丙醇使得DNA沉淀，经过乙醇洗涤、纯化并沉淀DNA，沉淀的DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得到了DNA溶液，因此本方法通过简单的洗脱就可以得到所提DNA。

所述蛋白沉淀液为饱和NaCl，运用了高浓度盐使蛋白质变性并析出的原理，能很有效的去除蛋白质。

所述去蛋白液SDS，它是一种离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

DNA保存时，可以用100-200ul H₂O或者1×TE，1×TE相对更好一些，在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa＝7.2)和硼酸系统(pKa＝9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca²⁺产生Ca₃(PO₄)₂沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa＝8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是Tris-HCl，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，TE缓冲液中的EDTA更能螯合Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。

采用本发明所述从微量血液样品中提取基因组DNA的试剂盒及方法，所提DNA含量高、纯度高，操作方便，不需要很多帮助就能轻松完成，提取速度快，不采用有毒试剂，并且所用试剂价格普遍不高(如NaCl，乙醇等等)，容易获得，容易配制，并对提取的基因组DNA进行PCR扩增检测，提取的血液DNA能够满足后续的很多分子生物学实验的要求。本发明特殊之处在于使用氯化钠非常容易购买到，而且十分便宜，配制的饱和氯化钠溶液的方法也很简单，在50ml水中一直加入氯化钠直到氯化钠不再溶解即配制而成。

附图说明

图1是从鸡血液中利用饱和氯化钠法快速提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

其中，泳道M为DNA分子量Marker，从上至下依次为，100，250，500，750，1000，2000Marker；

泳道1-6为本发明利用饱和氯化钠试剂盒从鸡血液中提取的基因组DNA条带。

图2是从林麝血液中利用饱和氯化钠法快速提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

其中，泳道M为DNA分子量Marker，从上至下依次为，100，250，500，750，1000，2000Marker；

泳道1-6为本发明利用饱和氯化钠试剂盒从林麝血液中提取的基因组DNA条带。

图3是从鸡动物血液中提取的基因组DNA用于扩增鸡线粒体控制区(D-loop，816bp)序列的琼脂糖凝胶电泳图；

其中，泳道M为DNA分子量Marker，从上至下依次为100，250，500，750，1000，2000Marker；

泳道1-6为本发明利用饱和氯化钠法从鸡血液中提取的基因组DNA经过PCR扩增得到的鸡线粒体控制区(D-loop，816bp)条带。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

此发明专利所述从血液中快速提取基因组DNA的试剂盒中包含红细胞裂解液、去蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液、洗脱液和20mg/ml蛋白酶K溶液。

红细胞裂解液包含NH₄Cl,KHCO₃和Na₂EDTA，pH 7.2-7.4；具体配制方法：NH₄Cl 8.29g,KHCO₃31g。Na₂EDTA 37.2mg溶于1000mL蒸馏水，加HCl调PH至7.2-7.4，高温高压灭菌待用。

去蛋白液为10％SDS(10％十二烷基磺酸钠)；具体配制方法：称取SDS 2g，加超纯水20ml，加热至68℃助溶，加几滴HCl调PH至7.2，高温高压灭菌待用。

去蛋白沉淀液为饱和NaCl；具体配制方法：100ml水中一直加入NaCl，直到NaCl无法再溶解即为饱和NaCl溶液。

调节结合液为异丙醇。

洗脱液为70％乙醇；具体配制方法：无水乙醇70ml，定容到100ml，充分混匀。

蛋白酶K(20mg/ml)：在50ml灭菌超纯水水中加入1g蛋白酶k分装成小份储存于-20℃备用。

实施例2：从鸡血液中快速提取基因组DNA

利用实施例1所述试剂盒从鸡血中快速提取基因组DNA。

1、提取试剂

红细胞裂解液：包含NH₄Cl,KHCO₃和Na₂EDTA，pH 7.2-7.4；

去蛋白液：为10％SDS；

蛋白沉淀液：为饱和NaCl；

调节结合液：为异丙醇；洗脱液：为70％乙醇；

蛋白酶K：浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

2、提取方法

(1)用移液枪吸取10ul鸡血样置于1.5ml EP管中；

(2)加入400ul红细胞裂解液，20ul蛋白酶K(20mg/ml)，25ul去蛋白液10％SDS，漩涡震荡充分混匀。

(3)将EP管放入水浴锅中56℃左右消化3到6小时(可视情况增加消化时间甚至过夜消化，尽量将样品消化完全)。

(4)取出已消化完成的血液样品，加入160ul蛋白沉淀液饱和氯化钠，漩涡震荡1min，轻摇10min，12000rpm，4℃低温离心10min，离心后将上清液转移至新的2.0ml EP管中。

(5)加入两倍体积的调节结合液异丙醇，充分摇匀3min，12000rpm 4℃离心10min。离心完成后倒掉上清液。

(6)向弃掉上清液之后的2.0ml EP管中加入已预冷的洗脱液70％乙醇1ml，轻轻摇匀5min，12000rpm 4℃离心10min，离心完成后弃上清液。重复一次本步骤(6)。

(7)将上述洗脱过两次的2.0ml EP管倒置风干5min，在上述晾干的2.0mlEP管中加入100ul水或者100ul 1xTE(可据提取DNA的量适当增加)，溶解DNA，溶解的DNA可于4℃、-20℃或-80℃冰箱保存备用。

实施例3：从林麝血液中快速提取基因组DNA

利用实施例1所述试剂盒从林麝血液中快速提取基因组DNA。

1、提取试剂

红细胞裂解液：包含NH₄Cl,KHCO₃和Na₂EDTA，pH 7.2-7.4；

去蛋白液：为10％SDS；

蛋白沉淀液：为饱和NaCl；

调节结合液：为异丙醇；洗脱液：为70％乙醇；

蛋白酶K：浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

2、提取方法

(1)用移液枪吸取10ul林麝血样置于1.5ml EP管中；

(2)加入400ul红细胞裂解液，20ul蛋白酶K(20mg/ml)，25ul去蛋白液10％SDS，漩涡震荡充分混匀。

(3)将EP管放入水浴锅中56℃左右消化3到6小时(可视情况增加消化时间甚至过夜消化，尽量将样品消化完全)。

(4)取出已消化完成的血液样品，加入160ul蛋白沉淀液饱和氯化钠，漩涡震荡1min，轻摇10min，12000rpm，4℃低温离心10min，离心后将上清液转移至新的2.0ml EP管中。

(5)加入两倍体积的调节结合液异丙醇，充分摇匀3min，12000rpm 4℃离心10min。离心完成后倒掉上清液。

(6)向弃掉上清液之后的2.0ml EP管中加入已预冷的洗脱液70％乙醇1ml，轻轻摇匀5min，12000rpm 4℃离心10min，离心完成后弃上清液。重复一次本步骤(6)。

(7)将上述洗脱过两次的2.0ml EP管倒置风干5min，在上述晾干的2.0mlEP管中加入100ul水或者100ul 1xTE(可据提取DNA的量适当增加)，溶解DNA，溶解的DNA可于4℃、-20℃或-80℃冰箱保存备用。

3、所提DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

取上述提取的基因组DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为2.5ul，电压为180V，电泳时间为15min，结果见图1(鸡血液DNA提取结果)和图2(林麝血液DNA提取结果)。结果显示，本发明方法所提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度充分，表明本发明方法提取的血液DNA含量和纯度较高。

4、所提DNA的PCR检测

根据鸡的线粒体控制区(D-loop)引物R：CCAGGACACACTCATTCACCC，F：GTTTGAGGGATTTTATGCGGTAG，对所提取的6个血液基因组DNA样本进行PCR扩增检测。

扩增体系为：2×Master mix 25ul(含Mg²⁺，dNTP，Tag DNA Polymerase)，R和F引物各2.5ul，基因组DNA 2.5ul，H₂O 17.5ul，DNA样2.5ul，共计50ul；

PCR扩增条件为：

反应后贮存在4℃下保存至少半小时，以免DNA降解。扩增得到的目的片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为2.5ul，电压为180V，电泳时间为15min，结果参见图3。结果显示，本发明方法所提取的DNA的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示出单一的目的条带，没有出现杂带，并且条带亮度充分，表明本发明方法提取的血液DNA能够满足后续的很多分子生物学实验的要求。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒，其特征在于，包括红细胞裂解液、去蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液、洗脱液和蛋白酶K溶液；

其中，所述红细胞裂解液包含8.29g/L的NH₄Cl，31g/L的KHCO₃和0.37g/L的Na₂EDTA，pH 7.2-7.4；；所述去蛋白液为10％SDS；所述去蛋白沉淀液为饱和NaCl；所述调节结合液为异丙醇；所述洗脱液为70％乙醇；所述蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml。

2.一种用权利要求1所述试剂盒快速批量提取血液DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)裂解细胞：在血液样品中加入所述红细胞裂解液，所述蛋白酶K溶液，所述去蛋白液，充分混匀，放入水浴锅中56℃左右消化；

(2)沉淀蛋白质：向已消化完成的血液样品中加入所述去蛋白沉淀液，震荡摇匀后，离心，留上清液；

(3)沉淀DNA：将所述上清液中加入所述调节结合液，摇匀离心，弃上清液留DNA沉淀；

(4)纯化DNA：将所述DNA沉淀用所述洗脱液洗涤，洗涤干净后，离心得DNA样品。

3.根据权利要求2所述的用所述试剂盒快速批量提取血液DNA的方法，其特征在于，将提取的DNA风干，并用双蒸水或1×TE缓冲液溶解，于4℃、-20℃或-80℃冰箱保存备用。

4.根据权利要求2所述的用所述试剂盒快速批量提取血液DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述血液样品与所述红细胞裂解液的体积比为1：40，所述红细胞裂解液、所述蛋白酶K溶液和所述去蛋白液的体积比为20-30：1-1.5：8-10。

5.根据权利要求2所述的用所述试剂盒快速批量提取血液DNA的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述DNA沉淀用所述洗脱液重复洗涤。

6.根据权利要求2所述的用所述试剂盒快速批量提取血液DNA的方法，其特征在于，所述离心条件为12000rpm，4℃离心。