RU2653130C1 - Магнитный сорбент, способ его получения и способ выделения молекул нуклеиновых кислот - Google Patents
Магнитный сорбент, способ его получения и способ выделения молекул нуклеиновых кислот Download PDFInfo
- Publication number
- RU2653130C1 RU2653130C1 RU2017121208A RU2017121208A RU2653130C1 RU 2653130 C1 RU2653130 C1 RU 2653130C1 RU 2017121208 A RU2017121208 A RU 2017121208A RU 2017121208 A RU2017121208 A RU 2017121208A RU 2653130 C1 RU2653130 C1 RU 2653130C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- magnetic
- particles
- sorbent
- cations
- nucleic acids
- Prior art date
Links
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 86
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 84
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 82
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 48
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims abstract description 42
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 28
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 13
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 8
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 55
- -1 copper cations Chemical class 0.000 claims description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 239000011164 primary particle Substances 0.000 claims description 10
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 7
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- KBDIEUYACKKLIJ-UHFFFAOYSA-N 2-isocyanatoguanidine Chemical compound NC(=N)NN=C=O KBDIEUYACKKLIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000001132 ultrasonic dispersion Methods 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 239000002069 magnetite nanoparticle Substances 0.000 claims 1
- 229920002114 octoxynol-9 Polymers 0.000 claims 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 19
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride Chemical compound Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 2
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006104 solid solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 238000004438 BET method Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910001313 Cobalt-iron alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002546 FeCo Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N Lithium ion Chemical compound [Li+] HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001289 Manganese-zinc ferrite Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004125 X-ray microanalysis Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JIYIUPFAJUGHNL-UHFFFAOYSA-N [O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[Mn++].[Mn++].[Mn++].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Zn++].[Zn++] Chemical compound [O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[Mn++].[Mn++].[Mn++].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Zn++].[Zn++] JIYIUPFAJUGHNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDYRYUINDGQKMC-UHFFFAOYSA-M acetyloxyaluminum;dihydrate Chemical compound O.O.CC(=O)O[Al] HDYRYUINDGQKMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000005275 alloying Methods 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940009827 aluminum acetate Drugs 0.000 description 1
- 229910021486 amorphous silicon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000001636 atomic emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910001566 austenite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005536 corrosion prevention Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000005293 ferrimagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- WPIULSIZRNJJDL-UHFFFAOYSA-N guanidine;isocyanic acid Chemical compound N=C=O.NC(N)=N WPIULSIZRNJJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910001416 lithium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N octylphenoxy polyethoxyethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCO)C=C1 UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJCDFVKYMIUXCR-UHFFFAOYSA-N oxobarium;oxo(oxoferriooxy)iron Chemical compound [Ba]=O.O=[Fe]O[Fe]=O.O=[Fe]O[Fe]=O.O=[Fe]O[Fe]=O.O=[Fe]O[Fe]=O.O=[Fe]O[Fe]=O.O=[Fe]O[Fe]=O AJCDFVKYMIUXCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000001370 static light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28009—Magnetic properties
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/3085—Chemical treatments not covered by groups B01J20/3007 - B01J20/3078
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к выделению и очистке нуклеиновых кислот и их фрагментов из биологических образцов. Предложен магнитный сорбент для выделения и очистки нуклеиновых кислот, представляющий собой водную дисперсию, содержащую композиционный материал, который представляет собой наночастицы магнетита, допированного катионами меди, цинка и кобальта. Наночастицы распределены в матрице диоксида кремния. Упомянутая дисперсия содержит также хаотропный агент и реагент для увеличения ионной силы раствора. Технический результат заключается в повышении эффективности магнитного выделения нуклеиновых кислот, повышении селективности сорбции нуклеиновых кислот и/или фрагментов нуклеиновых кислот длиной более 500 п.н. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 4 табл., 9 пр.
Description
Изобретение относится к методам выделения и очистки нуклеиновых кислот и их фрагментов из образцов, в частности, биологических образцов.
Выделение нуклеиновых кислот из образца - важнейший этап подготовки биологических образцов для проведения биохимических и/или диагностических процессов, таких как амплификация, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, клонирование, секвенирование, гибридизация и др. Известны различные методы выделения нуклеиновых кислот (Basic DNA and RNA Protocols, Methods in Molecular Biology. V. 58 / Harwood A.J. (editor). New Jersey: Humana Press, Totowa, 1994, pp. 3-7), и выбор конкретного метода при проведении того или иного исследования осуществляют на основе таких факторов, как высокий выход целевой нуклеиновой кислоты, быстрота метода, высокая пропускная способность метода, высокая степень чистоты целевой нуклеиновой кислоты и др. (Klintschar М., Neuhuber F. Evaluation of an Alkaline Lysis Method for the Extraction of DNA from Whole Blood and Forensic Stains for STR Analysis // J. Forensic Sci. 2000, vol. 45, pp. 669-673).
Несмотря на известность множества методов выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов, основными недостатками большинства из них являются непригодность для автоматизации пробоподготовки и высокий риск контаминации белками, липидами, углеводами и другими примесями, которые могут препятствовать реализации необходимых реакций или методов исследования (Moss D., Harbison S.A., Saul D.J. An Easily Automated, Closed-Tube Forensic DNA Extraction Procedure Using a Thermostable Proteinase // Int. J. Legal Med. 2003, vol. 117, pp. 340-349; Buckingham L. and Flaws M.L. Molecular Diagnostics: Fundamentals, Methods, & Clinical Applications, F.A. Davis, Philadelphia, Pa, USA, 2007), а также обеспечиваемая сохранность выделенной нуклеиновой кислоты, необходимая для успешного проведения реакции или исследования (Cseke L.J., Kaufman Р.В., Podila G.K., and Tsai С.-J. Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine. // CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 2nd edition, 2004).
Все методы выделения нуклеиновых кислот по основным физическим и биохимическим признакам можно разделить на жидкофазные и твердофазные.
Известны твердофазные методы выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов, задействующие ионообмен в водном растворе на анионообменных материалах (Teeters М.А., Conrardy S.E., Thomas B.L., et al. Adsorptive Membrane Chromatography for Purification of Plasmid DNA // Journal of Chromatography A. 2003, vol. 989, pp. 165-173), водородные связи с немодифицированной гидрофильной матрицей, такой как матрица на основе кварца (Breadmore М.С., Wolfe K.А., Arcibal I.G., et al. Microchip-Based Purification of DNA from Biological Samples // Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 1880-1886), механизм исключения нуклеиновых кислот по размеру и др. Данные методы имеют существенные ограничения, в частности, не позволяют удалить из образца все возможные примеси (Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. Chelex 100 as a Medium for Simple Extraction of DNA for PCR Based Typing from Forensic material // BioTechniques. 1991. V. 10, N 4. P. 506-513).
Одним из наиболее эффективных методов выделения и очистки нуклеиновых кислот является сорбция нуклеиновых кислот из образца на поверхности частиц из диоксида кремния, диспергированных в растворе, содержащем хаотропный агент, например, гуанидин хлорид, гуанидин изотиоцианат, мочевина, йодид натрия и др. (K.-Н. Esser, W.Н. Marx, and Т. Lisowsky. Nucleic acid free matrix: regeneration of DNA binding columns. // BioTechniques, vol. 39, no. 2, pp. 270-271, 2005). Данный метод впервые был предложен Willem R. Boom (см. патент США US 5234809, 10.08.1993) и впоследствии нашел свое развитие в решениях других исследователей (патент США US 5973138, 26.10.1999; патент США US 5705628, 06.01.1998).
Хаотропные агенты обеспечивают разрушение клеточных мембран и лизис клеток образца с высвобождением нуклеиновой кислоты. Использование самого по себе хаотропного агента для выделения и очистки нуклеиновых кислот также было описано в публикации Vogelstein В., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. // Proceedings of the National Academy of Sciences, 1979, vol. 76, No. 2, pp. 615-619.
Метод, предложенный в патенте США US 5234809, включает в себя лизис клеточных мембран и внутриклеточных белков образца под действием высоких концентраций хаотропного агента в присутствии протеаз и смешивание образца с частицами диоксида кремния в присутствии высоких концентраций хаотропного агента, сопровождающееся обратимым связыванием нуклеиновых кислот образца с частицами, с последующим сбором частиц, например, при помощи пипетора Таджима (патент США US 5702950, 30.12.1997; патент США US 6331277, 18.12.2001) и отмывкой примесей хаотропным агентом с последующей отмывкой хаотропного агента 80%-м этанолом.
Описанные выше методы малопригодны для обработки большого количества образцов. Кроме того, они не обеспечивают возможность селективного выделения нуклеиновых кислот или фрагментов нуклеиновых кислот определенного вида или определенного размера.
Еще одним подходом к выделению нуклеиновых кислот из образца является использование сорбентов на основе материалов, обладающих магнитными свойствами. Использование таких сорбентов является надежным и простым способом выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов, позволяющим автоматизировать процедуру выделения в случае, когда необходима обработка большого числа образцов. Для выделения нуклеиновых кислот используют магнитные носители с иммобилизированными аффинными лигандами, или магнитные носители, изготовленные из биополимера, увеличивающего аффинность к нужной нуклеиновой кислоте, или магнитные носители, изготовленные из синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или на основе неорганических магнитных материалов, таких как оксид железа с модифицированной поверхностью. Создано множество коммерчески доступных сорбентов для выделения ДНК, РНК и плазмидной ДНК, например, частицы AGOWA® mag (Agowa, Германия), Dynabeads® DNA (Invitrogen, Норвегия), магнитные гранулы GenoPrep® DNA (Qiagen Company, Норвегия) и др. (Berensmeier S. Magnetic Particles for the Separation and Purification of Nucleic Acids // Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, Vol. 73, pp. 495-504).
Несмотря на известность большого числа методов выделения нуклеиновых кислот, значительную их часть составляют неселективные методы выделения, не позволяющие осуществлять сорбцию нуклеиновых кислот (или фрагментов нуклеиновых кислот) определенной длины. В частности, по-прежнему сохраняется потребность в расширении арсенала средств выделения нуклеиновых кислот на основе магнитных частиц, которые были бы пригодны для селективной экстракции фрагментов нуклеиновых кислот длиной более 500 пар нуклеотидов (далее - п.н.). Задача селективного выделения таких фрагментов является весьма актуальной, поскольку фрагменты молекул нуклеиновых кислот длиной более 500 п.н. широко используются для создания геномных библиотек для последующего секвенирования и т.д.
Среди прочих средств, обеспечивающих возможность автоматизации выделения нуклеиновых кислот из образца, используются магнитные частицы со стеклянным покрытием (Hoorfar J., Cook N., et al. Making Internal Amplification Control Mandatory for Diagnostic PCR. // J. Clin. Microbiol. 2003, V. 41, P. 5835). Образец, содержащий нуклеиновые кислоты, суспендируют совместно с частицами в водном растворе в присутствии магнитного поля. При этом нуклеиновая кислота связывается со стеклянным покрытием частиц. Затем, связанная с частицами, она проходит те же стадии экстракционного процесса, что и в методе по патенту США US 5234809: после серии отмывок в пробе остается нуклеиновая кислота, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Хотя такой метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к последующей амплификации нуклеиновых кислот и может быть легко модифицирован для использования на автоматизированных пипеттирующих рабочих станциях, при его реализации возможны потери целевых нуклеиновых кислот или фрагментов нуклеиновых кислот вследствие их необратимой сорбции на носителе, а также потери целевой нуклеиновой кислоты в процессе многочисленных отмывок, что особенно важно при работе с образцами, содержащими небольшие количества нуклеиновых кислот (Suffys Ph., Vanderborght P.R., Barros dos Santos P., et al. Inhibition of the Polymerase Chain Reaction by Sputum Samples from Tuberculosis Patients after Processing Using a Silica-guanidinium-thiocyanate DNA Isolation Procedure. // 
do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2001, vol. 96, №8, pp. 1137-1139).
В заявке на патент США US 20040126902, 01.07.2004 описан выбранный в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения магнитный сорбент на основе частиц ферромагнитного оксида железа, такого как маггемит (γ-Fe2O3), магнетит (Fe3O4) марганцево-цинкового феррита (Mn1-xZnxFe2O4), кобальто-железного сплава (FeCo) или бариевого феррита (BaFe12O19), диспергируемых в буфере, содержащем 1÷10 М хаотропного агента, и имеющих покрытие на основе диоксида кремния и соединения алюминия, а также способ выделения нуклеиновых кислот, использующий данный сорбент. Частицы сорбента характеризуются удельной намагниченностью насыщения 10÷80 А⋅м2/кг, коэрцитивной силой 0,80÷15,92 кА/м и средним размером частиц 0,1÷10 мкм. В наиболее предпочтительном варианте реализации известного решения соединение алюминия представляет собой оксид алюминия, такой как Al2O3, или соли алюминия, такие как алюминия хлорид, алюминия ацетат, алюминия сульфат и т.д.
Для указанного известного магнитного сорбента характерно неконтролируемое образование агломератов частиц еще до начала сорбции нуклеиновых кислот из образца, особенно в том случае, если параметры обработки магнитного сорбента при его изготовлении были нарушены (см. описание US 20040126902, абзацы [0130], [0135]). Такая неконтролируемая агломерация частиц магнитного сорбента приводит к уменьшению полезной сорбирующей поверхности частиц и снижению сорбции нуклеиновых кислот из образца. В свою очередь, высокая седиментационная устойчивость мелких частиц магнитного сорбента снижает эффективность полного отделения в магнитном поле частиц магнитного сорбента из среды, содержащей образец совместно с суспендированным в нем магнитным сорбентом. Еще одним недостатком магнитного сорбента согласно US 20040126902 является то, что он обеспечивает неспецифическую сорбцию всех разновидностей нуклеиновых кислот, содержащихся в образце, и не предоставляет возможности селективной сорбции и экстракции молекул нуклеиновых кислот и фрагментов молекул нуклеиновых кислот длиной около или более 500 п.н.
Кроме того, как показано в работе Zhongyuan Lv, Qi Wang, Yuezhen Bin, Ling Huang, Rong Zhang, Panpan Zhang, and Masaru Matsuo. Magnetic Behaviors of Mg- and Zn-Doped Fe3O4 Nanoparticles Estimated in Terms of Crystal Domain Size, Dielectric Response, and Application of Fe3O4/Carbon Nanotube Composites to Anodes for Lithium Ion Batteries // The Journal of Physical Chemistry C, 2015, 119 (46), p. 26128-26142, существует ограничение на количество вводимых допирующих ионов цинка Zn2+, обеспечивающих повышение удельной намагниченности магнитного сорбента, необходимой для более эффективной сорбции молекул нуклеиновой кислоты.
Задачей настоящего изобретения является создание магнитного сорбента, который устраняет перечисленные выше недостатки ближайшего аналога и других известных решений, а также обеспечивает селективную сорбцию молекул нуклеиновых кислот и/или фрагментов молекул нуклеиновых кислот длиной более 500 п.н.
Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности магнитного выделения нуклеиновых кислот и, дополнительно, повышении селективности сорбции нуклеиновых кислот и/или фрагментов нуклеиновых кислот длиной более 500 п.н.
Нуклеиновая кислота и/или фрагмент нуклеиновой кислоты может представлять собой плазмидную ДНК, геномную ДНК, кДНК, линейную ДНК, РНК, рибозим, аптамер либо рекомбинантную или полученную в результате химического синтеза нуклеиновую кислоту, либо их фрагмент.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается тем, что магнитный сорбент для выделения и очистки нуклеиновых кислот представляет собой водную дисперсию композиционного материала, состоящего из магнитных наночастиц, распределенных в матрице диоксида кремния, причем водная дисперсия содержит реагент для увеличения ионной силы раствора, хаотропный реагент и соосадитель нуклеиновых кислот (копреципитант).
Как показали многочисленные испытания, для магнитного сорбента согласно изобретению характерно управляемое и обратимое образование агломератов частиц сорбента (далее также «первичные частицы»). Кроме того, магнитный сорбент согласно изобретению отличается от аналогов, в частности ближайшего аналога, улучшенными магнитными характеристиками, такими как более высокая намагниченность конечных агломератов и коэрцитивная сила, большая удельная сорбирующая поверхность первичных частиц. В предпочтительном варианте исполнения изобретения первичные частицы имеют диаметр от 20 до 40 нм и, наиболее предпочтительно, удельную площадь поверхности от 215 до 310 м2/г, что обусловливает их особенно высокую сорбционную емкость по отношению к нуклеиновым кислотам.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация композиционного материала в водной дисперсии составляет 10÷100 г/л.
В качестве хаотропного агента могут быть использованы гуанидин изоцианат, гуанидин хлорид, мочевина, тиомочевина, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат (например, коммерчески доступный как TWEEN® 20), октилфеноксиполиэтоксиэтанол (например, коммерчески доступный как Triton® X-100) и др.
Далее, в отличие от магнитного сорбента согласно ближайшему аналогу, для магнитного сорбента согласно изобретению характерна контролируемая агломерация первичных частиц. Это достигается, в частности, введением в водную дисперсию реагента для увеличения ионной силы раствора. В качестве реагента для изменения ионной силы раствора предпочтительно использовать хлорид натрия, хлорид калия или хлорид магния. Дополнительно к этому агломерацию первичных частиц сорбента можно контролировать путем изменения путем изменения интенсивности механического воздействия на среду.
В качестве механического воздействия в предпочтительном, но не ограничивающем варианте исполнения изобретения могут использоваться обработка на магнитной или механической мешалке, обработка на шейкере, вортексирование. При этом в случае ослабления интенсивности механического воздействия на среду агрегация частиц усиливается вплоть до образования агломератов диаметром по меньшей мере 1 мкм, что упрощает и ускоряет последующее отделение частиц от жидкой фазы в присутствии магнитного поля. В случае же усиления интенсивности механического воздействия на среду агломераты частиц магнитного сорбента, напротив, распадаются до первичных частиц диаметром 20÷40 нм, для которых характерна высокая удельная площадь поверхности (от 215 до 310 м2/г) и высокая сорбционная емкость в отношении нуклеиновых кислот, в том числе в отношении молекул нуклеиновых кислот или фрагментов молекул нуклеиновых кислот длиной от 200 до 500 п.н.
Композиционный материал магнитного сорбента согласно изобретению представляет собой частицы, сформированные из магнитных наночастиц в матрице диоксида кремния. Слой диоксида кремния формируют любой подходящей методикой, описанной в уровне техники, в частности, путем гидролиза тетраэтилоксисилана (см. например, Boday, Dylan J.; Wertz, Jason Т.; Kuczynski, Joseph P. (2015). ''Functionalization of Silica Nanoparticles for Corrosion Prevention of Underlying Metal''. In: Kong, Eric S.W. Nanomaterials, Polymers and Devices: Materials Functionalization and Device Fabrication. John Wiley & Sons. pp. 121-140). В предпочтительном варианте исполнения изобретения частицы, образующие магнитный сорбент, содержат от 10 до 60 мас. % диоксида кремния.
В качестве соосадителя нуклеиновых кислот рамках настоящего изобретения могут быть использованы этанол, изопропанол, бутанол, полиэтиленгликоль, линейный полиакриламид, декстран, гликоген и др.
В предпочтительном варианте исполнения изобретения в качестве магнитных наночастиц используют магнетит (Fe3O4), допированный катионами цинка и меди, что обеспечивает дальнейшее увеличение намагниченности магнитных наночастиц и, как следствие, увеличение сорбции нуклеиновых кислот и/или их фрагментов из образца. Повышение величины намагниченности относительно ее значений для магнетита обеспечивается определенным соотношением ионов меди Cu2+ и цинка Zn2+, вводимых в магнетит. Хорошо известно, что магнетит имеет две подрешетки - А и В, образованные соответственно ионами железа Fe2+ и ионами железа Fe3+ (Григорьев В.М. Магнетит. Большая советская энциклопедия. // М.: Советская энциклопедия, 1969-1978). Также известно, что введение ионов металла, например ионов цинка Zn2+, в подрешетку А магнетита повышает его намагниченность (Lin С.Н., Kuo Р.С, Pan J.L., Huang D.R. Effects of Zn ion on magnetic properties of Fe3O4 magnetic colloids // Journal of Applied Physics. 1996. Vol. 79. P. 6035; Marand Z.R. el al. Study of magnetic and structural and optical properties of Zn doped Fe3O4 nanoparticles synthesized by co-precipitation method for biomedical application. // Nanomedicine Journal, vol. 1, No.4, Summer 2014, pp. 238-247).
Таким образом, упомянутый ранее эффект ограничения сорбции нуклеиновых кислот из раствора при помощи магнитных сорбентов (Zhongyuan Lv, et al., 2015), допированных только катионами цинка, может быть снижен и даже устранен дополнительным допированием катионами меди.
Как показали испытания, введение в кристаллическую решетку магнетита катионов металлов может приводить к увеличению намагниченности магнетита без ухудшения сорбционных свойств магнитного сорбента по отношению к нуклеиновым кислотам или фрагментам нуклеиновых кислот, в том числе длиной по меньшей мере 500 н.п. Так, согласно еще одному варианту исполнения изобретения, указанный дополнительный эффект достигается за счет того, что наряду с катионами цинка в кристаллическую решетку магнетита вводят катионы меди и катионы кобальта, причем является предпочтительным, если катионы меди и цинка вводятся в подрешетку А магнетита, а катионы кобальта - в подрешетку В магнетита.
Предположительно, этот эффект объясняется тем, что ионы меди Cu2+, будучи легче ионов цинка Zn2+ и имеющие меньший ионный радиус, замещают катионы железа в подрешетке А при соблюдении определенного соотношения катионов цинка и ионов меди, тогда как ионы кобальта Со2+, снижая суперобменное взаимодействие между ионами Fe3+ в подрешетке В магнетита, обеспечивают возможность дополнительного влияния ионов Cu2+ и Zn2+ на рост намагниченности частиц.
Предпочтительно, если магнитная составляющая композиционного материала, т.е. магнитные наночастицы, представляет собой частицы наноразмерного магнетита диаметром 5÷10 нм. Согласно приведенным выше вариантам исполнения изобретения, частицы наноразмерного магнетита могут быть допированы как ионами меди Cu2+ и цинка Zn2+, так и ионами кобальта Со2+, меди Cu2+ и цинка Zn2+. Во втором, наиболее предпочтительном варианте указанный наноразмерный магнетит характеризуется формулой CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4 и обладает ферримагнитными свойствами.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения для наноразмерного магнетита CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4 значение x лежит в диапазоне от 0,003 до 0,084, значение y - от 0,003 до 0,084, значение z - от 0,0465 до 0,093. Содержание катионов меди, предпочтительно, составляет от 0,1 до 2,8 атомных процента (далее - ат. %), катионов цинка - от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов кобальта - от 1,5 до 3 ат. %. Предлагаемое отношение допирующих ионов Cu2+, Zn2+ и Со2+ обеспечивает возможность осуществления процесса обратимого управляемого образования агломератов частиц из наноразмерного магнетита, допированного катионами кобальта, меди и цинка, причем указанные агломераты в наиболее предпочтительном воплощении имеют диаметр по меньшей мере 1 мкм.
В одном из предпочтительных воплощений изобретения удельная намагниченность частиц наноразмерного магнетита составляет не менее 75 А⋅м2/кг, но не более 95 А⋅м2/кг. В другом предпочтительном воплощении изобретения указанная удельная намагниченность составляет от 70 до 85 А⋅м2/кг либо от 70 до 95 А⋅м2/кг.
Предпочтительно, если частицы наноразмерного магнетита характеризуются коэрцитивной силой от 10 до 15 кА/м, а их остаточная намагниченность составляет до 25 А⋅м2/кг.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения описанного выше магнитного сорбента для выделения и очистки нуклеиновых кислот. Согласно изобретению, указанный способ включает получение композиционного материала, состоящего из магнитных наночастиц, распределенных в матрице диоксида кремния, и получение водной дисперсии указанного композиционного материала, также содержащей реагент для увеличения ионной силы раствора и соосадитель нуклеиновых кислот - копреципитанта.
Описанные выше варианты исполнения магнитного сорбента согласно изобретению и обеспечиваемые ими преимущества в сравнении с известными из уровня техники в полной мере применимы и к описанию способа получения магнитного сорбента. Так, предпочтительно, если в качестве магнитных частиц используют частицы наноразмерного магнетита.
Указанные частицы наноразмерного магнетита могут быть допированы катионами цинка и меди либо, что более предпочтительно, катионами кобальта, цинка и меди. Во втором случае является предпочтительным, если катионы цинка и меди вводят в подрешетку А частиц наноразмерного магнетита, а катионы кобальта вводят в подрешетку В частиц наноразмерного магнетита.
При допировании частиц наноразмерного магнетита катионами кобальта, цинка и меди магнетит характеризуется формулой CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4, где предпочтительные значения индексов следующие: x - от 0,003 до 0,084, y - от 0,003 до 0,084, z - от 0,0465 до 0,093.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения катионов меди составляет от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов цинка - от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов кобальта - от 1,5 до 3 ат. %.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ выделения молекул нуклеиновых кислот, заключающийся в добавлении эффективного количества суспензии подробно описанного выше магнитного сорбента к образцу нуклеиновой кислоты, инкубирование полученной смеси, отделение твердой фазы с адсорбированными молекулами нуклеиновых кислот. Под выделением молекул нуклеиновых кислот может пониматься, в частности, сорбция молекул нуклеиновых кислот.
На стадии отделения твердой фазы с адсорбированными молекулами нуклеиновых кислот в рамках настоящего изобретения могут формировать агломераты частиц сорбента диаметром по меньшей мере 1 мкм.
Формирование агломератов контролируют методом изменения ионной силы раствора, или методом изменения интенсивности механического воздействия на среду, или комбинацией указанных методов. В случае использования метода изменения интенсивности механического воздействия целесообразно магнитную мешалку, или механическую мешалку, или производить обработку на шейкере, или применять вортексирование.
Приведенные далее примеры раскрывают один из предпочтительных вариантов осуществления изобретения с использованием в качестве магнитных частиц наноразмерного магнетита CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4. Данные примеры, однако, не должны рассматриваться как ограничивающие объем притязаний.
Пример 1. Синтез магнитного сорбента.
В качестве магнитной составляющей сорбента (магнитных наночастиц) использовали частицы наноразмерного магнетита с формулой CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4 при следующем содержании металлов (ат. %): Zn - 2,8; Со - 2,8; Cu - 3,1; Fe - 91,3. Для их получения растворяли 10 г Fe(NO3)3⋅9Н2O, 3,76 г FeSO4⋅7H2O, 2,6 г безводного цитрата натрия и 0,1 г карбоксиметилцеллюлозы в 150 мл дистиллированной воды. Раствор дополнительно выдерживали на магнитной мешалке в течение 20 мин. К полученному раствору приливали раствор, содержащий Zn(NO3)2, Со(NO3)2 и Cu(NO3)3 в количествах, соответствующих составу материала. Общая концентрация солей составляла примерно 1 моль/л. В полученную смесь при интенсивном перемешивании капельно приливали раствор, содержащий NaOH и триэтаноламин с концентрациями соответственно 0,1 и 0,05 моль/л до достижения рН ~ 9,2. Наблюдали выпадение черного осадка, который последовательно отмывали пять раз 1% раствором NaCl и три раза дистиллированной водой методом магнитной декантации с использованием постоянного магнита с индукцией 2 Тл.
Для формирования частиц, образующих композиционный материал, готовили 300 мл суспензии синтезированных на предыдущей стадии частиц наноразмерного магнетита в 70% этаноле. При постоянном перемешивании в герметичной колбе на 500 мл в суспензию последовательно вводили 0,5 г поливинилового спирта, 0,58 мл тетраметилортосилоксана (ТМОС) и 1 мл концентрированной соляной кислоты (HCl) как катализатора гидролиза ТМОС. Полученную смесь подвергали ультразвуковой обработке с частотой 44 кГц в течение 30 мин. при охлаждении и выдерживали в течение 9 часов для завершения процесса гидролиза. Осадок последовательно отмывали три раза 70% раствором этанола, пять раз 1% раствором NaCl и три раза дистиллированной водой методом магнитной декантации с использованием постоянного магнита.
Химический состав полученных частиц композиционного материала характеризуется формулой [CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4]*SiO2 при содержании SiO2 25 мол. % относительно оксидной фазы.
Пример 2. Структурные и функциональные свойства магнитного сорбента.
По данным рентгенофазового анализа и ИК-спектроскопии частицы твердой фазы магнитного сорбента, полученного в Примере 1, представлены аморфной матрицей SiO2 с распределенными в ней частицами твердого раствора замещения CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4.
Согласно элементному анализу методами рентгеновского микроанализа и атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой, состав твердого раствора отвечает формуле Co0,084Zn0,084Cu0,093Fe2,739O4, что соответствует введенному в кристаллическую решетку наноразмерного магнетита количеству легирующих металлов. По данным просвечивающей электронной микроскопии композиционный материал магнитного сорбента представлен наноразмерными частицами с формой, близкой к сферической, и диаметром 20÷30 нм. Удельная площадь поверхности полученного порошкообразного магнитного сорбента составляет 310 м2/г (оценка по методу БЭТ; см.: Brunauer, Stephen; Emmett, P.H.; Teller, Edward (1938). Adsorption of Gases in Multimolecular Layers. // Journal of the American Chemical Society, vol. 60, №2, pp. 309-319). Удельная намагниченность насыщения магнитного сорбента составляет 82 А⋅м2/кг, коэрцитивная сила - 15 кА/м, остаточная намагниченность - 23 А⋅м2/кг.
Пример 3. Характеристика процессов агрегации и дезагрегации в суспензии магнитного сорбента.
Как было указано в Примере 2, наноразмерные частицы магнитного сорбента, полученного в Примере 1, по данным электронной микроскопии имеют размер 20÷30 нм, что обеспечивает их высокую сорбционную емкость. Методом лазерной дифракции (статического рассеяния света) установлено, что после умеренного перемешивания суспензии магнитного сорбента в растворе NaCl (15 г/л) размер частиц твердой фазы составляет примерно 1,35 мкм, что свидетельствует об образовании агломератов. Такие агломераты быстро и полно сепарируются в поле стандартного магнитного штатива на стадии отделения магнитного сорбента от жидкой фазы. Наличие агломератов со средним диаметром примерно 1,3 мкм подтверждают данные сканирующей электронной микроскопии. Похожие результаты (около 1,4 мкм) для данной суспензии получены на основании седиментационного анализа, выполненного с помощью фотометрической фиксации скорости оседания частиц. Для доказательства обратимого характера агломерации изучаемую суспензию подвергали интенсивному встряхиванию или ультразвуковому диспергированию. Результаты дисперсионного анализа суспензии методом лазерной дифракции свидетельствуют о том, что в обоих случаях произошло разрушение агломератов до частиц с гидродинамическим диаметром соответственно примерно 65 и 60 нм. Эти значения хорошо согласуются с размерами первичных частиц. Завышенные результаты дифракционного анализа по сравнению с электронно-микроскопическим анализом являются закономерными и объясняются наличием объемной гидратной оболочки магнитных наночастиц, уменьшающей скорость их диффузии. Методом лазерной дифракции также установлено время, необходимое для образования агломератов после их разрушения. Оно составило примерно 3 мин., что достаточно для установления равновесия в системе магнитный сорбент - молекулы нуклеиновых кислот для большинства методик выделения с помощью магнитных сорбентов. Таким образом, были разработаны условия (определенные размер первичных частиц, намагниченность, коэрцитивная сила, ионная сила дисперсионной среды), которые позволяют осуществлять обратимую регулируемую агломерацию частиц на разных стадиях выделения нуклеиновых кислот за счет изменения интенсивности механического воздействия на суспензию.
Пример 4. Приготовление лизирующего буфера для выделения геномной ДНК.
К 2 г полиэтиленгликоля (PEG) добавили 500 мл 0,9% раствора хлорида натрия; смесь перемешивали до полного растворения PEG. Затем добавили 5 г гуанидина изоцианата, и перемешивание продолжали до полного растворения твердого осадка. Общий объем раствора довели до 100 мл 0,9% раствором хлорида натрия.
Пример 5. Приготовление лизирующего буфера для селективного выделения высокомолекулярной ДНК.
К 18 г полиэтиленгликоля (PEG) добавили 20 мл 5М раствора хлорида натрия, 100 мкл Твин-20, 1 мл Трис-HCl (1М, рН=8) и 200 мкл 0,5М ЭДТА. Смесь перемешивали до полного растворения PEG. Общий объем раствора довели до 100 мл деионизованной водой.
Пример 6. Приготовление суспензии магнитного сорбента.
К 4 г магнитного сорбента из Примера 1 добавили небольшое количество лизирующего буфера из Примера 5. Смесь перетирали шпателем до получения густой суспензии, к которой затем добавляли лизирующий буфер до достижения общего объема 100 мл. Полученную смесь встряхивали на вортексе до образования однородной суспензии.
Пример 7. Сорбция геномной ДНК человека.
Сорбцию проводили из стандартизированных образцов ДНК человека с концентрациями C1=500 нг/мкл, С2=250 нг/мкл, С3=50 нг/мкл, С4=5 нг/мкл. Для этого к 100 мкл образца ДНК добавляли 5 мкл суспензии магнитного сорбента из Примера 6 и 900 мкл лизирующего буфера из Примера 4. Смесь выдерживали пять минут при 60°С, после чего магнитные частицы с сорбированной ДНК отделяли в поле стандартного магнитного штатива, супернатант отбрасывали. К остатку добавляли 500 мкл 70% раствора этанола. Суспензию встряхивали, супернатант отбрасывали. Аналогичным образом частицы промывали в 200 мкл ацетона. Магнитный сорбент сушили в течение двух минут при 60°С. Сорбированную ДНК элюировали 100 мкл ТЕ-буфера (рН=8,0) в течение пяти минут при 60°С. Затем элюированную ДНК отбирали в чистую пробирку.
В качестве набора сравнения использовали набор реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «МАГНО-сорб» производства ФБУН «Центральный НИИ Эпидемиологии Росздравнадзора». Выделение ДНК проводили согласно инструкции по применению комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «МАГНО-сорб» производителя (см. www.interlabservice.ru/upload/iblock/5c7/МАГНО-copб (зарегистр)_ LA_160117.pdf).
Пример 8. Оценка количества выделенной ДНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Приготовили реакционную смесь согласно Таблице 1. В качестве специфичных олигонуклеотидов использовали праймеры и флуоресцентный зонд, специфичные к гену альбумина человека. Использовали реагенты для ПЦР (ПЦР буфер, смесь дНТФ и полимеразу с «горячим стартом») производства АО «Евроген». Реакцию ПЦР проводили на амплификаторе ДТ-Прайм производства ООО «ДНК-Технология». Протокол амплификации приведен в Таблице 2. Значения пороговых циклов для исходных образцов ДНК и образцов, полученных в результате выделения на исследуемом сорбенте или на наборе сравнения, представлены в Таблице 3.
Как следует из Таблицы 3, синтезированный магнитный сорбент проявляет эффективность сорбции геномной ДНК, схожую с таковой для сорбента сравнения.
Пример 9. Селективная сорбция высокомолекулярных фрагментов ДНК.
В качестве модельного раствора фрагментированной ДНК использовали маркер длины ДНК GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (ThermoFisher Scientific Inc, США), содержащий фрагменты синтетической ДНК от 100 до 3000 пар оснований. К 20 мкл раствора маркера длины ДНК добавляли различные объемы суспензии магнитного сорбента (от 50 мкл - 2.5 х, до 8 мкл - 0.4 х), приготовленной согласно Примеру 6 с использованием лизирующего буфера из Примера 5. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение пяти минут, после чего магнитные частицы с сорбированными фрагментами ДНК отделяли в поле стандартного магнитного штатива и супернатант отбрасывали. К остатку добавляли 500 мкл 70% раствора этанола. Суспензию встряхивали, спиртовой раствор отбрасывали. Аналогичным образом частицы промывали в 200 мкл ацетона. Магнитный сорбент сушили в течение двух минут при 60°С. Сорбированную ДНК элюировали 50 мкл ТЕ-буфера (рН=8,0) в течение пяти минут при 60°С. Затем элюированную ДНК отбирали в чистую пробирку.
Для проведения электрофореза отбирали от супернатанта и элюата по 20 мкл раствора и смешивали с 1 мкл буфера для загрузки в гель DNA Gel Loading Dye, 6Х (ThermoFisher Scientific Inc, США). Образцы наносили на 1,5% агарозный гель и проводили электрофорез при напряжении 100 В в течение 60 мин. Результаты суммированы в Таблице 4.
Как следует из Таблицы 4, синтезированный магнитный сорбент в присутствии определенных концентраций соосадителя ДНК (полиэтиленгликоля) способен селективно сорбировать фрагменты ДНК размером более 500 п.н. При этом исходный раствор обогащается низкомолекулярными фрагментами ДНК размером менее 500 п.н.
Claims (19)
1. Магнитный сорбент для выделения и очистки нуклеиновых кислот, представляющий собой водную дисперсию, содержащую композиционный материал, представляющий собой наночастицы магнетита, допированного катионами меди, цинка и кобальта, общей формулы CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4, где х составляет от 0,003 до 0,084, у составляет от 0,003 до 0,084, z составляет от 0,0465 до 0,093, причем указанные наночастицы распределены в матрице диоксида кремния и причем указанная дисперсия содержит хаотропный агент и реагент для увеличения ионной силы раствора.
2. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что первичные частицы сорбента имеют размер 20÷40 нм.
3. Магнитный сорбент по п. 2, отличающийся тем, что первичные частицы сорбента имеют удельную площадь поверхности от 215 до 310 м2/г.
4. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что концентрация композиционного материала в водной дисперсии составляет 10÷100 г/л.
5. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что в качестве хаотропного реагента используется гуанидин изоцианат, гуанидин хлорид, мочевина, тиомочевина, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат, t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол.
6. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что реагент для увеличения ионной силы раствора представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или хлорид магния.
7. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что содержание катионов меди составляет 0,1÷2,8 ат. %, катионов кобальта - 1,5÷3 ат. %, катионов цинка - 0,1÷2,8 ат. %.
8. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что магнитные частицы являются частицами наноразмерного магнетита размером менее 10 нм.
9. Магнитный сорбент по п. 8, отличающийся тем, что намагниченность частиц наноразмерного магнетита составляет не менее 75 А⋅м2/кг, но не более 95 А⋅м2/кг.
10. Магнитный сорбент по п. 8, отличающийся тем, что частицы наноразмерного магнетита характеризуются коэрцитивной силой 10÷15 кА/м и остаточной намагниченностью до 25 А⋅м2/кг.
11. Способ получения магнитного сорбента по любому из пп. 1-10, включающий: (а) стадию формирования композиционного материала, представляющего собой водную дисперсию наночастиц магнетита, допированного катионами меди, цинка и кобальта, общей формулы CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4, где х составляет от 0,003 до 0,084, у составляет от 0,003 до 0,084, z составляет от 0,0465 до 0,093, распределенных в матрице диоксида кремния, где стадия формирования указанного композиционного материала включает в себя распределение частиц наноразмерного магнетита в матрице диоксида кремния, (б) введение в указанную водную дисперсию хаотропного агента и реагента для увеличения ионной силы раствора, и (в) ультразвуковую обработку указанной водной дисперсии.
12. Способ по п. 11, в котором катионы цинка и меди входят в подрешетку А частиц наноразмерного магнетита, а катионы кобальта входят в подрешетку В частиц наноразмерного магнетита.
13. Способ по п. 11, в котором содержание катионов меди составляет от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов цинка - от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов кобальта - от 1,5 до 3 ат. %.
14. Способ выделения нуклеиновых кислот, заключающийся в добавлении эффективного количества суспензии магнитного сорбента в лизирующем буфере к образцу, содержащему нуклеиновую кислоту, инкубирование полученной смеси, отделение твердой фазы с адсорбированными нуклеиновыми кислотами, добавление соосадителя (копреципитанта) и промывку указанной твердой фазы при механическом воздействии с последующим высушиванием промытой твердой фазы и элюированием из промытой твердой фазы адсорбированного продукта буферным раствором, отличающийся тем, что в качестве магнитного сорбента используют магнитный сорбент по любому из пп. 1-10.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что в качестве копреципитанта (соосадителя) используют этанол, изопропанол, бутанол, полиэтиленгликоль, линейный полиакриламид, декстран или гликоген.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что в качестве соосадителя используют этанол.
17. Способ по п. 14, в котором на стадии отделения твердой фазы с адсорбированными молекулами нуклеиновых кислот формируют агломераты частиц сорбента диаметром по меньшей мере 1 мкм.
18. Способ по п. 17, в котором формирование агломератов контролируют изменением ионной силы раствора, или изменением интенсивности механического воздействия на среду, или обоими путями.
19. Способ по п. 18, в котором изменение интенсивности механического воздействия осуществляют с использованием магнитной мешалки, механической мешалки, обработкой на шейкере, вортексированием или ультразвуковым диспергированием.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017121208A RU2653130C1 (ru) | 2017-06-16 | 2017-06-16 | Магнитный сорбент, способ его получения и способ выделения молекул нуклеиновых кислот |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017121208A RU2653130C1 (ru) | 2017-06-16 | 2017-06-16 | Магнитный сорбент, способ его получения и способ выделения молекул нуклеиновых кислот |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2653130C1 true RU2653130C1 (ru) | 2018-05-07 |
Family
ID=62105650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017121208A RU2653130C1 (ru) | 2017-06-16 | 2017-06-16 | Магнитный сорбент, способ его получения и способ выделения молекул нуклеиновых кислот |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2653130C1 (ru) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1797253A1 (ru) * | 1990-05-14 | 1996-01-10 | Волгоградский медицинский институт | Способ очистки крови от антител к нативной днк |
| RU2119954C1 (ru) * | 1996-12-27 | 1998-10-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных | Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот |
| US20040126902A1 (en) * | 2002-06-27 | 2004-07-01 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Magnetic carrier for biological substance, production method thereof and isolation method of biological substance using same |
| RU2232768C2 (ru) * | 2002-10-02 | 2004-07-20 | Лактионов Павел Петрович | Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот |
| RU2382018C2 (ru) * | 2007-09-28 | 2010-02-20 | ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт химических продуктов" (ФГУП "ГосНИИХП") | Способ получения сферического пороха |
| RU2485178C2 (ru) * | 2011-07-12 | 2013-06-20 | Олег Евгеньевич Аникеев | Способ выделения днк |
| RU2015123155A (ru) * | 2015-06-17 | 2017-01-10 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики" (Университет ИТМО) | Гидрозоль магнетита, биокомпозит с энтрапированными в магнетит биомолекулами и способы их получения и применения |
-
2017
- 2017-06-16 RU RU2017121208A patent/RU2653130C1/ru active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1797253A1 (ru) * | 1990-05-14 | 1996-01-10 | Волгоградский медицинский институт | Способ очистки крови от антител к нативной днк |
| RU2119954C1 (ru) * | 1996-12-27 | 1998-10-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных | Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот |
| US20040126902A1 (en) * | 2002-06-27 | 2004-07-01 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Magnetic carrier for biological substance, production method thereof and isolation method of biological substance using same |
| RU2232768C2 (ru) * | 2002-10-02 | 2004-07-20 | Лактионов Павел Петрович | Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот |
| RU2382018C2 (ru) * | 2007-09-28 | 2010-02-20 | ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт химических продуктов" (ФГУП "ГосНИИХП") | Способ получения сферического пороха |
| RU2485178C2 (ru) * | 2011-07-12 | 2013-06-20 | Олег Евгеньевич Аникеев | Способ выделения днк |
| RU2015123155A (ru) * | 2015-06-17 | 2017-01-10 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики" (Университет ИТМО) | Гидрозоль магнетита, биокомпозит с энтрапированными в магнетит биомолекулами и способы их получения и применения |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ВЕДЕРНИКОВ В.Е., Сравнительная характеристка способов экстракции нуклеиновых кислот, Лаборатория, 4, 2012, с. 14-15. * |
| НАТАРОВ В.О. и др., Магнитные сорбенты на основе нанокомпозитных частиц для выделения и очистки ДНК/РНК, Свиридовские чтения, сб.ст., вып. 11, Минск, 2015, 1-10. * |
| НАТАРОВ В.О. и др., Магнитные сорбенты на основе нанокомпозитных частиц для выделения и очистки ДНК/РНК, Свиридовские чтения, сб.ст., вып. 11, Минск, 2015, 1-10. ВЕДЕРНИКОВ В.Е., Сравнительная характеристка способов экстракции нуклеиновых кислот, Лаборатория, 4, 2012, с. 14-15. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8288169B2 (en) | Surface mediated self-assembly of nanoparticles | |
| JP2965131B2 (ja) | 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法 | |
| CN109182327B (zh) | 磁性纳米粒子在核酸提取中的应用及其制备方法 | |
| KR101646610B1 (ko) | 생체 물질 정제용 고활성 실리카 자성나노입자 및 이의 제조 방법 | |
| US8323899B2 (en) | Silica magnetic particles with a high nucleic acid binding capacity | |
| CN109055359B (zh) | 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法 | |
| WO2014063651A1 (zh) | 纯化核酸的方法及试剂盒 | |
| WO1998031461A1 (en) | Silica adsorbent on magnetic substrate | |
| US20220372471A1 (en) | Apparatuses systems and methods for enrichment and separation of nucleic acids by size | |
| JP5183905B2 (ja) | 担体、担体の製造方法、およびその利用 | |
| JP2020530764A (ja) | 固相抽出材及び核酸の濃縮・検出におけるその応用 | |
| WO2016084945A1 (ja) | グラフェンオキサイド及び／又はグラファイトオキサイド並びにセルロースを含む粒子、核酸抽出用組成物、核酸抽出方法、及び粒子又は核酸抽出用組成物のリサイクル方法 | |
| JP2009065849A (ja) | 核酸の抽出方法 | |
| WO2015159979A1 (ja) | 短鎖核酸の回収方法 | |
| RU2653130C1 (ru) | Магнитный сорбент, способ его получения и способ выделения молекул нуклеиновых кислот | |
| JPH11313670A (ja) | 磁性担体、その製造方法及びこれを用いた核酸抽出方法 | |
| JP2006280277A (ja) | 核酸の抽出方法 | |
| JP4220164B2 (ja) | 核酸の精製方法および当該方法に用いる核酸抽出用溶液ならびに核酸精製用試薬キット | |
| JP6629185B2 (ja) | 核酸抽出方法及び試薬 | |
| CN109337309B (zh) | 储水多孔二氧化硅磁性颗粒及其制备工艺与应用 | |
| JP5007920B2 (ja) | 核酸抽出方法、がん細胞検出方法および磁気ビーズ | |
| US20220371026A1 (en) | Apparatuses systems and methods using core-shell-shell magnetic beads | |
| EP2131937A2 (en) | Surface mediated self-assembly of nanoparticles | |
| WO2020069385A1 (en) | Isolation of dna and rna from a single sample | |
| JPH11262387A (ja) | 核酸結合性磁性担体およびそれを用いた核酸単離方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |