JP2013502934A - 核酸の精製方法及びこの方法の実施に使用する配合物及びキット - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
本願は、米国特許出願第12/549806号(出願日:2009年8月28日)に基づく優先権を主張する(参照によりその内容の全体が本願に組み込まれる)。
本発明は、1以上の核酸の精製方法及びこの方法の実施に使用する配合物及びキットに関する。
以下は、限定するものではない、本発明の好ましい実施態様である。特記しない限り、全体を通じて、すべての用量、pHレベル及び濃度は室温でのものである。
本発明を用いて精製することができる核酸は、限定するものではないが、DNA(一本鎖、二本鎖、共有結合閉鎖状及び弛緩型環状)、RNA(一本鎖及び二本鎖)、PNAならびに前述のハイブリッドを含む。
本明細書において、用語“媒体”は、他の非核酸材料、例えば生体分子(例えば、タンパク質、多糖、脂質、低分子量酵素阻害薬、オリゴヌクレオチド、プライマー、鋳型)、ポリアクリルアミド、微量金属、有機溶媒などに加えて少なくとも1つの核酸を含む、天然に存在するか又は科学的に操作された任意の生体物質を含む。天然に存在する媒体の例は、限定するものではないが、全血、血漿及び他の体液ばかりでなく、ヒト、植物又は動物から得られる組織細胞培養物を含む。科学的に操作された媒体の例は、限定するものではないが、溶解物、アガロース及び/又はポリアクリルアミドゲルから溶離された核酸試料、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅もしくはDNAサイズ選択手順のいずれかから得られたDNA分子の複数の種を含む溶液及び配列決定反応後に得られた溶液を含む。
好都合には、本発明において、1以上の結合マトリックスを用いることができる。本明細書においては、用語“結合マトリックス”は、核酸に結合できる任意の形態を含む。当業者は、目的とする核酸(単数又は複数)のために適切な結合マトリックスを選択することができるであろう。
GTC-A配合物は、目的とする核酸をそのin vivo細胞環境から分離させるための溶解及び/又は結合溶液として機能し、結合マトリックスが存在する場合は、核酸の結合マトリックスへの結合を容易にする。上記のように、配合物は、GTC及びアセトアミド及び/又は1以上のアセトアミド誘導体を含む。GTC及びアセトアミド及び/又は1以上のアセトアミド誘導体は、一緒に、又は順次に試料媒体に添加されることができる。順次添加の例として、例えば、細胞を溶解するために第1溶液中の試料媒体にGTCを添加することができ、例えば、結合マトリックスへのDNA又はRNAの結合を促進するための結合溶液として、アセトアミド及び/又は1以上のアセトアミド誘導体を第2溶液に添加することができる。
GTC-A配合物は、キットにおいて、核酸の精製に用いることができる1以上の結合マトリックスと混合することができる。好ましくは、キットにおける結合マトリックスと配合物との容量比は1:400〜1:1である。結合マトリックスと配合物との比は、キットの特定の中身及びキットが対象とする用途に応じて、この好ましい範囲内又は範囲外で変化させることができる。キットは、第1容器にGTCを含み、第2容器にアセトアミド及び/又は1以上のアセトアミド誘導体を含むことができ、これらは、キットにおいて、核酸の精製に用いることができる1以上の結合マトリックスと混合される。あるいは、GTCならびにアセトアミド及び/又は1以上のアセトアミド誘導体は、単一の容器中で混合されることもできる。1以上の結合マトリックスは、上記の容器の1つに混合されることもできるし、核酸の精製に使用できるキットにおいて、別途の品目として提供することもできる。
好ましい一実装において、本発明は、媒体に含まれる少なくとも1つの核酸の精製方法に関する。少なくとも1つの核酸をそのin vivo細胞環境から分離させ、少なくとも1つの結合マトリックスに結合させるために、少なくとも1つの核酸を含む媒体が、少なくとも1つの結合マトリックス及びGTC-A配合物と混合される。媒体、結合マトリックス及びGTC-A配合物は、任意の順序で、あるいは同時に混合されることができる。次いで、結合マトリックス及びそれに結合した少なくとも1つの核酸を、例えば、磁性ラックの使用、遠心分離又は濾過により、実質的に混合された媒体及び配合物の残りから分離される。場合により、この時点で、任意の不純物を除去するために、結合した結合マトリックス及び核酸の組み合わせを、GTC-A配合物を含む任意の適切な洗浄液で洗浄することができる。その後、少なくとも1つの核酸は結合マトリックスから溶離され、それによって少なくとも1つの核酸が実質的に精製された形態で得られる。この溶離段階は、前述の段階後直ちにおこなうこともできるし、後に行うこともできる。結合マトリックスから核酸を後に溶離することを選択することによって、下流での活性のために核酸を保存することができる
他の実装において、本発明は、本方法において必ずしも結合マトリックスから核酸を溶離する必要がないという条件下での前述の方法に関する。むしろ、結合マトリックス及びそれに結合した核酸(単数又は複数)は、保存することもでき、かつ/又は、結合マトリックスからの核酸(単数又は複数)の溶離を含むことも含まないこともできる科学的手順の後の使用に移すこともできる。
1.ビーカー中で、0.5gのFe3O4粒子(磁鉄鉱、SIGMA-ALDRICH(登録商標)より入手可能、ミズーリ州セントルイス、カタログ商品番号31,006-9)と1.0gのリンゴペクチン粒子(SIGMA-ALDRICH(登録商標)より入手可能、カタログ商品番号P8471)又はシトラスペクチン粒子(SIGMA-ALDRICH(登録商標)より入手可能、カタログ商品番号P9135)を水8mlに混合する。
2.最初に56%KOH 3.0mlを加えて、混合物のpHを調節する。約21℃で5分間混合した後、pH紙を用いて混合物のpHを断続的に試験し、3.0M HClを3.3ml加えてpHを下げる。得られたpHは約3でなければならない。次いで、pH4.8を有する1.32M KOAcを3.5ml加え、得られた混合物のpHが4〜5であるようにする。
3.混合物を終夜約21℃で放置する。一部の大きな(例えば、1〜2cm3)粒子が生成し、ビーカーの底部に沈殿する。混合物の残りをチューブに注いで移し、大きな粒子を含むビーカーに“大”というラベルを貼る。
4.混合物の残りを含むチューブを磁性ラック上に置き、混合物を磁化する。2分後、チューブの側壁に引き付けられなかった混合物の部分を他のチューブに注いで移す。側壁に引き付けられた粒子を含むチューブに“主要”というラベルを貼る。およそ大きさが約0.6μm〜約80μmのおおよそ3mlの“主要”粒子があるはずである。
5.混合物の残りを含むチューブを磁性ラック上に戻し、混合物を磁化する。10分後、チューブの側壁に引き付けられなかった混合物の部分を注ぎ捨てる。側壁に引き付けられた粒子を含むチューブに“一番刈り”というラベルを貼る。おおよそ1.5mlの“一番刈り”粒子があるはずである。
6.残留KOAc及び/又は残留ペクチン粒子を除去するために、“大(large)”“主要(main)”及び“一番刈り(first cut)”粒子をナノピュア水で3回洗浄する。各洗浄に関して、ナノピュア水10mlを加えて粒子をセットし、粒子を沈殿させ、次いでナノピュア水を注ぎ捨てる。
1. 1.5mlプラスチックチューブ9個のそれぞれにMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子50μlを加え、次いでヒト全血(Bioreclamation社より入手可能、ニューヨーク州ヒックスヴィル、カタログ商品番号HMPLEDTA3)200μlを加えて9つの試料、1〜9を調製する。
2.以下の9つの配合物の1つ800μlを、以下のように試料1〜9の異なる1つに加える:(a)試料1には5.0Mアセトアミドを加える;(b)試料2には2.6Mグアニジン塩酸塩(GHCl)を加える;(c)試料3には2.6M GHCl及び5.0Mアセトアミドの混合物を加える;(d)試料4には2.6M GTCを加える;(e)試料5には、2.6M GTC及び5.0Mアセトアミドの混合物を加える;(f)試料6には4.3M GHCl及び5.0Mアセトアミドの混合物を加える;(g)試料7には、6.5M GHClを加える;(h)試料8には9.0Mアセトアミドを加える;そして(i)試料9には、4.3M GTC及び5.0Mアセトアミドの混合物を加える。繰り返しピペッティングによって各試料を十分に混合する。
3.各試料を約21℃で10分間放置し、次いで試料の残りからMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子を分離するために磁性ラック上に各試料を置く。上清を除去、廃棄し、MAGAZORB(登録商標)常磁性粒子のみを残す。
4.磁性ラックから試料1〜9のそれぞれを取り除き、RNA洗浄液(Promega社より入手可能、カタログ商品番号Z3091)800μlでMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子を洗浄し、ピペッティングによって粒子を溶液に混合する。試料の残りからMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子を分離するために、磁性ラック上に各試料を戻す。再度、上清を除去、廃棄し、MAGAZORB(登録商標)常磁性粒子のみを残す。
5.2回目に、MAGAZORB(登録商標)常磁性粒子を洗浄するために、段階4を繰り返す。
6.磁性ラック上、約21℃の温度で、試料1〜9を20分間空気乾燥させる。
7.磁性ラックから試料を除去し、約56℃の温度で各試料にヌクレアーゼフリー水200μlを加えることによってMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子からDNAを溶離する。各試料を20分間時々ボルテックスしてMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子からDNAをヌクレアーゼフリー水に放出させることによって試料を溶離させ、磁性ラック上に試料を戻す。
8.ブルー/オレンジ6Xローディングダイ(Promega社より入手可能、カタログ商品番号G190)を用い、試料1〜9のそれぞれからDNA含有ヌクレアーゼフリー水10μlを、15%TBE-尿素ゲル(INVITROGEN社より入手可能、カリフォルニア州カールスバッド、カタログ商品番号EC68852BOX)を含むアガロースゲル電気泳動レーン9つのそれぞれ1つにロードする。10番目のレーンには何も添加しない。11番目のレーンには、対照として役に立つゲノムDNA標準品(Promega社より入手可能、カタログ商品番号G3041)を添加する。12番目のレーンには、尺度として役に立つ分子量標準の100bp DNAラダー(Promega社より入手可能、カタログ商品番号G2101)10μlを添加する。
9.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間、又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Gold(INVITROGEN社より入手可能、カタログ商品番号S11494)で各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に、1. ex488/em526. 2. PMT 450の設定でAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.2.7M GTC及び6.8Mアセトアミドからなる“L1”800μlを1.5mlプラスチックチューブ8個のそれぞれに加えることによって8つの試料、1〜8を調製する。
2.各試料に20mg/mlプロテイナーゼK 20μlを加え、ピペッティングによって試料を混合する。
3.各試料にヒト全血100μlを加え、ピペッティングによって6回混合する。
4.各試料を約56℃の温度で5分間インキュベートし、ピペッティングによって各試料を混合し、次いで、約56℃で更に5分間各試料をインキュベートする。
5.試料1〜8のそれぞれに前述の結合マトリックス4つを以下のように加える:(a)試料1及び2のそれぞれに、MAGAZORB(登録商標)常磁性粒子40μl(1.9mg)を加える;(b)試料3及び4のそれぞれに、常磁性カルボキシセルロースGENFIND(登録商標)粒子3μlを加える;(c)試料5及び6のそれぞれに、“主要”常磁性シトラスペクチン粒子(実施例1から)40μl(2.8mg)を加える;(d)試料7及び8のそれぞれにMAGNESIL(登録商標)ブルー常磁性シリカ粒子40μl(4.2mg)を加える。各試料をピペッティングによって混合し、試料を約21℃の温度で10分放置する。
6.試料を磁性ラック上に置くことによって試料を磁化する。過剰な流体を除去し、各試料に関して磁化された粒子のみを残すようにする。
7.磁性ラックから試料を除去し、L1 500μlを加え、ピペッティングによって混合することにより各試料を洗浄する。次いで磁性ラック上に試料を戻すことによって試料を磁化する。過剰な流体を除去し、各試料に関して磁化された粒子のみを残すようにする。
8.段階7の手順に従って、L1 500μlを用いて2回目及び3回目の洗浄を繰り返す。
9.L1の代わりにAlcohol Wash、Bloodを用いる以外は、上記の段階7の洗浄手順に従って、Alcohol Wash、Blood(Promega社より入手可能、カタログ商品番号MD1411)500μlを用いて、各試料を更に1回洗浄する。
10.磁性ラック上で、約21℃の温度で、試料を10分間空気乾燥させる。
11.磁性ラックから試料を除去し、各試料に10mMトリス(登録商標)HCl(pH8.0)200μlを加えることによって、粒子からDNAを溶離する。各試料を10分間時々ボルテックスして粒子からDNAをトリス(登録商標)HClに放出させることによって試料を溶離させ、次いで磁性ラック上に試料を置く。
12.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用い、15%TBE-尿素ゲルを含むアガロースゲル電気泳動レーン8つのそれぞれ1つに試料1〜8のそれぞれからDNA含有トリス(登録商標)HCl8μlをロードする。
13.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldを用いて各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に設定:1.ex488/em526.2.PMT450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.1.5mlプラスチックチューブ4個のそれぞれに4.0M GTC、5.0Mアセトアミド、20%(容量/容量)1-TG、0.64%(重量/容量)CHAPS、0.64%(容量/容量)TERGITOL(登録商標)タイプNP-9及び0.16%(容量/容量)トリトン(登録商標)X-100からなる“DX”800μlを加えることによって4つの試料、1〜4を調製する。
2.各試料に20mg/mlプロテイナーゼK20μlを加え、試料をピペッティングによって混合する。
3.各試料にヒト全血500μlを加え、ピペッティングによって10回混合する。
4.約21℃で10分間各試料をインキュベートし、ピペッティングによって各試料を混合し、次いで約21℃で更に10分間各試料をインキュベートする。
5.以下のように、試料1〜4に以下の結合マトリックスの1つを加える:(a)試料1及び2のそれぞれにMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子100μl(4.8mg)を加える;(b)試料3及び4のそれぞれに“主要”常磁性シトラスペクチン粒子(実施例1から)100μl(7mg)を加える。ピペッティングによって各試料を混合し、試料を約21℃で10分間放置する。
6.磁性ラック上に試料を置くことによって試料を磁化する。過剰な流体を除去し、各試料に関して磁化された粒子のみを残すようにする。
7.磁性ラックから試料を除去し、DX 500μlを加え、ピペッティングによって混合することにより各試料を洗浄する。次いで磁性ラック上に試料を戻すことによって試料を磁化する。過剰な流体を除去し、各試料に関して磁化された粒子のみを残すようにする。
8.各試料に関して、毎回DX 500μlを用いて更に8回、段階7の洗浄手順を繰り返す。
9.DXの代わりにAlcohol Wash、Bloodを用いる以外は段階7の洗浄手順を用いて、Alcohol Wash、Blood 500μlを用いて各試料を2回洗浄する。
10.磁性ラック上、約21℃で20分間、試料を空気乾燥させる。
11.磁性ラックから試料を除去し、各試料に10mMトリス(登録商標)HCl(pH8.0)200μlを加えることによって、粒子からDNAを溶離する。試料を10分間、試料を時々ボルテックスして粒子からトリス(登録商標)HClにDNAを放出させ、磁性ラック上に試料を置く。
12.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用い、15%TBE-尿素ゲルを含むアガロースゲル電気泳動レーン4つのそれぞれ1つに、試料1〜4のそれぞれからDNA含有トリス(登録商標)HCl 8μlをロードする。
13.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldを用いて各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.本実施例において、1.5mlプラスチックチューブ23個において、23の試料、1〜23を調製する。
2.チューブ17個のそれぞれに、4.3M GTC、6.0Mアセトアミド、0.8%CHAPS(重量/容量)、0.8%TERGITOL(登録商標)np-9(容量/容量)、0.2%トリトン(登録商標)X-100(容量/容量)及び、表示された最終濃度にした以下のインヒビターの中の表示された1つ:(a)試料3には0.008%BME(容量/容量);(b)試料4には0.016%BME(容量/容量);(c)試料5には0.032%BME(容量/容量);(d)試料6には0.064%BME(容量/容量);(e)試料7には12.5mg/ml TCEP;(f)試料8には25mg/ml TCEP;(g)試料9には50mg/ml TCEP;(h)試料10には100mg/ml TCEP;(i)試料11には125mM DTT;(j)試料12には200mM DTT;(k)試料16には12.5%1-TG(容量/容量);(l)試料17には20%1-TG(容量/容量);(m)試料18には33%1-TG(容量/容量);(n)試料19には330mM DTT;(o)試料20には12.5%1-TG(容量/容量)及び0.016%BME(容量/容量)の混合物;(p)試料21には20%1-TG(容量/容量)及び0.032%BME(容量/容量)の混合物;ならびに(q)試料22には12.5%1-TG(容量/容量)及び125mM DTTの混合物、からなる配合物800μlを加えることによって試料3〜12及び16〜22を調製する。
3.試料3〜12及び16〜22のそれぞれに、ルシフェラーゼコントロールRNA(Promega社より入手可能、カタログ商品番号L4561)1.0μlを加え、ピペッティングによって試料を混合する。
4.試料3〜12及び16〜22のそれぞれにヒト血漿(Bioreclamation社より入手可能、ニューヨーク州ヒックスヴィル、カタログ商品番号HMPLEDTA3)200μlを加え、ピペッティングによって試料を混合する。
5.一方で、他のチューブ6個に以下:(a)試料1にはルシフェラーゼコントロールRNA 1μl及びヒト血漿200μl;(b)試料13にはルシフェラーゼコントロールRNA 1μl(c)試料14には約-20℃の温度でルシフェラーゼコントロールRNA1μl;(d)試料23にはヒト血漿200μl;ならびに(e)試料2及び15のそれぞれには無添加、を加えることによって試料1、2、13〜15及び23を調製する。
6.試料1〜23のそれぞれを、約21℃で5分間放置する。次いで、各試料にMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子2μl(1mg)を加え、次いでピペッティングによって各試料を混合する。
7.試料を約21℃で3分間放置し、次いで磁性ラック上に試料2分間置く。2分後、試料から上清を除去し、粒子のみを残す。
8.試料1〜23のそれぞれに、ブルー/オレンジローディングダイ(Promega社より入手可能、カタログ商品番号G1881)8μlを加え、それらをピペッティングによって混合することによって粒子を再懸濁する。
9.各試料に関して、段階8を更に5回繰り返す。
10.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用いて、15%TBE-尿素ゲルを含む23のアガロースゲル電気泳動レーンのそれぞれ1つに試料1〜23のそれぞれ8μlをロードする。
11.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldを用いて各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.ヒト全血200μl及び“D1”800μl(後者は、4.3M GTC/5.9Mアセトアミドの混合物10mlにCHAPS 0.7g、TERGITOL(登録商標)タイプNP-9 400μl及びトリトン(登録商標)X-100 400μlを加えることによって調製される)を1.5mlプラスチックチューブ12個のそれぞれに加えることによって12の試料、1〜12を調製する。
2.試料1〜10のそれぞれに100bp DNAラダー 10μlを加える.
3.繰り返しピペッティングによって試料1〜12のそれぞれを十分に混合する。
4.試料1〜12のそれぞれにMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子30μlを加え、ピペッティングによって各試料を再度混合する。
5.約21℃で20分間各試料をインキュベートする。
6.MAGAZORB(登録商標)常磁性粒子を回収するために、試料1〜12のそれぞれにプラスチックスリーブ内に含まれるマグネットバーを挿入する。
7.回収したMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子を有するスリーブ/マグネットバーを除去する。
8.それぞれが“W1”溶液(2.6M GTC及び7.1Mアセトアミドの混合物)500μlを含む新しいチューブにスリーブ/マグネットバー及び回収した試料1〜12の粒子を入れる。プラスチックスリーブから磁石を抜き取り、次いで、スリーブとW1溶液を混合することによって、試料1〜12の粒子を再懸濁する。全部で30秒間、プラスチックスリーブにマグネットバーを再挿入し、次いで、回収したMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子を有するスリーブ/マグネットバーを除去する。
9.各試料に関してW1 500μlを用いて、段階7を更に2回、全部で3回の洗浄を繰り返す。
10.試料1及び2のそれぞれに関して、段階7を、W1を用いて、更に4回、全部で7回洗浄を繰り返す。
11.試料3及び4のそれぞれに関して、W1の代わりにMAGAZORB(登録商標)DNA Binding Solution 500μlを用いて、段階7を更に4回繰り返す。
12.試料5及び6のそれぞれに関して、W1の代わりにAlcohol Wash、Blood(BW洗浄液)(Promega社より入手可能、カタログ商品番号MB1001)溶液500μlを用いて更に4回段階7を繰り返す。
13.それぞれがWIZARD(登録商標)ゲノムDNA再水和溶液(Promega社より入手可能、カタログ商品番号A7963)40μlを含む新しいチューブに、それぞれスリーブ/マグネットバー及び回収した試料1〜12の粒子を入れる。プラスチックスリーブから磁石を抜き取り、次いで、WIZARD(登録商標)ゲノムDNA再水和溶液とスリーブを混合することによって試料1〜12の粒子を再懸濁する。
14.試料2及び4のそれぞれに100bp DNA(試料内で100bpバンドを強調するために)0.3μlを加える。
15.試料6及び8のそれぞれに200bp DNA(試料内で200bpバンドを強調するために)0.3μlを加える。
16.試料10及び12のそれぞれに300bp DNA(試料内で300bpバンドを強調するために)0.3μlを加える。
17.試料4、5、7、8、11及び12のそれぞれに300bp DNA(試料内で300bpバンドを強調するために)4μlを加える。
18.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用いて、15%TBE-尿素ゲルを含む12のアガロースゲル電気泳動レーンのそれぞれ1つに試料1〜12のそれぞれ8μlをロードする。
19.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldで各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に、設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.1.5mlプラスチックチューブ6個のそれぞれに、4.0M GTC、5.0Mアセトアミド、20%(容量/容量)1-チオ-グリセロール、0.64%(重量/容量)CHAPS、0.64%(容量/容量)TERGITOL(登録商標)タイプNP-9及び0.16%(容量/容量)トリトン(登録商標)X-100の混合物600μlを加えることによって6つの試料、1〜6を調製する。
2.試料1及び2のそれぞれにHeLa細胞200μl(2×106細胞)を加え、ピペッティングによって試料を混合する。
3.試料3にGIBCO(登録商標)DMEM媒体中のHeLa細胞100μl(1×106細胞)(INVITROGEN社より入手可能、カタログ商品番号11965092)を加え、ピペッティングによって試料を混合する。
4.試料4及び5のそれぞれにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞150μl(2×106細胞)を加え、ピペッティングによって試料を混合する。
5.試料6にGIBCO(登録商標)F-12plus 10% FBS媒体)中のCHO細胞75μl(1×106細胞)を加え、ピペッティングによって試料を混合する。
6.試料1〜6のそれぞれを約21℃の温度で10分間インキュベートし、次いで、それぞれがセルロース膜カラムを含むDNA IQ(登録商標)スピンバスケットチューブ6個のそれぞれ1つに試料を入れる。
7.約21℃で5分間試料1〜6を放置し、12,000×g(倍重力)で1分間試料を遠心分離する。
8.各チューブからカラムを除去し、次いで、それぞれの新しい1.5mlチューブに試料1〜6カラムを入れる。試料1〜6のそれぞれに4.0M GTC、5.0Mアセトアミド及び20%(容量/容量)1-TGの500μlの混合物を加え、次いで、12,000×gで1分間各試料を遠心分離する。
9.段階8を二度目に繰り返す。
10.段階8で用いた4.0M GTC、5.0Mアセトアミド及び20%(容量/容量)1-TGの混合物500μlの代わりに2.6M GTC及び7.1Mアセトアミドの混合物500μlを用いて、段階8を更に2回繰り返した。
11.試料2及び5のみに関しては、段階8に用いた4.0M GTC、5.0Mアセトアミド及び20%(容量/容量)1-TGの混合物500μlの代わりにSV Total RNA Wash 500μlを用いて、段階8を更に1回繰り返した。
12.それぞれの新しい1.5mlチューブに試料1〜6のそれぞれを入れ、各チューブにヌクレアーゼフリー水50μlを加える。
13.約21℃で2分間試料1〜6を放置し、次いで12,000×gで1分間試料を遠心分離する。以前の洗浄液からキャリーオーバーしたGTC-Aの量を減らすために、ヌクレアーゼフリー水に試料を溶離する。
14.核酸収率を最大化するために、試料1〜6からカラムを除去し、それぞれの新しい1.5mlチューブにそれを入れることによって、さらなる6つの試料、7〜12を調製する。
15.試料7〜12のそれぞれにヌクレアーゼフリー水100μlを加え、ついで約56℃で15分間試料をインキュベートする。
16.12,000×gで1分間試料7〜12を遠心分離する。ヌクレアーゼフリー水に試料を溶離する。
17.試料1に100bp DNAラダー2μlを加える(対照として役立つ分子量参照マーカーを提供する)
18.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用いて、10%TBE-尿素ゲル(INVITROGEN社より入手可能、カリフォルニア州カールスバッド、カタログ商品番号EC68752BOX)を含む12のアガロースゲル電気泳動レーンのそれぞれ1つに試料1〜12のそれぞれを5μlロードする。
17.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldで各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.GIBCO(登録商標)DMEM媒体でヒト胎児腎臓293(HEK293)組織培養細胞を増殖させる。1×gで5×106個のHEK293細胞4mlを沈殿させ、次いでピペッティングによって増殖媒体を除去し、50μlに約2×107個の細胞が含まれるようにする。次いで、細胞50μlを1.5mlプラスチックチューブに入れ、5分間氷上に置く。
2.段階1からの細胞50μlに、RNASIN(登録商標)Plus(1μl当たり40単位)(Promega社より入手可能、カタログ商品番号1232)6μlを加える。次いで、この細胞に100mM EDTA 100mM HEPES(登録商標)(pH7.5)(氷冷した)中のジギトニンを120μg/mlで100μl加える。内容物をボルテックスして10秒間混合し、次いで氷冷しながら20分間インキュベートする。77μg/mlジギトニンでのインキュベーションにより、細胞の核膜を溶解させずに細胞質膜の溶解が促進される。
3.段階2からの懸濁液を約4℃、13,000×gで5分間遠心分離して、核及び細胞の破片をペレットにする。
4.以下:(a)試料1及び2のそれぞれに関して、4.0M GTC、5.0Mアセトアミド、20%(容量/容量)1-TGの混合物400μl及びMAGAZORB(登録商標)常磁性粒子10μl;ならびに(b)試料3及び4のそれぞれに関して、DNA-IQ(登録商標)カラムならびに4.0M GTC、5.0Mアセトアミド及び20%(容量/容量)1-TGの混合物400μl、を含む1.5mlプラスチックチューブに、段階3からの懸濁液の上清40μlを分配することによって4つの試料、1〜4を調製する。
5.試料3及び4のそれぞれをピペッティングによって混合し、約21℃の温度で20秒間沈殿させ、次いで13,000×gで1分間試料3及び4を遠心分離する。試料3及び4のカラム通過液を除去し、それを新しい1.5mlチューブに入れる。次いで、試料3及び4のカラム通過液にMAGNESIL(登録商標)ブルー10μlを加える。
6.段階5からの4つの試料をピペッティングによって混合し、それを約21℃で5分間インキュベートする。試料1〜4のそれぞれを磁石上に置く。試料からの粒子の分離後、チューブの側面に引き付けられた粒子からの上清を捨てる。
7.試料1〜4のそれぞれの残存粒子を4.0M GTC、5.0Mアセトアミド及び20%(容量/容量)1-TGの混合物400μlで洗浄する。
8.磁性粒子を含む試料を磁気スタンド上に置き、磁化し、チューブの側面に引き付けられた粒子から上清を捨てる。
9.段階5からのDNA-IQ(登録商標)カラムを新しい1.5mlチューブに移す。SV RNA洗浄液400μlを用いてカラムを洗浄する。試料2〜4に関して、この洗浄プロセスを更に1回繰り返す。
10.常磁性粒子を含む4つの試料すべてを磁気スタンド上に置き、上清を捨て、試料を10分間空気乾燥させる。
11.DNA-IQ(登録商標)カラムを新しい1.5mlチューブに入れ、これらに試料5及び6と番号を付ける。
12.試料1〜6のそれぞれを、約21℃の温度で10分間、1試料あたりヌクレアーゼフリー水40μlで溶離する。常磁性粒子を含む試料を磁性ラック上に置く。
13.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用いて、15%TBE-尿素ゲルを含む別々のアガロースゲル電気泳動レーンに各チューブからの試料10μlをロードする。
14.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldで各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.DMEM媒体で増殖させた2.3×107 HEK293細胞を、50mlプラスチックチューブ中、1000×gで5分間遠心分離する。上清をデカントし、ペレット化した細胞をボルテックスして混合する。
2.HEK293細胞を溶解するために、4.0M GTC、5.0Mアセトアミド、20%(容量/容量)1-TG、0.64%(重量/容量)CHAPS、0.64%(容量/容量)TERGITOL(登録商標)タイプNP-9及び0.16%(容量/容量)トリトン(登録商標)X-100の混合物8mlを加える。均一な混合物が得られるまでボルテックスして溶解物を得る。
3.示された以下の結合マトリックスの1つ:(a)試料1及び2に関しては、DNA-IQ(登録商標)カラムにおけるセルロース膜;(b)試料3及び4に関しては、SVカラムにおけるシリカ膜;(c)試料5及び6に関しては、Corning(登録商標)スピンカラムにおける酢酸セルロース膜;(d)試料7及び8に関しては、Corning(登録商標)スピンカラムにおけるナイロン膜;(e)試料9及び10に関しては、ポリプロピレンスピンカラムにおけるPVDF膜;(f)試料11及び12に関しては、DNA-IQ(登録商標)カラムにおけるポリプロピレン膜;(g)試料13及び14に関しては、High Pure(登録商標)Spinフィルターチューブ;(h)試料15及び16に関しては、除去カラム;(i)試料17及び18に関しては、常磁性ゼオライト粒子10μl(3.4mg);(j)試料19及び20に関しては、MAGAZORB(登録商標)常磁性粒子20μl(1mg);(k)試料21及び22に関しては、MAGNESIL(登録商標)ブルー10μl(1mg);ならびに(l)試料23及び24に関しては、DNA-IQ(登録商標)常磁性粒子50μl(5mg)、を1.5mlプラスチックチューブに加えることによって24の試料、1〜24を調製する。
4.試料1〜24のそれぞれにHEK293溶解物300μlを加える。
5.約21℃で10分間、試料1〜24のすべてをインキュベートする。次いで、上清から粒子を分離するために、粒子を含む試料17〜24を磁性ラック上に置く。次いで上清を捨てる。
6.13,000×gで5分間、カラム試料1〜16を遠心分離する。PVDFカラム(試料9及び10)では、溶液の約半分のみが膜を通過することに注意のこと。従って、通過液に加えて、未処理の流体が捨てられる。
7.1.7M GTC及び7.5Mアセトアミドの混合物400μl中の粒子試料17〜24のそれぞれをピペッティングによって再懸濁し、次いで磁性ラック上に粒子試料を戻す。上清を捨てる。
8.GTC-A配合物の代わりにSV RNA洗浄液400μlを用いて段階7を更に3回繰り返す。3回目のRNA洗浄液を捨てた後、約21℃の温度で20分間、粒子試料を空気乾燥する。次いで、ヌクレアーゼフリー水40μlに核酸を溶離する。
9.1.7M GTC及び7.5Mアセトアミドの混合物400μlでカラム試料1〜16のそれぞれを洗浄し、次いで13,000×gで5分間遠心分離する。カラム通過液を捨てる。
10.SV RNA洗浄液400μlで2回カラム試料1〜16のそれぞれを洗浄し、次いで、13,000×gで5分間遠心分離し、次いでカラム通過液を捨てる。次いで13,000×gで1分間カラム試料を遠心分離してカラムの乾燥を確実にし、次いでヌクレアーゼフリー水40μlで各カラム試料を溶離する
11.約-20℃で16時間、すべての試料1〜24を保存する。
13.試料17〜24の磁気分離後、ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用いて、15%TBE-尿素ゲルを含む24のアガロースゲル電気泳動レーンのそれぞれ1つに各試料10μlをロードする。
14.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldで各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に、設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化した。
1DMEM媒体で増殖させた1.6×107 HEK293細胞を、15mlプラスチックチューブ中、1000×gで5分間遠心分離する。
2.DX6mlを加えて細胞を溶解する。次いで、均一な混合物が得られるまで、繰り返しピペッティングによって溶解物を混合する。
3.それぞれがDNA-IQ(登録商標)粒子50μl(5mg)を含む1.5mlプラスチックチューブ2個のそれぞれに段階2からの溶解物400μlを加えることによって2つの試料、1及び2を調製する。試料を混合し、次いで約21℃で10分間インキュベートする。
4.磁性ラックを用いて試料1及び2のそれぞれにおける粒子を磁化する。
5.それぞれが常磁性ゼオライト粒子10μl(3.4mg)を含む新しいチューブに、それぞれ試料1及び2からの上清を移すことによって、2つのさらなる試料、3及び4を調製する。ここでは、試料1及び2は、DNA-IQ(登録商標)粒子から上清を引いたものからなる。
6.試料3及び4のそれぞれを約21℃の温度で10分間混合しインキュベートする。次いで、磁性ラックを用いて試料3及び4のそれぞれにおける粒子を磁化し、試料3及び4のそれぞれから上清を除去する。
7.4.0M GTC、5.0Mアセトアミド及び20%(容量/容量)1-TGの混合物800μlで試料1〜4のそれぞれを洗浄する。次いで、SV RNA洗浄液800μlで更に3回、試料のそれぞれを洗浄する。
8.試料1〜4における粒子を磁化し、上清を除去し、次いで約21℃の温度で20分間粒子を空気乾燥させる。
9.粒子から核酸を溶離させるために、約21℃の温度で10分間ヌクレアーゼフリー水40μl中で試料1〜4のそれぞれにおける粒子を溶離する。
10.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用いて、15%TBE-尿素ゲルを含むアガロースゲル電気泳動レーン4つのそれぞれ1つに試料1〜4のそれぞれ10μlをロードする。
11.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldで各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に、設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.GIBCO(登録商標)DMEM媒体で増殖させた1.5×106 HEK293組織培養細胞25mlを1×g、約21℃で60分間沈殿させ、次いでピペッティングによって増殖媒体上清を除去し、1.5ml中に約3.7×107細胞(100μlあたり約2.5×106細胞)が含まれるようにした。
2.1.5mlプラスチックチューブ12個のそれぞれ1つに以下:(a)試料1〜6に関しては、HEK293組織培養細胞100μl;(b)試料7〜12に関しては、ヒト全血100μl、を加えることによって、12の試料、1〜12を調製する。
3.試料2、4、6、8、10及び12のそれぞれにPromega100塩基対ラダー10μlを加える。
4.示されたGTC-A配合物:(a)試料1、2、7及び8のそれぞれに関して、4.0M GTC、5.0Mアセトアミド及び20%(容量/容量)1-TGの混合物300μl;(b)試料3、4、9及び10のそれぞれに関して、4.0M GTC、5.0M N-メチルアセトアミド及び10%(容量/容量)1-TGの混合物500μl;ならびに(c)試料5、6、11及び12のそれぞれに関して、4.0M GTC、5.0M N,N-ジメチルアセトアミド及び10%(容量/容量)1-TGの混合物500μl、を各試料に加える。
5.試料1〜12のそれぞれをボルテックスして混合し、次いで試料を約21℃で5分間インキュベートする。
6.DNA-IQ(登録商標)セルロースミニカラムを含むそれぞれの1.5mlプラスチックチューブの1つに試料1〜12のそれぞれを移し、次いで11,000×gで2分間試料を遠心分離する。
7.試料1〜12DNA-IQ(登録商標)セルロースミニカラムのそれぞれを新しい1.5mlチューブに移し、次いで、段階4で用いる同じGTC-A配合物500μlで各ミニカラムを洗浄する。
8.ヌクレアーゼフリー水40μlで試料1〜12のそれぞれを溶離し、次いでミニカラムを除去する。
9.試料1〜12から除去したミニカラムを、それぞれ新しい1.5mlチューブに入れることによって、12のさらなる試料、13〜24を調製する。
10.ヌクレアーゼフリー水40μlで試料13〜24のそれぞれを溶離し、次いでミニカラムを捨てる。
11.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用いて、15%TBE-尿素ゲルを含む24のアガロースゲル電気泳動レーンのそれぞれ1つに試料1〜24のそれぞれ10μlをロードする。
12.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldで15分間各レーンを染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に、設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
1.1.5mlプラスチックチューブ2個のそれぞれに、4.0M GTC、5.0Mアセトアミド、20%(容量/容量)1-TG、0.64%(重量/容量)CHAPS、0.64%(容量/容量)TERGITOL(登録商標)タイプNP-9及び0.16%(容量/容量)トリトン(登録商標)X-100の混合物200μlを加えることによって2つの試料、1及び2を調製する。
2.試料1及び2のそれぞれにヒト全血100μlを加える。
3.試料2にPromega 100bpラダー10μlを加える。
4.約21℃の温度で試料1及び2のそれぞれをピペッティングによって十分に混合する。
5.10μlきざみで、Schleicher & Schuellセルロースカード上に試料1及び2のそれぞれをスポットし、セルロースカードによって以前の添加が吸収されて初めて継続的な添加を行う。全試料(試料1に関して300μl、試料2に関して310μl)がセルロースカードに塗布されるまで続ける。
6.核酸を比較するために、ヒト全血100μlにRNAマーカー(Promega社より入手可能、カタログ商品番号G3191)10ulを加えたものをセルロースカード上にスポットする。
7.試料2のスポットに、以前の添加がセルロースカードに吸収されて初めて、継続的な添加を行って、10μlきざみで2.6M GTC及び7.1Mアセトアミドの混合物150μlを添加する。得られた血液スポットは、比較的白色の中心ならびに、ヘモグロビン及び他の細胞の破片を含む赤い同心円を有するはずである。
8.試料1及び2スポットのそれぞれから約2mm×2mmの中央パンチを得、次いで、各中心の外側約5mmから約2mm×2mmの第2パンチを得る。
9.ヌクレアーゼフリー水20μlに4つのパンチのそれぞれを溶離する。
10.ブルー/オレンジ6Xローディングダイを用いて、15%TBE-尿素ゲルを含むアガロースゲル電気泳動レーン4つのそれぞれ1つに、4つのパンチのそれぞれからの溶離液10μlをロードする。
11.ブロモフェノールブルー色素を用いて120ボルトで約3時間又はブロモフェノールブルー色素がゲル底部のスリットに到達するまで電気泳動を行う。SYBR(登録商標)Goldで各レーンを15分間染色し、ALPHA INNOTECH FLUOROCHEM(登録商標)イメージングシステムを用い、特に、設定:1. ex488/em526. 2. PMT 450でのAmersham TYPHOON(登録商標)プラットフォームを用いてすべてのレーンをデジタル画像化する。
Claims (18)
- in vivo細胞環境に存在する核酸の精製方法であって、核酸及びin vivo細胞環境が媒体に含まれる前記方法において、
(a)核酸を含む媒体と結合マトリックス及び配合物とを混合する工程であって、前記配合物が、
(b)グアニジンチオシアナート;及び
(c)アセトアミド又は1以上のアセトアミド誘導体又はアセトアミド及び1以上のアセトアミド誘導体の組み合わせ、
を含み、前記配合物中に存在するグアニジンチオシアナートならびにアセトアミド、アセトアミド誘導体又はアセトアミド及びアセトアミド誘導体の組み合わせの量は、核酸をそのin vivo細胞環境から分離させ、結合マトリックスに結合させるのに十分である工程、
(d)実質的に混合された媒体及び配合物の残りから結合マトリックス及びそれに結合した核酸を分離する工程、
(e)結合マトリックスから核酸を溶離し、それによって実質的に精製された形態で核酸を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。 - アセトアミド誘導体が、N-メチルアセトアミド及びN,N-ジメチルアセトアミドからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- 前記配合物中のグアニジンチオシアナートの濃度が、おおよそ1.7M〜おおよそ4.3Mであり、該配合物中のアセトアミド、アセトアミド誘導体又はアセトアミド及びアセトアミド誘導体の組み合わせの濃度が、おおよそ5.0M〜おおよそ7.5Mである、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 第2核酸が前記媒体に存在する、前記請求項のいずれか1項に記載の方法であって、
(a)第2核酸に結合することができる第2結合マトリックスと、請求項1記載の段階(b)後に残った混合された媒体の残りとを混合する工程であって、第2核酸は第2結合マトリックスに結合する工程、
(b)実質的に混合された媒体及び配合物の残りから第2結合マトリックス及びそれに結合した第2核酸を分離する工程、
(c)第2結合マトリックスから第2核酸を溶離し、それによって実質的に精製された形態で第2核酸を得る工程、
を更に含む方法。 - 前記結合マトリックスが、常磁性セルロース粒子、常磁性カルボキシセルロース粒子、常磁性シトラスペクチン粒子、常磁性リンゴペクチン粒子、常磁性ゼオライト粒子、常磁性シリカ粒子、セルロース膜、シリカ膜、酢酸セルロースカラム、ナイロン膜カラム、PVDF膜カラム、ポリプロピレンカラム及び除去カラムからなる群から選択される1以上の材料を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)が、1以上の追加の成分を媒体、前記結合マトリックス及び前記配合物と混合することを更に含み、ここで1以上の追加の成分が、プロテイナーゼK、β-メルカプトエタノール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、ジチオスレイトール、1-チオグリセロール、ジギトニン、溶解液、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート、26-(4-ノニルフェノキシ)-3,6,9,12,15,18,21,24-オクタオキサヘキサコサン-1-オール及び4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- in vivo細胞環境に存在する核酸を結合マトリックスに結合させる方法であって、核酸及びin vivo細胞環境が媒体に含まれる方法において、核酸を含む媒体と結合マトリックス及び配合物とを混合する工程であって、前記配合物が、
(a)グアニジンチオシアナート;ならびに
(b)アセトアミド又は1以上のアセトアミド誘導体又はアセトアミド及び1以上のアセトアミド誘導体の組み合わせを含み、
前記配合物中に存在するグアニジンチオシアナート、アセトアミド、アセトアミド誘導体又はアセトアミド及びアセトアミド誘導体の組み合わせの量が、核酸をそのin vivo細胞環境から分離させ、結合マトリックスに結合させるのに十分であることを特徴とする方法。 - アセトアミド誘導体が、N-メチルアセトアミド及びN,N-ジメチルアセトアミドからなる群から選択される、請求項7記載の方法。
- 前記配合物中のグアニジンチオシアナートの濃度が、おおよそ1.7M〜おおよそ4.3Mであり、該配合物中のアセトアミド、アセトアミド誘導体又はアセトアミド及びアセトアミド誘導体の組み合わせの濃度が、おおよそ5.0M〜おおよそ7.5Mである、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記配合物中のグアニジンチオシアナートの濃度が、おおよそ4.0M〜おおよそ4.3Mであり、該配合物中のアセトアミド、アセトアミド誘導体又はアセトアミド及びアセトアミド誘導体の組み合わせの濃度が、おおよそ5.0M〜おおよそ7.1Mである、請求項9に記載の方法。
- 前記配合物と前記媒体との容量比が、1:1〜30:1であり、結合マトリックスと媒体との容量比が、0.005:1〜0.5:1である、請求項7、8、9又は10のいずれか1つに記載の方法。
- 前記配合物と前記媒体との容量比が、1.5:1〜8:1であり、前記結合マトリックスと前記媒体との容量比が、0.2:1〜0.4:1である、請求項11記載の方法。
- 前記結合マトリックスが、常磁性セルロース粒子、常磁性カルボキシセルロース粒子、常磁性シトラスペクチン粒子、常磁性リンゴペクチン粒子、常磁性ゼオライト粒子、常磁性シリカ粒子、セルロース膜、シリカ膜、酢酸セルロースカラム、ナイロン膜カラム、PVDF膜カラム及びポリプロピレンカラムからなる群から選択される1以上の材料を含む、請求項7、8、9、10、11又は12のいずれか1つに記載の方法。
- 結合マトリックス及び配合物を含むキットであって、前記配合物が、グアニジンチオシアナートならびに(i)アセトアミド又は(ii)1以上のアセトアミド誘導体又は(iii)アセトアミド及び1以上のアセトアミド誘導体の組み合わせを含み、ここで少なくとも1つの核酸を含む媒体が、結合マトリックス及び配合物と混合される場合、配合物中に存在するグアニジンチオシアナート及びアセトアミド、アセトアミド誘導体、又はアセトアミド及びアセトアミド誘導体の組み合わせの量が、核酸及びin vivo細胞環境が媒体に含まれるin vivo細胞環境に存在する核酸をそのin vivo細胞環境から分離させ、結合マトリックスに結合させるのに十分であることを特徴とするキット。
- 前記アセトアミド誘導体が、N-メチルアセトアミド及びN,N-ジメチルアセトアミドからなる群から選択される、請求項14記載のキット。
- 前記配合物中のグアニジンチオシアナートの濃度がおおよそ1.7M〜おおよそ4.3Mであり、配合物中のアセトアミド、アセトアミド誘導体又はアセトアミド及びアセトアミド誘導体の組み合わせの濃度が、おおよそ5.0M〜おおよそ7.5Mである、請求項14又は15に記載のキット。
- 前記配合物中のグアニジンチオシアナートの濃度が、おおよそ4.0M〜おおよそ4.3Mであり、該配合物中のアセトアミド、アセトアミド誘導体、又はアセトアミド及びアセトアミド誘導体の濃度の組み合わせが、おおよそ5.0M〜おおよそ7.1Mである、請求項14、15又は16のいずれか1項に記載のキット。
- 前記キットにおける結合マトリックスと配合物との容量比が、1:400〜1:1である、請求項14、15、16又は17のいずれか1つに記載のキット。
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