CN110004171B - 一种酵母双杂交方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种酵母双杂交方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：(1)将文库酵母菌进行活化，然后将AD‑Y融合载体转化到文库酵母菌中；(2)将诱饵质粒BD‑X转化到酵母细胞Y2H Gold中；(3)将BD‑X的重组酵母菌和含有AD‑Y的重组酵母菌融合成二倍体，将二倍体酵母菌在含锌离子扩增培养基上进行培养获得菌落，然后进行阳性克隆的筛选。所述方法中所使用的酵母细胞Y2H Gold中的GAL4蛋白是锌离子依赖性的转录因子，因此所述方法中在使用的扩增培养基加入锌离子，提高了低丰度蛋白的互作，增加了弱互作蛋白的检出率，提高阳性克隆率。

Description

一种酵母双杂交方法
技术领域
本公开涉及基因工程领域，具体涉及一种酵母双杂交方法。
背景技术
酵母双杂交是进行蛋白功能研究的常用方法，该方法可以快速验证已知蛋白之间的相互作用并寻找新的相互作用蛋白质，尤其在寻找蛋白质互作区域时具有显著优势。利用酵母双杂交获得目的蛋白的拟互作蛋白，是寻找目的蛋白的靶蛋白并研究其功能的首选方法，广泛应用于科学研究。目前采用的酵母双杂交方法有很多种，如Clontech(Takara)公司的Y2H Gold Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System系列、Invitrogen公司的ProQuestTwo-Hybrid System等。酵母双杂交系统早在1989年和1994年分别由Fields和Song提出，通过真核细胞转录因子(如GAL4和GCN4蛋白质)的结构特性，将其分成两个独立部分，即含有DNA结合(DNA-Binding)功能的BD结构域(DNA-Binding domain，BD)和转录激活(Activation)功能的AD结构域(Activation domain，AD)。只有当AD和BD结构域共同存在并形成完整结构时才能使转录正常进行，转录因子的一种功能便是作为反式作用因子与顺式作用元件结合，激活或者抑制下游基因的表达。基于此，分别设计含BD与AD的载体，并将BD与AD的载体分别与目的蛋白又称“诱饵”蛋白(Bait，X)和拟互作蛋白又称“猎物”蛋白(Prey，Y)形成融合蛋白。如果X和Y这两种蛋白可以发生相互作用，将会拉近BD与AD的距离，使得BD与AD在空间上能够接近并形成完整的GAL4或GCN4转录因子，从而激活报告基因的转录；而单独的BD与AD蛋白质在空间上具有一定的距离，不能激活报告基因的表达，从而检测不到报告基因。若BD或AD存在自激活，则需要进行截断，用保守功能区进行互作实验。
Y2H Gold Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System的酵母双杂交系统，该系统中所用到的酵母菌种经过了基因改造后，自身既不能产生GAL4，也无法自然合成色氨酸(TRP)、亮氨酸(LEU)、腺嘌呤(ADE)、组氨酸(HIS)，因此，酵母在缺乏这些氨基酸的培养基(SD-TRP-LEU-ADE-HIS)上不能正常生长，通过改造质粒便可以作为报告基因进行筛选。当所表达的融合蛋白能够相互作用时，转录因子GAL4便会重建，完整的转录因子便激活改造的酵母基因组中的这些报告基因，从而通过功能互补和蓝色反应筛选到阳性菌落，并通过提取酵母文库质粒转化大肠杆菌超级感受态后，提取质粒送测序，获得拟互作蛋白的序列，并在Genbank中进行序列比对，获得阅读框正确的拟互作蛋白序列。
酵母双杂交技术已经广泛应用于科学研究，但是该系统本身也存在一些问题。如对于特殊蛋白如胞外蛋白、膜蛋白受体等，因其必须经过内质网等细胞器进行翻译后修饰和折叠组装过程而不能进入核内，或者融合蛋白质的加入会产生错误的构象而造成筛选结果的假阴性。酵母双杂交的假阳性现象比较突出，在酵母中能够互作的可能真实情况下不一定发生互作。因为可能存在AD融合蛋白具有转录激活活性，从而使AD融合蛋白会与任意BD融合蛋白激活转录；或者时空上、细胞类型以及组织中可能不在一起的蛋白通过载体而强行地将它们聚在了一起；或者是普遍的蛋白互作，如一些蛋白水解酶和核糖体蛋白质等。酵母双杂交的假阴性现象也常有发生，因为融合蛋白的表达对细胞有毒性从而使得报告基因不表达或表达量很低以至检测不到信号，认为本应该发生互作的蛋白被错误地认为不互作等。
发明内容
本公开的目的是提供一种酵母双杂交方法，以达到增加检测灵敏度，提高阳性克隆率的效果。
为实现上述目的，技术方案如下：
一种酵母双杂交方法，其具体步骤包括：
(1)将文库酵母菌进行活化，然后将AD-Y融合载体转化到文库酵母菌中；
(2)将诱饵质粒BD-X转化到酵母细胞Y2H Gold中；
(3)将BD-X的重组酵母菌和含有AD-Y的重组酵母菌融合成二倍体，将二倍体酵母菌在含锌离子扩增培养基上进行培养获得菌落，然后进行阳性克隆的筛选。
所述步骤(1)中的文库酵母菌含有三种读码框；其中文库酵母菌为Y187酵母菌。
所述步骤(2)中的转化方式为电转杯转化法。
所述步骤(3)中的含锌离子培养基所添加的锌离子的浓度为15-20μmol/L，所述含锌离子培养基所添加的锌离子化合物为氯化锌。
所述步骤(3)中阳性克隆的筛选方法为将获得的阳性菌落进行序列鉴定，最终将阳性菌落再加入筛选培养基中进行进一步确认结果。
所述阳性菌落序列的鉴定的方法是利用酵母菌落PCR试剂盒进行检测。
所述筛选培养基中含有酵母抗生素AbAr。
本公开的有益效果是：提供了一种酵母双杂交方法，所述方法中所使用的酵母细胞Y2H Gold中的GAL4蛋白是锌离子依赖性的转录因子，因此所述方法中在使用的扩增培养基加入锌离子，提高了低丰度蛋白的互作，增加了弱互作蛋白的检出率，提高阳性克隆率。
所述酵母双杂交方法中的文库含有三种阅读框，能够降低假阳性，利用酵母菌落PCR试剂盒进行阳性克隆的鉴定，缩短了时间，可实现快速获得酵母双杂交的阳性克隆结果。
附图说明
图1为实施例1与对比组所得酵母菌落图。
图2为阳性菌落验证图。
图3为实施例1与对比组阳性鉴定对比图。
具体实施方式
以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
实施例1
一种酵母双杂交方法，其具体步骤包括：
1)含有三种读码框的文库以酵母菌Y187形式保存。使用时先活化。将2毫升来自组织或者细胞的AD-cDNA文库，用SD/-LEU液体培养基稀释10倍后，平均涂布到SD/-LEU固体培养基(100个板子)中培养5天，用玻璃棒将所有的酵母菌刮下来混匀后分装到离心管中获得活化的酵母文库，加入甘油并保存到-80℃。酵母文库通过10倍梯度稀释测定文库的滴度，计算出扩增文库所需要的原始文库菌液的体积；两两蛋白互作为：ZFP36和OsLEA5，将AD-ZFP36融合载体利用电转杯转化法转化到酵母菌Y187中，并于SD/-LEU中保存；
2)利用电转杯转化法将诱饵质粒BD-OsLEA5转化酵母细胞Y2H Gold中，获得能表达诱饵蛋白BD-OsLEA5的重组酵母菌，并于SD/-TRP中保存；
3)将能表达诱饵蛋白BD-OsLEA5的重组酵母菌，于SD/-TRP选择培养基中扩大培养到OD600为0.2的浓度，然后将含有cDNA文库的酵母菌Y187直接与BD-OsLEA5的重组酵母菌混合，20-24小时后形成了大量二倍体酵母，将融合成功的二倍体酵母稀释一定浓度后用玻璃珠法涂布到含有浓度为16.7μmol/L锌离子的筛选培养基和α半乳糖苷酶底物X-α-gal(SD-TRP-LEU-HIS/X-α-gal)中，3-5天后获得大量蓝色单菌落，利用酵母菌落PCR试剂盒，T7和3’AD为引物，进行PCR扩增，取少量PCR产物进行检测，扩增成功的PCR原液直接测序，在Genbank中进行序列比对，获得阅读框正确的互作蛋白序列，最后将阳性二倍体酵母菌落再加入含有酵母抗生素AbAr的筛选培养基(SD-TRP-LEU-HIS/X-α-gal/AbAr)中进行进一步的验证，进一步确认阳性结果。
实施例2
对比组，一种酵母双杂交方法，其步骤与实施例1基本相同，在步骤(3)中使用的培养基与实施例1除不含锌离子外其他组分相同。
将实施例1中所得到的蓝色单菌落与对比组所得到的蓝色单菌落对比发现，如图1，a为对比组，b为实施例1，可以看出b图上的菌落斑点明显要多于a图，这说明本公开所述的一种酵母双杂交方法所得到的阳性克隆率明显要高于对比组，说明本公开所述的方法能够提高阳性克隆率，且在最后进一步确认阳性结果发现，如图2，a为对比组，b为实施例1，可以看出本公开所述方法能够将假阳性降低，并提高筛选到阳性克隆的几率。
具体的对ZFP36和OsLEA5互作蛋白阳性鉴定发现如图3(其中a为阳性对照、b为阴性对照、c为实验组；A为实施例1、B为对比组)，将图3A和图3B对比发现，本公开所述的一种酵母双杂交方法，在阳性克隆的筛选中加入锌离子可以提高低丰度蛋白的互作，大大提高弱互作蛋白的检测灵敏度，避免了添加对酵母有毒性的3-AT(组氨酸抑制剂)的加入，从而减少了假阴性。

Claims (5)

1.一种酵母双杂交方法，其特征在于，所述方法的步骤为：
（1）将AD-ZFP36融合载体转化到酵母菌Y187中；
（2）将诱饵质粒BD-OsLEA5转化到酵母细胞Y2H Gold中；
（3）将含有BD-OsLEA5的重组酵母菌和含有AD-ZFP36的重组酵母菌融合成二倍体，将二倍体酵母菌在含锌离子的筛选培养基上进行培养获得菌落，然后进行阳性克隆的筛选；
所述步骤（3）中的含锌离子的筛选培养基所添加的锌离子的浓度为15-20μmol/L；
所述步骤（3）中阳性克隆的筛选方法为将获得的阳性菌落进行序列鉴定，最终将阳性菌落再加入筛选培养基中进行进一步确认结果。
2.根据权利要求1中所述的一种酵母双杂交方法，其特征在于，所述步骤（2）中的转化方式为电转杯转化法。
3.根据权利要求1中所述的一种酵母双杂交方法，其特征在于，所述锌离子的浓度具体为16.7μmol/L。
4.根据权利要求1中所述一种酵母双杂交方法，其特征在于，所述含锌离子的筛选培养基所添加的锌离子化合物为氯化锌。
5.根据权利要求1中所述的一种酵母双杂交方法，其特征在于，所述阳性菌落序列的鉴定的方法是利用酵母菌落PCR试剂盒结合测序进行检测。
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The ascorbate peroxidase APX1 is a direct target of a zinc finger transcription factor ZFP36 and a late embryogenesis abundant protein OsLEA5 interacts with ZFP36 to co-regulate OsAPX1 in seed germination in rice;Liping Huang et al.;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20171026;摘要、2.1节、3.1节、图1 *

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