CN103774241A

CN103774241A - 一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法

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Publication number: CN103774241A
Application number: CN201210395295.8A
Authority: CN
Inventors: 史军伟; 张婷婷; 董五辈
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-10-18
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2032-10-18
Also published as: CN103774241B

Abstract

本发明公开了一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法，以基因组规模的cDNA作为Bait筛选同样是基因组规模的cDNA Library。在本技术实施过程中采取对cDNA文库进行均一化处理的方法来降低高丰富度互作蛋白对低丰富度互作蛋白的掩盖作用，提高了筛选的效率；利用酵母URA3基因的特性自动的去除baitc DNA中具有自激活作用的序列。本发明建立了一种可行性高，成本低廉，实验条件要求低，工作量较小的利用文库对文库的酵母双杂交技术大规模筛选互作蛋白质的方法，并成功的应用于了病原物-寄主植物互作蛋白质的筛选。

Description

一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体涉及一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法。该方法不同于以往的高通量筛选蛋白质-蛋白质互作的酵母双杂交方法，本发明采用文库对文库的筛选方法，在克服前者的缺点的基础上能够方便简捷的用于分子生物学相关的领域内不同物种和不同物种间蛋白质-蛋白质相互作用研究。

背景技术

蛋白质是基因功能的执行者，其功能的发挥不是孤立的，是在纵横交错的网络中通过与其它分子相互作用完成的。而蛋白质-蛋白质之间的互作就是其中一种重要的形式。目前蛋白质相互作用网络构建的主要策略有两种：一种是以蛋白质复合体为出发点，即大规模的质谱分析。另一种是通过酵母双杂交系统，后者是目前基因组范围内蛋白质间相互作用网络构建研究方面应用较为广泛的策略。

酵母双杂交技术是由Fields S.等人于1989年首次建立。该技术的基本原理是基于对真核生物转录激活因子（如GAL4、GCN4）结构的认识。转录因子通常包含两个模块式结构域：一个是DNA结合结构域（DNA binding domain,BD），负责结合于DNA序列的特定位点（上游激活序列，up stream activating sequence，UAS）上；一个是激活结构域（acti vation domain,AD）协助RNA聚合酶激活其下游基因的转录，只有两者空间上接近共同作用时才能激活报告基因。利用此特性，分别使BD和AD与“诱饵”蛋白（X）和“猎物”蛋白（Y）形成融合蛋白，如果两种蛋白X和Y可以发生相互作用，就能使BD和AD空间上相互接近从而激活报告基因的转录。

目前，不同的大规模酵母双杂交技术已应用于了从病毒到人类等多种生物的蛋白质相互作用研究，但从大规模酵母双杂交筛选方式来看，却可以归纳为以下两种主要的方式：

（1）文库筛选法：一般用相对较少的已知或未知诱饵去筛选相对较大猎物库，也可以在诱饵筛选出阳性猎物后，再以猎物为诱饵筛库，如此循环，最后构建成一个互作的网络。诱饵可以一个或数个至数千个，可以是ORF、全长cDNA或它们的片段(含结构域)，但一次杂交只能使用一个诱饵筛选，数千个诱饵必须重复数千次杂交；猎物库一般很大，可以是众多ORF集合成的库，也可以是全长cDNA库或cDNA片段库。文库筛选法优点是可以得到相互作用的结构域信息和降低假阴性率。

（2）阵列筛选法：所有含不同AD-Y的菌株单个（一对一阵列法）或混合成集合（高通量阵列法）与排成阵列所有含不同BD-X的菌株一一对应筛选。采用一对一阵列法的好处是阳性克隆可从阵列位置推出序列信息而不需测序，可以自动化；高通量阵列法虽然需测序鉴定阳性克隆，但是相对于一对一阵列法具有通量性高的优点。

虽然运用以上两种大规模酵母双杂交技术已经获得了部分模式生物如T7噬菌体、幽门螺旋杆菌、酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇、拟南芥的全部或部分的蛋白质互作图谱，但是这两种方法有一个共同的缺点，那就是工作量大，成本高，实验硬件条件要求高。比如2011年来自北卡罗来纳大学的Jeffery L.Dangl教授领导由20多个国立和国际实验室组成的“拟南芥蛋白互作组图谱联盟”历时4年耗资800万美元首次获得模式植物拟南芥的部分蛋白相互作用图谱。该实验中研究人员分析获得了拟南芥上万个开放阅读框（ORF），然后利用一对一阵列筛选的方法对这些ORF进行检测，结果在40万次蛋白分析实验中，共发现了6250个蛋白互作样本，其中有2774种蛋白参与，但是这些蛋白互作样本在拟南芥完整蛋白作用谱中仅占大约2%，这主要是因为由于分析的上万个开放阅读框（ORF）仅覆盖拟南芥完整蛋白的三分之一。

综上所述，现有的高通量的酵母双杂交技术并不适合于一般的实验室进行大规模的蛋白质-蛋白质互作的筛选，因此亟需探索一种操作简捷、工作量小、成本较低、硬件条件要求较低的新的高通量的酵母双杂交方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法，该方法成本较为低廉、对实验条件要求较低，是一种适合规模化蛋白质相互作用发掘的方法。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

（1）均一化（特定组织或细胞的所有表达基因其拷贝数和表达量是不一样的，经过均一化这一步骤的处理使所有表达基因的含量大致相等）“诱饵”cDNA文库和“猎物”cDNA文库的构建：提取实验对象组织总RNA，纯化获得mRAA，分别以GBK-SMART Ⅲ和GBK-CDS Ⅲ（“诱饵”cDNA第一链），SMART Ⅲ和CDS Ⅲ（“猎物”cDNA第一链）为引物进行RT-PCR反应，对生成的第一链cDNA再分别以BD 5’PCR primer和BD 3’PC R primer（“诱饵”cDNA文库），AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer（“猎物”cDNA文库）为引物通过LD-PCR反应进行扩增获得未均一化的双链cDNA文库，然后按照DSN法（双链特异性核酸酶Duplex-specific nuclease）对上述两个cDNA文库进行均一化处理并以BD 5’PCR primer和BD 3’PCR primer，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer对相应的文库进行扩增，获得足够量的均一化的“诱饵”cDNA文库和“猎物”cDNA文库。

（2）大规模转化“诱饵”cDNA文库、“猎物”cDNA文库：将上述构建好的“诱饵”cDNA文库按照Clontech公司Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒操作说明与线性化的质粒pGBKT7共转化酵母菌株MaV203，“猎物”cDNA文库与线性化的质粒pGADT7共转化酵母菌株Y187，获得转化入酵母菌株中的“诱饵”cDNA文库和“猎物”cDNA文库。

（3）含有cDNA文库的酵母菌株的收集及“诱饵”cDNA文库中自激活序列的去除：将构建有“猎物”cDNA文库的Y187菌株涂布SD/-Leu酵母平板培养基，将构建有“诱饵”cDNA文库的酵母MaV203涂布含0.2﹪5-FOA的SD/-Trp酵母平板培养基，30℃放置3～5天，冲洗收集生长的克隆，即获得构建进酵母菌株Y187中的“猎物”cDNA文库和去除自激活序列的酵母菌株MaV203中的“诱饵”cDNA文库。

（4）构建以酵母菌株Y2HGold为载体的“诱饵”cDNA文库：将上述去除自激活序列的“诱饵”cDNA文库离心收集，Clontech公司Easy yeast plasmid Isolation kit提取质粒，获得的质粒利用Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒转化酵母菌株Y2HGold。

（5）大规模酵母双杂交筛选互作蛋白质：上述构建好的Y2HGold菌株中的“诱饵”cDNA文库和Y187菌株中的“猎物”cDNA文库混合杂交，通过两重选择培养基的筛选获得报告基因被激活表达的阳性克隆，对互作双方的插入片段进行测序及分析。

所述步骤（1）中构建“诱饵”cDNA文库和“猎物”cDNA文库分别使用了两对引物，其中GBK-SMART Ⅲ和GBK-CDS Ⅲ用于“诱饵”cDNA文库的第一链合成，BD 5’PCR primer和BD 3’PCR primer用于双链的合成；SMART Ⅲ和CDS Ⅲ用于“猎物”cDNA第一链的合成，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer用于双链的合成。具体序列如下：GBK-SMART Ⅲ5’-CTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCrGrGrG-3’GBK-CDS Ⅲ：5’-CGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCC-d(T)₃₀VN-3’SMART Ⅲ：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCrGrGrG-3’CDS Ⅲ：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀VN-3’BD 5’PCR primer：5’-GAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGC-3’BD 3’PCR primer：5’-GGGTTATGCTAGTTATGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGA-3’AD 5’PCR primer：5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’ AD 3’PCR primer：5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’

SMART Ⅲ和CDS Ⅲ，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer序列来源于Clontech公司试剂盒，GBK-SMART Ⅲ和GBK-CDS Ⅲ，BD 5’PCR primer和BD 3’PCR primer则是本发明的创新，GBK-SMART Ⅲ由42个碱基组成，前39个碱基与质粒pGBKT7（购买自Clontech公司）同源，最后的三个rG（非脱氧核苷酸G）是基于RNase Hˉ反转录酶完成mRNA反转录后在第一链cDNA的3’末端继续延长三个C碱基的特性，在引物GBK-SMART Ⅲ3’端末端设计添加的，这三个rG与cDNA第一链3’末端延长的三个C碱基互补，使RNase Hˉ反转录酶在合成中自动进行模板转换，并将与pGBKT7同源的重组序列固定在cDNA的3’末端；GBK-CDSⅢ由56个碱基组成，在3’端带有30个（d）T，尾端设计了VN序列，以提高启动引导的特异性，并在其5’端设计了与pGBKT7同源的重组序列，这样就在cDNA第一链的两端引入了质粒pGBKT7同源的重组序列，然后再根据GBK-SMARTⅢ，GBK-CDS Ⅲ的序列分别设计引物BD 5’PCR primer和BD 3’PCR primer。

所述步骤（2）中酵母菌株MaV203的表型如下

将“诱饵”cDNA文库转化入MaV203以去除具有自激活作用的序列，其原理是报告基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用,它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。MaV203通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点，当与GAL4的BD融合的“诱饵”cDNA文库序列编码的蛋白质具有自激活作用时能够激活URA3的转录表达，在加入5-氟乳清酸(5-FOA)的选择培养基上不能生长，从而去除了具有自激活作用的序列，对这一实验设计我们进行了验证，其结果见图2，如图2所示RsPKA(Rhizoctonia solani protein kinase A)cDNA已被验证具有自激活作用，将其克隆入质粒pGBKT7的多克隆位点，重组的质粒转化酵母菌株MaV203并涂布含有0.2﹪5-FOA的SD/-Trp酵母平板培养基，由于pGBKT7-RsPKA的自激活作用使得URA3转录表达，将5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质毒死该酵母细胞，宏观上表现为无菌落生长(图2A)；反之，在无5-FOA的SD/-Trp酵母平板培养基则能正常生长(图2B)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明针对阵列法需大规模逐条克隆ORF耗时、耗力、耗财和文库法一次杂交只能筛选单个或几个“诱饵”的互作蛋白而不适合高通量筛选的缺点，创造性的采用“文库对文库”的酵母双杂交方法，即以基因组规模的cDNA作为“Bait”筛选同样是基因组规模的cDNA“Library”。在本技术实施过程中采取对cDNA文库进行均一化处理的方法来降低高丰富度互作蛋白对低丰富度互作蛋白的掩盖作用，提高了筛选的效率；利用酵母URA3基因的特性自动的去除“bait”cDNA中具有自激活作用的序列，相对于现有的高通量的酵母双杂交技术，本方法操作简捷、工作量小、成本较低、硬件条件要求较低，对于条件一般的实验室也能够进行组学水平的蛋白质-蛋白质互作的筛选。

附图说明

图1为一种文库对文库酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法的流程图。

图2为一种验证5-FOA去除具有自激活作用的序列的效果示意图。

图2A:已知具有自激活作用的pGBKT7-RsPKA(Rhizoctonia solani protein kinase A)转化MaV203涂布含有0.2﹪5-FOA的SD/-Trp酵母平板培养基；

图2B:已知具有自激活作用的pGBKT7-RsPKA(Rhizoctonia solani protein kinase A)转化MaV203涂布SD/-Trp酵母平板培养基。

图3为一种均一化后cDNA文库的电泳检测图。

图3A为玉米双链cDNA 1.2％琼脂糖凝胶电泳图；

图3B为立枯丝核菌AG Ⅰ-IA双链cDNA 1.2％琼脂糖凝胶电泳图；

图3C为小麦双链cDNA 1.2％琼脂糖凝胶电泳图；

图3D为小麦白粉病菌双链cDNA 1.2％琼脂糖凝胶电泳图。

图4为文库对文库杂交后两重选择培养基的筛选获得阳性克隆示意图。

图4A DDO/X/A上立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA文库与玉米cDNA文库杂交获得的阳性克隆；

图4B DDO/X/A上小麦白粉病菌cDNA文库与小麦cDNA文库杂交获得的阳性克隆；

图4C QDO/X/A进一步筛选DDO/X/A上获得的立枯丝核菌AG Ⅰ-IA与玉米互作的阳性克隆；

图4D QDO/X/A进一步筛选DDO/X/A上获得的小麦白粉病菌与小麦互作的阳性克隆。

具体实施方式

通过下述实施例有助于进一步理解本发明，但并不限制发明的内容。本实施例中所用试剂如无特别说明均购自Clontech公司。

实施例1：一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法：筛选植物病原菌立枯丝核菌AG Ⅰ-IA与寄主玉米互作蛋白质，其具体步骤如下：

（1）分别合成“诱饵”cDNA-立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA和“猎物”cDNA-玉米cDNA：

a.Invitrogen公司Trizol试剂提取立枯丝核菌AG Ⅰ-IA和接种并感染立枯丝核菌AG Ⅰ-IA的玉米叶片总RNA，纯化获得mRNA，测的浓度为立枯丝核菌AG Ⅰ-IA mRNA 323.2ng/μl，玉米mRNA 309.6ng/μl。

b.将以下试剂顺序加入无RNAase的微型离心管

mRNA	1.5μl
		GBK-CDS Ⅲ(立枯丝核菌AG Ⅰ-IA)/CDS Ⅲ(玉米)	1μl
无RNAase的无菌水	1.5μl
		总体积	4μl

混合均匀，离心至管底。

引物GBK-CDS Ⅲ由南京金斯瑞公司合成，下同。

c.72℃孵育2min，冰上冷却2min，离心至管底，加入以下试剂：

第一链合成缓冲液	2.0μl
		DTT(100mM)	1.0μl
dNTP Mix(10mM)	1.0μl
		MMLV Reverse Transcriptase	1.0μl
总体积	5.0μl

混合均匀，42℃孵育10min。

d.加入1μl GBK-SMART Ⅲ（立枯丝核菌AG Ⅰ-IA）/SMART Ⅲ（玉米），混匀，42℃孵育1.5h。

引物GBK-SMART Ⅲ由南京金斯瑞公司合成，下同。

e.反应结束后，75℃放置10min以终止合成第一链的反应。

f.冷却至室温，加入1μl RNase H(2units)，37℃孵育20min，获得第一链的cDNA。

g.在微量离心管中加入以下试剂：

引物BD 5’PCR primer，BD 3’PCR primer由南京金斯瑞公司合成，下同。

混合均匀，PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：

·95℃30s

·26个循环

95℃10s

68℃6min

·68℃5min

*：每增加一个循环延伸时间增加5s。

h.取7μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余dsDNA产物-20℃保存。

i.Clontech公司CHROMA SPIN TE-400Columns纯化dsDNA，加入无DNase的ddH₂O溶解，使其浓度为100ng/μl。

（2）使用Evrogen公司的TRIMMER-DIRECT cDNA Normalization Kit对上述获得的cDNA文库进行均一化处理，其步骤如下：

a.在微量离心管中加入下列成分

100ng/μl cDNA	2μl
		杂交缓冲液	1μl
ddH₂O	2μl
		总体积	5μl

[0066] 混合均匀，加入1滴矿物油，98℃变性3min，65℃杂交5h。

b.加入5μl 68℃预热的DSN master buffer，0.25U DSN，处理20min。

c.加入10μl DSN stop solution，充分混匀，轻微离心。

d.68℃温育5min后从PCR仪中取出离心管，放置冰上。在各管中加入20μl去离子水，充分混匀，这些即为均一化cDNA，取7μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余dsDNA产物-20℃保存，实验结果见图3A、B。其中A图表明经LD-PCR合成的双链cDNA电泳呈弥散状，电泳条带主带大小分布在500~2000bp范围内，基本符合玉米cDNA分布规律，说明不同大小和不同丰度的玉米mRNA都得到了有效反转录及扩增；B图表明经LD-PCR合成的双链cDNA电泳呈弥散状，电泳条带大小分布在500~3000bp范围内，基本符合立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA分布规律，说明不同大小和不同丰度的立枯丝核菌AG Ⅰ-IA mRNA都得到了有效反转录及扩增。

（3）扩增均一化的cDNA，方法同步骤（1）中g。

（4）将上述均一化的立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA文库按照Clontech公司Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒操作说明与线性化的质粒pGBKT7共转化酵母菌株MaV203，均一化的玉米cDNA文库与线性化的质粒pGADT7共转化酵母菌株Y187。

（5）含有cDNA文库的酵母菌株的收集及“诱饵”cDNA文库中自激活序列的去除：

a.按照150μl/平板的量将上述转化好的酵母菌株涂布相应的培养基，转化有均一化的立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA文库的MaV203涂布10个含有0.2﹪5-FOA的SD/-Trp酵母平板培养基，转化有均一化的玉米cDNA文库的Y187涂布12个SD/-Leu酵母平板培养基。

b.30℃放置3～5天。

c.放置3～5天后4℃冷却平板3～4h。

d.玉米cDNA文库每平板加入2ml酵母冷冻保存培养基（YPDA+25﹪甘油），玻璃棒冲洗平板上的酵母菌体，收集到一个无菌锥形瓶中，每个平板再用1ml的新鲜酵母冷冻保存培养基冲洗一次，合并到该文库的锥形瓶中；立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA文库2个平板按照上述方法收集，用于保存菌种，其8个平板直接使用灭菌的ddH₂O冲洗，离心沉淀。

e.锥形瓶中加入直径5mm玻璃珠，轻摇打散菌体，血球计数板估算菌体密度，是具体密度大于2×10⁷/ml，若小于2×10⁷/ml，则离心富集。按照1ml/管分装文库，-80℃保存。

（6）构建以酵母菌株Y2HGold为载体的均一化立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA文库，具体包含一下步骤：

a.步骤（5）中d步离心沉淀的立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA使用Clontech公司Easy yeast pl asmid Isolation kit提取质粒。

b.获得的质粒利用Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒转化酵母菌株Y2HGold。

c.转化后的菌株按照150μl/平板的量涂布SD/-Trp酵母平板培养基。

d.30℃放置3～5天。

e.后续步骤同步骤(5)中c、d、e。

（7）大规模酵母双杂交筛选互作蛋白质，具体按照以下步骤实施：

a.2L的灭菌的三角瓶中加入1ml步骤(5)获得的玉米cDNA文库和2ml步骤（6）中获得的立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA文库。

b.加入40ml 2×YPDA液体培养基和250μl 10mg/ml的卡那霉素。

c.1ml 2×YPDA液体培养基冲洗文库的保存管各2次。

d.30～50rpm 30℃培养2024h。

e.20h时40×显微镜下观察是否有合子出现，若有则终止培养，若没有则继续杂交4h。

f.合子出现后，1000g离心10min，弃掉上清，50ml 0.5×YPDA（含50μgml的卡那霉素）冲洗2L杂交培养的三角瓶，并用其悬浮沉淀的酵母细胞。

g.1000g离心10min，弃掉上清，10ml 0.5×YPDA（含50μg/ml的卡那霉素）悬浮沉淀。

h.将上述0.5×YPDA的酵母悬浮液按100μl/皿涂布加入X-α-Gal和Aureobasidin A的SD–Leu/-Trp酵母固体培养基（DDO/X/A，X-α-Gal浓度为40μgml，Aureobasidin A浓度为125ng/ml）实验结果见图4A。如图4A所示，单克隆在含有X-α-Gal和Aureobasidin A的SD–Leu/-Trp酵母固体培养基上能够生长成较大菌落说明该单克隆同时含有pGADT7（能够合成Leu）和pGBKT7（能够合成Trp）两种质粒，并且分别插入以上两种质粒的玉米cDNA和立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA片段表达的蛋白质相互作用激活了报告基因MEL1和AUR1-C的表达，从而使该单克隆宏观上表现为酵母菌落呈现蓝色和对Aureobasidin A产生抗性和能够在缺乏Leu和Trp的培养基上生长，此即经初步筛选得到的阳性克隆。

i.30℃培养3～5天，挑取阳性克隆到加入X-α-Gal和Aureobasidin A的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp酵母固体培养基（QDO/X/A，X-α-Gal浓度为40μg/ml，Aureobasidin A浓度为125ng/ml）上划线培养，并转代2-3次淘汰假阳性克隆，实验结果见附图4C。如图4C所示，单克隆在含有X-α-Gal和Aureobasidin A的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp酵母固体培养基能够生长成较大菌落说明该单克隆中同时含有pGADT7（能够合成Leu）和pGBKT7（能够合成Trp）两种质粒，并且分别插入以上两种质粒的玉米cDNA和立枯丝核菌AG Ⅰ-IA cDNA片段表达的蛋白质相互作用激活了报告基因MEL1、AUR1-C、HIS3和ADE2的表达，从而使该单克隆宏观上表现为酵母菌落呈现蓝色、对Aureobasidin A产生抗性和能够在缺乏Ade、His、Leu和Trp的培养基上生长，此即为经严格筛选得到的阳性克隆。

j.对阳性克隆提取质粒并电击转化大肠杆菌DH5α感受态，测序获得互作的“诱饵”和“猎物”插入片段的序列。

实施例2一种文库对文库酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法：筛选植物病原菌小麦白粉病菌与寄主小麦的互作蛋白质，其具体步骤如下：

（1）分别合成“诱饵”cDNA-小麦白粉病菌cDNA和“猎物”cDNA-小麦cDNA：

a.Invitrogen公司Trizol试剂提取小麦白粉病菌、接种并感染小麦白粉病菌的小麦叶片总RNA，纯化获得mRNA，测的浓度为小麦白粉病菌mRNA 734.7ng/μl，小麦mRNA 683.5ng/μl。

b.将以下试剂顺序加入无RNAase的微型离心管

mRNA	1.0μl
		GBK-CDS Ⅲ(小麦白粉病菌)/CDS Ⅲ(小麦)	1.0μl
无RNAase的无菌水	2.0μl
		总体积	4.0μl

混合均匀，离心至管底。

c.72℃孵育2min，冰上冷却2min，离心至管底，加入以下试剂：

混合均匀，42℃孵育10min。

d.加入1μl GBK-SMART Ⅲ（小麦白粉病菌）/SMART Ⅲ（小麦），混匀，42℃孵育1.5h。

e.反应结束后，75℃放置10min以终止合成第一链的反应。

g.在微量离心管中加入以下试剂：

混合均匀，PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：

·95℃30s

·24循环

95℃10s

68℃6min

·68℃5min

*：每增加一个循环延伸时间增加5s。

h.取7μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余dsDNA产物-20℃保存。

a.在微量离心管中加入下列成分

100ng/μl cDNA	2μl
		杂交缓冲液	1μl
ddH₂O	2μl
		总体积	5μl

混合均匀，加入1滴矿物油，98℃变性3min，65℃杂交5h。

b.加入5μl 68℃预热的DSN master buffer，0.25U DSN，处理20min。

c.加入10μl DSN stop solution，充分混匀，轻微离心。

d.68℃温育5min后从PCR仪中取出离心管，放置冰上。在各管中加入20μl去离子水，充分混匀，这些即为均一化cDNA，取7μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余dsDNA产物-20℃保存，实验结果见附图3C、D。其中C图表明经LD-PCR合成的双链cDNA电泳呈弥散状，电泳条带主带大小分布在500~2000bp范围内，基本符合小麦cDNA分布规律，说明不同大小和不同丰度的小麦mRNA都得到了有效反转录及扩增；D图表明经LD-PCR合成的双链cDNA电泳呈弥散状，电泳条带大小分布在250~2000bp范围内，基本符合小麦白粉病菌cDNA分布规律，说明不同大小和不同丰度的小麦白粉病菌mRNA都得到了有效反转录及扩增。

（3）扩增均一化的cDNA，方法同步骤（1）中g。

（4）将上述均一化的小麦白粉病菌cDNA文库按照Clontech公司Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒操作说明与线性化的质粒pGBKT7共转化酵母菌株MaV203，均一化的小麦cDNA文库与线性化的质粒pGADT7共转化酵母菌株Y187。

a.按照150μl/平板的量将上述转化好的酵母菌株涂布相应的培养基，转化有均一化的小麦白粉病菌cDNA文库的MaV203涂布10个含有0.2﹪5-FOA的SD/-Trp酵母平板培养基2不含有0.2﹪5-FOA的SD/-Trp酵母平板培养基，实验效果见图2；转化有均一化的小麦cDNA文库的Y187涂布12个SD/-Leu酵母平板培养基。

b.30℃放置3～5天。

c.放置3～5天后4℃冷却平板3～4h。

d.小麦cDNA文库每平板加入2ml酵母冷冻保存培养基（YPDA+25﹪甘油），玻璃棒冲洗平板上的酵母菌体，收集到一个无菌锥形瓶中，每个平板再用1ml的新鲜酵母冷冻保存培养基冲洗一次，合并到该文库的锥形瓶中；小麦白粉病菌cDNA文库2个平板按照上述方法收集，用于保存菌种，其8个平板直接使用灭菌的ddH₂O冲洗，离心沉淀。

（6）构建以酵母菌株Y2HGold为载体的均一化小麦白粉病菌cDNA文库，具体包含一下步骤：

a.步骤（5）中d步离心沉淀的包含小麦白粉病菌cDNA文库的酵母使用Clontech公司Easy yeast plasmid Isolation kit提取质粒。

d.30℃放置3～5天。

e.后续步骤同步骤(5)中c、d、e。

a.2L的灭菌的三角瓶中加入1ml步骤(5)获得的小麦cDNA文库和2ml步骤（6）中获得的小麦白粉病菌cDNA文库。

b.加入40ml 2×YPDA液体培养基和250μl 10mgml的卡那霉素。

c.1ml 2×YPDA液体培养基冲洗文库的保存管各2次。

d.30～50rpm 30℃培养20-24h。

h.将上述0.5×YPDA的酵母悬浮液按100μl/皿涂布加入X-α-Gal和Aureobasidin A的SD–Leu/-Trp酵母固体培养基（DDO/X/A，X-α-Gal浓度为40μg/ml，Aureobasidin A浓度为125ng/ml）实验结果见附图4B。如图4B所示，单克隆在含有X-α-Gal和Aureobasidin A的SD–Leu/-Trp酵母固体培养基能够生长成较大菌落说明该单克隆同时含有pGADT7（能够合成Leu）和pGBKT7（能够合成Trp）两种质粒，并且分别插入以上两种质粒的小麦cDNA和小麦白粉病菌cDNA片段表达的蛋白质相互作用激活了报告基因MEL1和AUR1-C的表达，从而使该单克隆宏观上表现为酵母菌落呈现蓝色、对Aureobasidin A产生抗性和能够在缺乏Leu和Trp的培养基上生长，此即为经初步筛选得到的阳性克隆。

i.30℃培养3～5天，挑取阳性克隆到加入X-α-Gal和Aureobasidin A的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp酵母固体培养基（QDO/X/A，X-α-Gal浓度为40μg/ml，Aureobasidin A浓度为125ng/ml）上划线培养，并转代2-3次淘汰假阳性克隆，实验结果见附图4D。如图4D所示，单克隆在含有X-α-Gal和Aureobasidin A的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp酵母固体培养基能够生长成较大菌落说明该单克隆中同时含有pGADT7（能够合成Leu）和pGBKT7（能够合成Trp）两种质粒，并且分别插入以上两种质粒的小麦cDNA和小麦白粉病菌cDNA片段表达的蛋白质相互作用激活了报告基因MEL1、AUR1-C、HIS3和ADE2的表达，从而使该单克隆宏观上表现为酵母菌落呈现蓝色、对Aureobasidin A产生抗性和能够在缺乏Ade、His、Leu和Trp的培养基上生长，此即为经严格筛选得到的阳性克隆。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法

<130> 一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 参照已知序列设计，用作第一链cDNA合成时跳转用引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(42)

<223> n=rg

<400> 1

ctgatctcag aggaggacct gcatatggcc atggaggccn nn 42

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 参照已知序列设计，用作第一链cDNA合成的反转录引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> v=a,c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> n=a,c,g或t

<400> 2

cggccgctgc aggtcgacgg atcctttttt tttttttttt tttttttttt ttttvn 56

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 参照已知序列设计，用作第二链cDNA合成的上游扩增引物

<400> 3

gagcagaagc tgatctcaga ggaggacctg catatggc 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 参照已知序列设计，用作第二链cDNA合成的下游扩增引物

<400> 4

gggttatgct agttatgcgg ccgctgcagg tcgacgga 38

Claims

1.一种文库对文库酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法，步骤如下：

（1）均一化诱饵cDNA文库和猎物cDNA文库的构建：提取目标生物组织总RNA，纯化获得mRNA，分别以GBK-SMART Ⅲ和GBK-CDS Ⅲ，SMART Ⅲ和 CDS Ⅲ为引物进行RT-PCR反应，对生成的第一链cDNA再分别以BD 5’ PCR primer和BD 3’ PCR primer，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer为引物通过LD-PCR反应进行扩增获得未均一化的双链cDNA文库，然后按照DSN法对上述两个cDNA文库进行均一化处理并以BD 5’ PCR primer和BD 3’ PCR primer，AD 5’PCR primer和AD 3’ PCR primer对相应的文库进行扩增，获得足够量的均一化的诱饵cDNA文库和猎物 cDNA文库；

所述引物如下：

GBK-SMART Ⅲ5’-CTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCrGrGrG-3’

GBK-CDS Ⅲ：5’-CGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCC-d(T)₃₀VN-3’

SMART Ⅲ：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’

CDS Ⅲ：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀VN-3’

BD 5’ PCR primer：5’-GAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGC-3’

BD 3’PCR primer：5’-GGGTTATGCTAGTTATGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGA-3’

AD 5’PCR primer：5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’

AD 3’ PCR primer：5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’

（2）大规模转化诱饵cDNA文库、猎物cDNA文库：将上述构建好的诱饵cDNA文库按照Clontech公司Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒操作说明与线性化的质粒pGBKT7共转化酵母菌株MaV203，猎物cDNA文库与线性化的质粒pGADT7共转化酵母菌株Y187，获得转化入酵母菌株中的诱饵cDNA文库和猎物cDNA文库；

（3）含有cDNA文库的酵母菌株的收集及诱饵cDNA文库中自激活序列的去除：将构建有猎物cDNA文库的Y187菌株涂布SD/-Leu酵母平板培养基，将构建有诱饵cDNA文库的酵母MaV203涂布含0.2﹪5-FOA的SD/-Trp酵母平板培养基，30℃放置3～5天，冲洗收集生长的克隆，即获得构建进酵母菌株Y187中的猎物cDNA文库和去除自激活序列的酵母菌株MaV203中的诱饵cDNA文库；

（4）构建以酵母菌株Y2HGold为载体的诱饵cDNA文库：将上述去除自激活序列的诱饵cDNA文库离心收集，Clontech公司Easy yeast plasmid Isolation kit提取质粒，获得的质粒利用Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒转化酵母菌株Y2HGold；

（5）大规模酵母双杂交筛选互作蛋白质：上述构建好的Y2HGold菌株中的诱饵cDNA文库和Y187菌株中的猎物cDNA文库混合杂交，通过两重选择培养基的筛选获得报告基因被激活表达的阳性克隆，对互作双方的插入片段进行测序及分析。

2.根据权利要求1所述的一种文库对文库酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤（1）中构建均一化诱饵cDNA文库和猎物cDNA文库的目标生物组织或细胞既可以来源于同一种生物又可来源于具有互作关系的不同生物。