CN112410325A - 一种新型冠状病毒基因组rna的提取与试剂匹配方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒基因组RNA的提取方法，具体包括如下步骤：步骤1：相关基本操作，步骤2：收集相关病毒溶液，步骤3：初步离心操作，步骤4：二次离心操作，步骤5：基本溶解操作，步骤6：相关干燥操作，步骤7：产品获取和保存，本发明涉及病毒技术领域。该新型冠状病毒基因组RNA的提取与试剂匹配方法，通过步骤3和步骤4的联合设置，相关病毒溶液在被初步离心操作后，加入裂解液后被重新离心操作，大大提升了病毒外壳和RNA的裂解程度，并且在后期操作中加入了足量蛋白酶K，进一步将相关病毒外壳进行分解，方便工作人员在整体操作后期获得足量病毒RNA，整体实验逻辑清晰，方便观察和操作。
Description
技术领域
本发明涉及病毒技术领域，具体为一种新型冠状病毒基因组RNA的提取 与试剂匹配方法。
背景技术
病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸，必须在活细胞内寄生 并以复制方式增殖的非细胞型生物。病毒是一种非细胞生命形态，它由一个 核酸长链和蛋白质外壳构成，病毒没有自己的代谢机构，没有酶系统。因此 病毒离开了宿主细胞，就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化 学物质。它的复制、转录、和转译的能力都是在宿主细胞中进行，当它进入 宿主细胞后，它就可以利用细胞中的物质和能量完成生命活动，按照它自己 的核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。
对病毒进行全面研究时，必须精准获得相关病毒的RNA，传统的病毒RNA 提取方法十分复杂，耗时较长，在提取过程中需要使用有机有毒溶剂，气味 难闻，操作要求较高，严重提取进程。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型冠状病毒基因组RNA的提 取与试剂匹配方法，解决了病毒RNA提取方法十分复杂，耗时较长，在提取 过程中需要使用有机有毒溶剂，气味难闻，操作要求较高，严重提取进程的 问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种新型冠状病毒 基因组RNA的提取方法，具体包括如下步骤：
步骤1：相关基本操作：对相关参与工作的设备进行功能检测，然后通电 进入待机状态，对参与操作的相关试剂和原材料进行判断，保留完全合格的 操作原料；
步骤2：收集相关病毒溶液：将含有病毒的原液置于36-38摄氏度培养箱 中培养，然后将培养液倒入液体培养基，摇晃培养10-12小时后备用；
步骤3：初步离心操作：取1毫升样本离心，采用12000转/每分钟，离 心操作5分钟，抛弃上清液；
步骤4：二次离心操作：加入1毫升裂解缓冲液，采用12000转/每分钟， 离心操作8分钟，再次离心，抛弃上清液，加入裂解液进行溶解沉淀，70摄 氏度时放置5分钟，冷却至55摄氏度时加入足量蛋白酶K，对溶液保温1小 时，然后升高温度至90摄氏度，对蛋白酶K进行杀灭；
步骤5：基本溶解操作：加入足量的异丙醇，反复混合后，将温度降低至 65摄氏度时，静止15分钟，然后补充适量裂解缓冲液，然后冰溶3分钟；
步骤6：相关干燥操作：对上述溶液进行12000转/每分钟，离心操作5 分钟，抛弃上清液，加入5毫升乙醇，上下颠倒5次，充分混合后，再进行 离心操作3分钟，抛弃上清液后，将沉淀吹干；
步骤7：产品获取和保存：然后加入50微升纯水，溶液加热至65摄氏度 即可使用，当长期不用时，应当置于-20摄氏度时冷冻保存。
优选的，所述步骤2中，培养箱应当放置在无菌环境中操作。
优选的，所述步骤4中，裂解缓冲液由蔗糖溶液、Tris-HCl溶液、MgCl2溶液和Triton-X-100组成。
优选的，所述步骤4中，蛋白酶K由双蒸水配置。
优选的，所述步骤6中，吹干沉淀时首先开启大风量快吹，然后小风量 转动吹干。
优选的，所述步骤6中，吹干沉淀时需要在通风环境操作。
本发明同时公开了一种新型冠状病毒基因组RNA的试剂匹配方法，具体 包括如下步骤：
步骤1：试剂的基本选择：选取能够溶解冠状病毒基因组RNA的试剂，将 试剂全面排序，并且对试剂的适用环境进行标注；
步骤2：试剂的全面检测：抽取适量的试剂，然后抽取对应体积的病毒 RNA溶液，将其混合后观察反应速度，然后对速度值进行记录；
步骤3：重复检测：更换反应顺序，对试剂的反应速度进行二次记录；
步骤4：合理选择：将反应效果最佳的试剂以及试剂组合抽取后单独标记， 以备后续使用。
优选的，所述步骤1中，全部操作必须在无菌环境中操作。
(三)有益效果
本发明提供了一种新型冠状病毒基因组RNA的提取与试剂匹配方法。与 现有技术相比，具备以下有益效果：
(1)、该新型冠状病毒基因组RNA的提取与试剂匹配方法，通过步骤3： 初步离心操作：取1毫升样本离心，采用12000转/每分钟，离心操作5分钟， 抛弃上清液；步骤4：二次离心操作：加入1毫升裂解缓冲液，采用12000转 /每分钟，离心操作8分钟，再次离心，抛弃上清液，加入裂解液进行溶解沉 淀，70摄氏度时放置5分钟，冷却至55摄氏度时加入足量蛋白酶K，对溶液 保温1小时，然后升高温度至90摄氏度，对蛋白酶K进行杀灭，通过步骤3 和步骤4的联合设置，相关病毒溶液在被初步离心操作后，加入裂解液后被 重新离心操作，大大提升了病毒外壳和RNA的裂解程度，并且在后期操作中 加入了足量蛋白酶K，进一步将相关病毒外壳进行分解，方便工作人员在整体 操作后期获得足量病毒RNA，整体实验逻辑清晰，方便观察和操作。
(2)、该新型冠状病毒基因组RNA的提取与试剂匹配方法，通过步骤5： 基本溶解操作：加入足量的异丙醇，反复混合后，将温度降低至65摄氏度时， 静止15分钟，然后补充适量裂解缓冲液，然后冰溶3分钟；步骤6：相关干 燥操作：对上述溶液进行12000转/每分钟，离心操作5分钟，抛弃上清液， 加入5毫升乙醇，上下颠倒5次，充分混合后，再进行离心操作3分钟，抛 弃上清液后，将沉淀吹干，通过步骤5和步骤6的联合设置，加入异丙醇后 对溶液及时混合，能够大大缩短相关溶液的混合时间的，通过在静止时补充 裂解缓冲液，能够进一步提升病毒RNA的获得量，加入乙醇后离心吹干，能 够较为精准的获得病毒RNA，避免RNA被过度分解。
(3)、该新型冠状病毒基因组RNA的提取与试剂匹配方法，通过步骤2： 收集相关病毒溶液：将含有病毒的原液置于36-38摄氏度培养箱中培养，然 后将培养液倒入液体培养基，摇晃培养10-12小时后备用，步骤7：产品获取 和保存：然后加入50微升纯水，溶液加热至65摄氏度即可使用，当长期不 用时，应当置于-20摄氏度时冷冻保存，通过步骤2和步骤7的联合设置，对 病毒溶液进行培养，能够一次性获取大量病毒RNA，能够方便后续快速提取， 对病毒溶液进行冷冻保存，能够方便后期长期稳定使用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附表，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅表1，本发明实施例提供一种技术方案：一种新型冠状病毒基因组 RNA的提取与试剂匹配方法，具体包括以下实施例：
实施例1
步骤1：相关基本操作：对相关参与工作的设备进行功能检测，然后通电 进入待机状态，对参与操作的相关试剂和原材料进行判断，保留完全合格的 操作原料；
步骤2：收集相关病毒溶液：将含有病毒的原液置于36摄氏度培养箱中 培养，然后将培养液倒入液体培养基，摇晃培养10小时后备用；
步骤3：初步离心操作：取1毫升样本离心，采用12000转/每分钟，离 心操作5分钟，抛弃上清液；
步骤4：二次离心操作：加入1毫升裂解缓冲液，采用12000转/每分钟， 离心操作8分钟，再次离心，抛弃上清液，加入裂解液进行溶解沉淀，70摄 氏度时放置5分钟，冷却至55摄氏度时加入足量蛋白酶K，对溶液保温1小 时，然后升高温度至90摄氏度，对蛋白酶K进行杀灭；
步骤5：基本溶解操作：加入足量的异丙醇，反复混合后，将温度降低至 65摄氏度时，静止15分钟，然后补充适量裂解缓冲液，然后冰溶3分钟；
步骤6：相关干燥操作：对上述溶液进行12000转/每分钟，离心操作5 分钟，抛弃上清液，加入5毫升乙醇，上下颠倒5次，充分混合后，再进行 离心操作3分钟，抛弃上清液后，将沉淀吹干；
步骤7：产品获取和保存：然后加入50微升纯水，溶液加热至65摄氏度 即可使用，当长期不用时，应当置于-20摄氏度时冷冻保存。
实施例2
步骤1：相关基本操作：对相关参与工作的设备进行功能检测，然后通电 进入待机状态，对参与操作的相关试剂和原材料进行判断，保留完全合格的 操作原料；
步骤2：收集相关病毒溶液：将含有病毒的原液置于37摄氏度培养箱中 培养，然后将培养液倒入液体培养基，摇晃培养11小时后备用；
步骤3：初步离心操作：取1毫升样本离心，采用12000转/每分钟，离 心操作5分钟，抛弃上清液；
步骤4：二次离心操作：加入1毫升裂解缓冲液，采用12000转/每分钟， 离心操作8分钟，再次离心，抛弃上清液，加入裂解液进行溶解沉淀，70摄 氏度时放置5分钟，冷却至55摄氏度时加入足量蛋白酶K，对溶液保温1小 时，然后升高温度至90摄氏度，对蛋白酶K进行杀灭；
步骤5：基本溶解操作：加入足量的异丙醇，反复混合后，将温度降低至 65摄氏度时，静止15分钟，然后补充适量裂解缓冲液，然后冰溶3分钟；
步骤6：相关干燥操作：对上述溶液进行12000转/每分钟，离心操作5 分钟，抛弃上清液，加入5毫升乙醇，上下颠倒5次，充分混合后，再进行 离心操作3分钟，抛弃上清液后，将沉淀吹干；
步骤7：产品获取和保存：然后加入50微升纯水，溶液加热至65摄氏度 即可使用，当长期不用时，应当置于-20摄氏度时冷冻保存。
实施例3
步骤1：相关基本操作：对相关参与工作的设备进行功能检测，然后通电 进入待机状态，对参与操作的相关试剂和原材料进行判断，保留完全合格的 操作原料；
步骤2：收集相关病毒溶液：将含有病毒的原液置于38摄氏度培养箱中 培养，然后将培养液倒入液体培养基，摇晃培养12小时后备用；
步骤3：初步离心操作：取1毫升样本离心，采用12000转/每分钟，离 心操作5分钟，抛弃上清液；
步骤4：二次离心操作：加入1毫升裂解缓冲液，采用12000转/每分钟， 离心操作8分钟，再次离心，抛弃上清液，加入裂解液进行溶解沉淀，70摄 氏度时放置5分钟，冷却至55摄氏度时加入足量蛋白酶K，对溶液保温1小 时，然后升高温度至90摄氏度，对蛋白酶K进行杀灭；
步骤5：基本溶解操作：加入足量的异丙醇，反复混合后，将温度降低至 65摄氏度时，静止15分钟，然后补充适量裂解缓冲液，然后冰溶3分钟；
步骤6：相关干燥操作：对上述溶液进行12000转/每分钟，离心操作5 分钟，抛弃上清液，加入5毫升乙醇，上下颠倒5次，充分混合后，再进行 离心操作3分钟，抛弃上清液后，将沉淀吹干；
步骤7：产品获取和保存：然后加入50微升纯水，溶液加热至65摄氏度 即可使用，当长期不用时，应当置于-20摄氏度时冷冻保存。
步骤2中，培养箱应当放置在无菌环境中操作。步骤4中，裂解缓冲液 由蔗糖溶液、Tris-HCl溶液、MgCl2溶液和Triton-X-100组成。步骤4中， 蛋白酶K由双蒸水配置。步骤6中，吹干沉淀时首先开启大风量快吹，然后 小风量转动吹干。步骤6中，吹干沉淀时需要在通风环境操作。
本发明同时公开了一种新型冠状病毒基因组RNA的试剂匹配方法，其特 征在于：具体包括如下步骤：
步骤1：试剂的基本选择：选取能够溶解冠状病毒基因组RNA的试剂，将 试剂全面排序，并且对试剂的适用环境进行标注；
步骤2：试剂的全面检测：抽取适量的试剂，然后抽取对应体积的病毒 RNA溶液，将其混合后观察反应速度，然后对速度值进行记录；
步骤3：重复检测：更换反应顺序，对试剂的反应速度进行二次记录；
步骤4：合理选择：将反应效果最佳的试剂以及试剂组合抽取后单独标记， 以备后续使用。
步骤1中，全部操作必须在无菌环境中操作。
通过步骤3和步骤4的联合设置，相关病毒溶液在被初步离心操作后， 加入裂解液后被重新离心操作，大大提升了病毒外壳和RNA的裂解程度，并 且在后期操作中加入了足量蛋白酶K，进一步将相关病毒外壳进行分解，方便 工作人员在整体操作后期获得足量病毒RNA，整体实验逻辑清晰，方便观察和 操作。
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有 技术。
对比实验
现有生产厂家根据权利要求1，可以提取出三种病毒RNA，对三种三种病 毒RNA进行处理后，将三种病毒RNA与普通病毒RNA的进行提取时间和提取 准确率对比实验，由表1知，经过实验室测试三个实施例中，提取时间最长 的是4.6小时，较对比例缩短0.4小时，实施例中提取准确率最低的是89％， 较对比例提高7％。
表1：提取时间和提取准确率与对比例对比表
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来 将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示 这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系 列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明 确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有 的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。
Claims (8)
1.一种新型冠状病毒基因组RNA的提取方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤1：相关基本操作：对相关参与工作的设备进行功能检测，然后通电进入待机状态，对参与操作的相关试剂和原材料进行判断，保留完全合格的操作原料；
步骤2：收集相关病毒溶液：将含有病毒的原液置于36-38摄氏度培养箱中培养，然后将培养液倒入液体培养基，摇晃培养10-12小时后备用；
步骤3：初步离心操作：取1毫升样本离心，采用12000转/每分钟，离心操作5分钟，抛弃上清液；
步骤4：二次离心操作：加入1毫升裂解缓冲液，采用12000转/每分钟，离心操作8分钟，再次离心，抛弃上清液，加入裂解液进行溶解沉淀，70摄氏度时放置5分钟，冷却至55摄氏度时加入足量蛋白酶K，对溶液保温1小时，然后升高温度至90摄氏度，对蛋白酶K进行杀灭；
步骤5：基本溶解操作：加入足量的异丙醇，反复混合后，将温度降低至65摄氏度时，静止15分钟，然后补充适量裂解缓冲液，然后冰溶3分钟；
步骤6：相关干燥操作：对上述溶液进行12000转/每分钟，离心操作5分钟，抛弃上清液，加入5毫升乙醇，上下颠倒5次，充分混合后，再进行离心操作3分钟，抛弃上清液后，将沉淀吹干；
步骤7：产品获取和保存：然后加入50微升纯水，溶液加热至65摄氏度即可使用，当长期不用时，应当置于-20摄氏度时冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒基因组RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤2中，培养箱应当放置在无菌环境中操作。
3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒基因组RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤4中，裂解缓冲液由蔗糖溶液、Tris-HCl溶液、MgCl2溶液和Triton-X-100组成。
4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒基因组RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤4中，蛋白酶K由双蒸水配置。
5.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒基因组RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤6中，吹干沉淀时首先开启大风量快吹，然后小风量转动吹干。
6.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒基因组RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤6中，吹干沉淀时需要在通风环境操作。
7.一种新型冠状病毒基因组RNA的试剂匹配方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤1：试剂的基本选择：选取能够溶解冠状病毒基因组RNA的试剂，将试剂全面排序，并且对试剂的适用环境进行标注；
步骤2：试剂的全面检测：抽取适量的试剂，然后抽取对应体积的病毒RNA溶液，将其混合后观察反应速度，然后对速度值进行记录；
步骤3：重复检测：更换反应顺序，对试剂的反应速度进行二次记录；
步骤4：合理选择：将反应效果最佳的试剂以及试剂组合抽取后单独标记，以备后续使用。
8.根据权利要求7所述的一种新型冠状病毒基因组RNA的试剂匹配方法，其特征在于：所述步骤1中，全部操作必须在无菌环境中操作。
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- 2020-11-17 CN CN202011284800.2A patent/CN112410325A/zh active Pending
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