JP2021133347A - 核酸吸着材 - Google Patents
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Abstract
【課題】安価であり、核酸を高純度かつ高収率で回収することができる核酸吸着材を提供する。【解決手段】Ａｌ２Ｏ３が３０ｗｔ％以上であり、１８０℃以上で乾熱滅菌された火山灰土壌の粒径０．５ｍｍ以下の粉末を用いた。
Description
本発明は、核酸を高純度かつ高収率で回収する核酸吸着材に関する。
近年の遺伝子解析技術の発展により、医学、獣医学、農学等の様々な分野においても遺伝子解析が行われている。例えば、医学分野においては、遺伝子解析によりがん等の疾患の原因となっているタンパク質やその基となる遺伝子が解明されたことにより、これらのタンパク質や遺伝子に特異的に作用する分子標的薬が開発されている。
遺伝子解析を行うためには、生物材料からＤＮＡ（デオキシリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）等の核酸の抽出を行う必要があるが、抽出された遺伝子の検出反応を高感度なものとするためには、核酸を高純度かつ高収率で回収することが求められる。
代表的な核酸の回収方法であるブーム法においては、シリカを含む金属酸化物を吸着材として核酸を吸着、溶出させることにより核酸を回収する。しかし、ブーム法においては、吸着材に対する核酸の吸着過程において有機溶媒やカオトロピック剤等の使用が不可欠であるため、使用後の溶媒廃棄等の問題があるだけでなく、核酸を溶出させる前にアセトンを含有したアルコール溶液で吸着材を洗浄する必要があり、核酸の回収までの操作が煩雑となっていた。
そこで、特許文献１に示されるように、吸着材として酸化アルミニウムを用いることにより、有機溶媒等を使用することなく吸着材に対して核酸を強固に吸着させる核酸の回収方法が知られている。また、従来、吸着材として酸化アルミニウムを用いた場合、吸着材に対して核酸が強固に吸着されることにより、吸着材を繰り返し洗浄しても核酸が溶出せず、核酸の回収率が低くなることがあったが、特許文献１の核酸の回収方法においては、酸化アルミニウムの表面にポリエチレングリコール等の水溶性の中性ポリマーを吸着させて酸化アルミニウムの表面を部分的に被覆することにより、核酸の溶出効率が高められている。
しかしながら、特許文献１においては、例えば酸化アルミニウムを中性ポリマー溶液に浸漬させる、または酸化アルミニウムに中性ポリマー溶液を噴霧することにより、酸化アルミニウムの表面に中性ポリマーを吸着させる必要があり、吸着材の作成に手間とコストがかかるものであった。また、吸着材に吸着された核酸を溶出させる際に、核酸と共に中性ポリマーの一部が溶出する虞があり、回収液における核酸の純度が低くなっていた。
発明者らは、特定の火山性土壌、特に特定の鬼界アカホヤ火山灰土壌由来の多孔質粉末が核酸の吸着性能および回収性能に優れることを見出した。
本発明は、このような問題点に着目してなされたもので、安価であり、核酸を高純度かつ高収率で回収することができる核酸吸着材を提供することを目的とする。
前記課題を解決するために、本発明の核酸吸着材は、
Ａｌ２Ｏ３が３０ｗｔ％以上であり、１８０℃以上で乾熱滅菌された火山灰土壌の粒径０．５ｍｍ以下の粉末を用いたことを特徴としている。
この特徴によれば、核酸吸着材は火山灰土壌を乾熱滅菌することにより得られるため安価であり、無数の細孔により大きな比表面積を有し、その表面にＡｌ２Ｏ３がまだら状に分散・露出された構造であることから、核酸のリン酸基が細孔表面に露出したＡｌ２Ｏ３と反応して多くの核酸を吸着することができるとともに、核酸にはホスホジエステル結合を形成する複数のリン酸基があり、そのうちの幾つかが細孔表面に露出したＡｌ２Ｏ３と反応することで弱く吸着されることにより、核酸の溶出効率を高めることができるため、核酸を高収率で回収することができる。また、核酸吸着材は粒径０．５ｍｍ以下の粉末であり、核酸は径が小さく長いポリマー構造であることから、核酸の一部が細孔内に弱く吸着された状態で、複数の粒子により複合的に吸着することができるため、核酸の吸着性能を高めることができる。加えて、核酸吸着材に火山灰土壌を乾熱滅菌したものを用いることにより、火山灰土壌中の細菌由来の核酸が除去されるとともに、不純物の溶出が防止されるため、目的の核酸を高純度で回収することができる。
Ａｌ２Ｏ３が３０ｗｔ％以上であり、１８０℃以上で乾熱滅菌された火山灰土壌の粒径０．５ｍｍ以下の粉末を用いたことを特徴としている。
この特徴によれば、核酸吸着材は火山灰土壌を乾熱滅菌することにより得られるため安価であり、無数の細孔により大きな比表面積を有し、その表面にＡｌ２Ｏ３がまだら状に分散・露出された構造であることから、核酸のリン酸基が細孔表面に露出したＡｌ２Ｏ３と反応して多くの核酸を吸着することができるとともに、核酸にはホスホジエステル結合を形成する複数のリン酸基があり、そのうちの幾つかが細孔表面に露出したＡｌ２Ｏ３と反応することで弱く吸着されることにより、核酸の溶出効率を高めることができるため、核酸を高収率で回収することができる。また、核酸吸着材は粒径０．５ｍｍ以下の粉末であり、核酸は径が小さく長いポリマー構造であることから、核酸の一部が細孔内に弱く吸着された状態で、複数の粒子により複合的に吸着することができるため、核酸の吸着性能を高めることができる。加えて、核酸吸着材に火山灰土壌を乾熱滅菌したものを用いることにより、火山灰土壌中の細菌由来の核酸が除去されるとともに、不純物の溶出が防止されるため、目的の核酸を高純度で回収することができる。
前記火山灰土壌は、Ｆｅ２Ｏ３が３〜８ｗｔ％である鬼界アカホヤ火山灰土壌であることを特徴としている。
この特徴によれば、Ａｌ２Ｏ３の割合がＦｅ２Ｏ３に比べ３倍以上と多く、アルミニウムイオンがリン酸基と反応して錯体を形成しやすいため、リン酸基を含む核酸の吸着能力に優れる。
この特徴によれば、Ａｌ２Ｏ３の割合がＦｅ２Ｏ３に比べ３倍以上と多く、アルミニウムイオンがリン酸基と反応して錯体を形成しやすいため、リン酸基を含む核酸の吸着能力に優れる。
前記火山灰土壌は、ＳｉＯ２が３９〜６５ｗｔ％、Ａｌ２Ｏ３が３１〜４５ｗｔ％、Ｆｅ２Ｏ３が３〜８ｗｔ％、その他が０〜２２ｗｔ％からなることを特徴としている。
この特徴によれば、天然の鬼界アカホヤ火山灰土壌を乾熱滅菌するだけで核酸吸着材が得られるため、加工処理が少ない。
この特徴によれば、天然の鬼界アカホヤ火山灰土壌を乾熱滅菌するだけで核酸吸着材が得られるため、加工処理が少ない。
前記火山灰土壌は、１８０〜１０００℃で焼成されていることを特徴としている。
この特徴によれば、焼成により火山灰土壌の構成化合物を安定させ、一定の形状と強度を確保することができるため、取り扱い性が良い。
この特徴によれば、焼成により火山灰土壌の構成化合物を安定させ、一定の形状と強度を確保することができるため、取り扱い性が良い。
前記火山灰土壌は、細孔は径３００ｎｍ以下のものが全細孔容積に対して１０体積％以上であることを特徴としている。
この特徴によれば、細孔の径が小さいものが存在しやすく、核酸を吸着しやすい。
この特徴によれば、細孔の径が小さいものが存在しやすく、核酸を吸着しやすい。
また、前記火山灰土壌は、細孔は径１００ｎｍ以下のものが全細孔容積に対して４体積％以上であることを特徴としている。さらに好ましくは、当該細孔は径３００ｎｍ以下のものが全細孔容積に対して１０体積％以上であり、かつ１００ｎｍ以下のものが全細孔容積に対して４体積％以上であることを特徴としている。
この特徴によれば、細孔の径が小さいものが存在しやすく、核酸を吸着しやすい。
この特徴によれば、細孔の径が小さいものが存在しやすく、核酸を吸着しやすい。
前記火山灰土壌は、比表面積が３．９ｍ２ｇ−１以上であることを特徴としている。
この特徴によれば、表面積が広く、核酸を吸着しやすい。
この特徴によれば、表面積が広く、核酸を吸着しやすい。
発明者らは、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を吸着する素材として、１８０℃以上で乾熱滅菌された火山灰土壌、特に天然の鬼界アカホヤ火山灰土壌（以下、単に「アカホヤ」と表記する。）の粒径０．５ｍｍ以下の粉末が優れるとの知見を得た。研究の結果から、成分および構造に着目することが有意であったことから、先ずこの事項について説明する。
核酸吸着材による核酸の吸着のメカニズムについて説明する。核酸吸着材は、径１００ｎｍ以下の無数の細孔を有し、その比表面積が大きいため、ファンデルワールス力や水素結合による核酸に対する物理的な吸着性に優れているとともに、吸水性にも優れている。さらに、核酸吸着材は、Ａｌ２Ｏ３（酸化アルミニウム）およびＦｅ２Ｏ３（酸化鉄）の組成比が高く、親水性を示すため、吸水後では、イオン化したＡｌ３＋（アルミニウムイオン）およびＦｅ３＋（鉄イオン）が核酸を構成するリン酸基と高い化学反応性を示し、錯体を形成する。
尚、ＤＮＡは、デオキシリボースと、リン酸基と、塩基と、から構成されるヌクレオチドを最小単位とするポリマー構造を成している。詳しくは、ヌクレオチド同士は、デオキシリボースの３’位ＯＨ基とリン酸基との間でホスホジエステル結合を形成して結合している。ホスホジエステル結合に含まれるリン酸基は、ＯＨ基を一つ有しており、ここからＨ＋が放出されることにより、ＤＮＡはマイナスの電荷を有する。さらに尚、ＲＮＡは、リボースと、リン酸基と、塩基と、から構成されるヌクレオチドを最小単位とするポリマー構造を成しており、ヌクレオチド同士の結合等はＤＮＡと略同一構成であるため詳しい説明を省略する。
このように、核酸吸着材は、径１００ｎｍ以下の無数の細孔により核酸を物理的に吸着するとともに、イオン化したＡｌ３＋およびＦｅ３＋が核酸を構成するリン酸基と高い化学反応性を示して錯体を形成することにより、核酸を効率よく吸着することができる。
また、図１に示されるように、核酸吸着材は、その表面にＡｌ２Ｏ３およびＦｅ２Ｏ３がまだら状に分散・露出された構造であることから、例えばその表面がＡｌ２Ｏ３やＦｅ２Ｏ３のみで構成される吸着材と比べて、全体の表面積に対するＡｌ２Ｏ３やＦｅ２Ｏ３の露出面積が小さくなり、核酸が有する複数のリン酸基（図１の多孔質粉末を中心方向から見た１つの細孔を拡大して示す図においてハッチングを付して示す箇所）のうちの幾つかが細孔表面に露出しイオン化したＡｌ３＋およびＦｅ３＋と反応することで弱く吸着された状態となる（図１の拡大図においては細孔内にＤＮＡの一部が入り込んだ３箇所のリン酸基の内、中央の１つのみ（クロスハッチング）が吸着された状態を例示している。）ことで核酸の溶出効率を高めることができる。そのため、核酸の高収率で回収することができる。
また、核酸吸着材は粒径０．５ｍｍ以下の粉末であり、核酸は径が小さく長いポリマー構造であることから、核酸の一部が細孔内に弱く吸着された状態で、複数の粒子により複合的に吸着することができるため、核酸の吸着性能を高めることができる。尚、核酸の一部は、核酸吸着材の細孔表面以外の表面に露出しイオン化したＡｌ３＋およびＦｅ３＋と反応して吸着されていてもよい。
加えて、核酸吸着材に１８０℃以上で乾熱滅菌された火山灰土壌を用いることにより、火山灰土壌中の細菌由来の核酸が除去されるとともに、不純物の溶出が防止されるため、目的の核酸を高純度で回収することができる。
本発明に係る核酸吸着材を実施するための形態を実施例に基づいて以下に説明する。尚、本実施例において成分組成比等の各試験結果はサンプル数３以上の平均値である。
核酸吸着材は、宮崎県東諸県郡地区産出のアカホヤを粉砕してふるいにかけた後、次の条件で乾熱滅菌することにより土壌由来の細菌を死滅させ、細菌由来の核酸が除去される。
温度 １８０℃
保持時間 ４０分
乾熱滅菌器（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製ＳＴＡ６２０ＤＡ）
温度 １８０℃
保持時間 ４０分
乾熱滅菌器（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製ＳＴＡ６２０ＤＡ）
さらに、核酸吸着材は、乾熱滅菌後、次の条件で焼成することにより構成化合物を安定させ、一定の形状と強度を確保する。また、核酸吸着材は、焼成後、０．５ｍｍのふるいにかけて粒径を調整した。
温度 ８００〜１０００℃
保持時間 ６０分（昇温１００℃／１時間）
焼成装置（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製電気マッフル炉ＦＵＷ２２０ＰＡ）
温度 ８００〜１０００℃
保持時間 ６０分（昇温１００℃／１時間）
焼成装置（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製電気マッフル炉ＦＵＷ２２０ＰＡ）
乾熱滅菌前および焼成前のアカホヤの成分組成比は以下のとおりであった。尚、成分組成比は、島津製作所社製エネルギー分散型蛍光Ｘ線分析装置ＥＤＸ−７２０を用いてＪＩＳ Ｋ０１１９：２００８により分析した。
５１．０ｗｔ％ ＳｉＯ２
３９．７ｗｔ％ Ａｌ２Ｏ３
４．７１ｗｔ％ Ｆｅ２Ｏ３
１．４９ｗｔ％ Ｋ２Ｏ
１．４０ｗｔ％ ＣａＯ
０．５１ｗｔ％ ＭｇＯ
０．５３ｗｔ％ ＴｉＯ２
０．６６ｗｔ％ その他
５１．０ｗｔ％ ＳｉＯ２
３９．７ｗｔ％ Ａｌ２Ｏ３
４．７１ｗｔ％ Ｆｅ２Ｏ３
１．４９ｗｔ％ Ｋ２Ｏ
１．４０ｗｔ％ ＣａＯ
０．５１ｗｔ％ ＭｇＯ
０．５３ｗｔ％ ＴｉＯ２
０．６６ｗｔ％ その他
焼成後のアカホヤの成分組成比は以下の表１のとおりであった。
焼成後のアカホヤは、Ａｌ２Ｏ３の成分組成比が３８．３〜３９．２ｗｔ％、Ｆｅ２Ｏ３の成分組成比が３．９６〜４．７９ｗｔ％であり、ＳｉＯ２に対してＡｌ２Ｏ３およびＦｅ２Ｏ３の比率が高い。
ここで、焼成温度によって細孔径分布、気孔率、比表面積が変化しているので以下説明する。尚、細孔径分布および気孔率は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製ＡｕｔｏＰｏｒｅＶ９６２０を用いて水銀圧入法（ＪＩＳ Ｒ１６５５）により分析した。
図２および図３のグラフに示されるように、アカホヤの細孔は、径０．０１〜１０μｍ（１００〜１００００ｎｍ）に分布しており、焼成温度８００〜１０００℃では、径３００ｎｍ以下（径０．０１ｎｍ以上〜３００ｎｍ以下に同じ。）の細孔は１０体積％以上であり、かつ径１００ｎｍ以下の細孔は４体積％以上であり細孔の分布があるが、焼成温度１１００℃、１１５０℃では、径３００ｎｍ以下の細孔は５体積％未満であり、径１００ｎｍ以下の細孔は１体積％未満であり細孔の分布がなくなっている。すなわち、焼成温度が高くなるにつれて細孔が閉塞し、細孔径分布が変化することが確認された。
図４に示されるように、アカホヤの気孔率は、焼成温度８００〜１１５０℃において４０〜５０％の高い気孔率を有し、狭い範囲内にある。
また、比表面積は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製ＦｌｏｗＳｏｒｂ３ ２３１０を用いてＢＥＴ法（ＪＩＳ Ｚ８８３０）により求めた。
表２に示されるように、アカホヤの比表面積は、焼成無しで６８．７ｍ２ｇ−１であったものが、焼成温度８００℃で３６．０ｍ２ｇ−１、焼成温度９００℃で９．５４ｍ２ｇ−１、焼成温度１０００℃で３．９ｍ２ｇ−１、焼成温度１１００℃で１．３５ｍ２ｇ−１、焼成温度１１５０℃で０．７９ｍ２ｇ−１と低下している。すなわち、焼成温度が高くなるにつれて細孔の閉塞に伴い比表面積が低下する。
次に、上述したアカホヤと同様の加工処理を行った栃木県鹿沼地区産出の赤玉土について説明する。
乾熱滅菌前および焼成前の赤玉土の成分組成比は以下のとおりであった。
４６．５ｗｔ％ ＳｉＯ２
３４．９ｗｔ％ Ａｌ２Ｏ３
１３．２ｗｔ％ Ｆｅ２Ｏ３
１．３７ｗｔ％ Ｋ２Ｏ
０．５８ｗｔ％ ＣａＯ
１．３１ｗｔ％ ＭｇＯ
１．３５ｗｔ％ ＴｉＯ２
０．７９ｗｔ％ その他
４６．５ｗｔ％ ＳｉＯ２
３４．９ｗｔ％ Ａｌ２Ｏ３
１３．２ｗｔ％ Ｆｅ２Ｏ３
１．３７ｗｔ％ Ｋ２Ｏ
０．５８ｗｔ％ ＣａＯ
１．３１ｗｔ％ ＭｇＯ
１．３５ｗｔ％ ＴｉＯ２
０．７９ｗｔ％ その他
焼成後の赤玉土の成分組成比は以下の表３のとおりであった。
焼成後の赤玉土は、Ａｌ２Ｏ３の成分組成比が３３．０〜３４．６ｗｔ％、Ｆｅ２Ｏ３の成分組成比が１１．７〜１３．１ｗｔ％であり、ＳｉＯ２に対してＡｌ２Ｏ３およびＦｅ２Ｏ３の比率が高い。また、アカホヤと比べてＡｌ２Ｏ３の成分組成比が低く、Ｆｅ２Ｏ３の成分組成比が高い。
次に、上述したアカホヤおよび赤玉土と同様の加工処理を行った宮崎県新富地区産出の粘土について説明する。
乾熱滅菌前および焼成前の成分組成比は以下のとおりであった。
６５．２ｗｔ％ ＳｉＯ２
２３．０ｗｔ％ Ａｌ２Ｏ３
５．１８ｗｔ％ Ｆｅ２Ｏ３
３．７１ｗｔ％ Ｋ２Ｏ
０．２４ｗｔ％ ＣａＯ
１．６５ｗｔ％ ＭｇＯ
０．８１ｗｔ％ ＴｉＯ２
０．２１ｗｔ％ その他
６５．２ｗｔ％ ＳｉＯ２
２３．０ｗｔ％ Ａｌ２Ｏ３
５．１８ｗｔ％ Ｆｅ２Ｏ３
３．７１ｗｔ％ Ｋ２Ｏ
０．２４ｗｔ％ ＣａＯ
１．６５ｗｔ％ ＭｇＯ
０．８１ｗｔ％ ＴｉＯ２
０．２１ｗｔ％ その他
焼成後の粘土の成分組成比は以下の表４のとおりであった。
焼成後の粘土は、Ａｌ２Ｏ３の成分組成比が２２．２〜２２．７ｗｔ％、Ｆｅ２Ｏ３の成分組成比が４．７６〜４．９１ｗｔ％であり、ＳｉＯ２に対してＡｌ２Ｏ３およびＦｅ２Ｏ３の比率が低い。また、アカホヤと比べてＡｌ２Ｏ３の成分組成比が低く、Ｆｅ２Ｏ３の成分組成比が略同じである。
すなわち、アカホヤは、赤玉土および粘土と比べて、安定度定数の高いＡｌ３＋を生じるＡｌ２Ｏ３の成分組成比が高く、かつ赤玉土と比べてＦｅ２Ｏ３の成分組成比が低いため、例えばＡｌ３＋（アルミニウムイオン）と核酸のリン酸基で錯体を形成しやすく、当該錯体と他の核酸のリン酸基との逐次反応が起こり、核酸をより効率よく吸着することができる。
このように、核酸吸着材は、九州南部において地下の比較的浅い場所に無尽蔵に存在する自然素材であるアカホヤから構成されることにより、核酸に対する高い吸着能力を有しながら、安価にかつ環境への負担の少なくすることができる。尚、核酸吸着材として用いるアカホヤは、九州南部において産出されたものであれば、宮崎県東諸県郡地区産出のものに限らない。
実施例１に係る核酸吸着材について説明する。実施例の核酸吸着材は、粉砕し次の条件で乾熱滅菌した後、粒径０．５ｍｍ以下に調整した粉末状のアカホヤ０．１ｇを径６ｍｍの円筒形状のミニカラム内に充填することにより構成されている。尚、核酸吸着材の粒径は０．５ｍｍ以下、好ましくは０．１ｍｍ以下である。
温度 １８０℃
保持時間 ４０分
乾熱滅菌器（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製ＳＴＡ６２０ＤＡ）
温度 １８０℃
保持時間 ４０分
乾熱滅菌器（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製ＳＴＡ６２０ＤＡ）
次いで、核酸吸着材による核酸吸着試験について説明する。径１０ｍｍの遠心管に装着した核酸吸着材に濃度を段階的に調整したサケ精子ＤＮＡ５０μｌをそれぞれ添加した後、遠心機（日立社製ＣＴ１５ＲＥ）により１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより得られた通過液をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅させて、バンドの有無を確認した。
サンプル１〜１０におけるサケ精子ＤＮＡの濃度は以下の表５のとおりであった。
図５の写真に示されるように、サンプル１〜４においては、通過液中に含まれていたサケ精子ＤＮＡが増幅されたことを示すバンドが検出されたが、サンプル５〜１０においては、バンドが検出されなかった。すなわち、サンプル５の結果に基づき、アカホヤを素材とする核酸吸着材は少なくともアカホヤ１ｇ当たり５５．５μｇのサケ精子ＤＮＡを吸着する能力があることが確認された。
次いで、核酸吸着材の核酸回収試験について説明する。遠心管に装着した核酸吸着材にカンピロバクター・ジェジュニから抽出したＤＮＡ５０μｌを添加した後、遠心機により１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより得られた通過液をＰＣＲ法により増幅させて、バンドの有無を確認した。また、ＤＮＡが吸着された核酸吸着材に溶出液としての０．００１％スキムミルク（日本ベクトンディッキンソン社製）５０μｌを添加した後、遠心機により１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより得られた溶出液（１回目）をＰＣＲ法により増幅させて、バンドの有無を確認した。さらに、ＤＮＡを溶出させた核酸吸着材に０．００１％スキムミルク５０μｌを再度添加した後、遠心機により１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより得られた溶出液（２回目）をＰＣＲ法により増幅させて、バンドの有無を確認した。
サンプル１〜６におけるカンピロバクター・ジェジュニＤＮＡの濃度は以下の表６のとおりであった。
図６の写真に示されるように、サンプル１〜６において、核酸吸着材によりＤＮＡが吸着された通過液には、カンピロバクター・ジェジュニＤＮＡが増幅されたことを示すバンドが検出されなかったが、１回目の溶出液と２回目の溶出液には、共にバンドが検出された。すなわち、核酸吸着材に吸着されたＤＮＡの溶出効率が高いことが確認された。
尚、スキムミルクの添加により核酸吸着材の表面におけるｐＨが増加することにより、三価のアルミニウムの溶解度が減少することから、錯体を形成して吸着されたＤＮＡが溶出しやすくなっている。また、１回目の溶出では核酸吸着材の表面側で形成された錯体に対する逐次反応により錯体を形成して吸着された外側のＤＮＡが主に溶出し、２回目の溶出では、核酸吸着材の表面側で錯体を形成して吸着されたＤＮＡが主に溶出する。尚、核酸吸着材の表面は、Ａｌ２Ｏ３およびＦｅ２Ｏ３がまだら状に分散・露出された構造であることから、核酸が有する複数のリン酸基のうちの幾つかが細孔表面に露出しイオン化したＡｌ３＋およびＦｅ３＋と反応することで弱く吸着された状態となることにより、核酸吸着材の表面側で錯体を形成して吸着されたＤＮＡが溶出しやすくなっており、核酸の溶出効率が高められ、核酸の高収率で回収することができる。
実施例２に係る核酸吸着材について説明する。実施例の核酸吸着材は、粉砕し前記実施例１と同じ条件で乾熱滅菌し、さらに次の条件で焼成した後、粒径０．５ｍｍ以下に調整した粉末状のアカホヤ０．１ｇを径６ｍｍの円筒形状のミニカラム内にそれぞれ充填することにより構成されている。
温度 ８００℃、１０００℃、１１００℃
保持時間 ６０分（昇温１００℃／１時間）
焼成装置（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製電気マッフル炉ＦＵＷ２２０ＰＡ）
温度 ８００℃、１０００℃、１１００℃
保持時間 ６０分（昇温１００℃／１時間）
焼成装置（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製電気マッフル炉ＦＵＷ２２０ＰＡ）
次いで、核酸吸着材を構成するアカホヤの焼成温度と核酸の吸着能力および回収能力との関係について調べた試験について説明する。径１０ｍｍの遠心管に装着した核酸吸着材にカンピロバクター・ジェジュニから抽出したＤＮＡ５０μｌを添加した後、遠心機により１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより得られた通過液をＰＣＲ法により増幅させて、バンドの有無を確認した。また、ＤＮＡが吸着された核酸吸着材に溶出液としての０．００１％スキムミルク５０μｌを添加した後、遠心機により１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより得られた溶出液をＰＣＲ法により増幅させて、バンドの有無を確認した。尚、アカホヤの焼成温度が異なる核酸吸着材について、それぞれ同一の操作を行った。
サンプル１〜７におけるカンピロバクター・ジェジュニＤＮＡの濃度は以下の表７のとおりであった。
図７の左側の写真に示されるように、焼成温度８００℃のアカホヤから構成される核酸吸着材によりＤＮＡが吸着された通過液には、サンプル１のみカンピロバクター・ジェジュニＤＮＡが増幅されたことを示すバンドが検出され、サンプル２〜７にはバンドが検出されなかった。また、焼成温度１０００℃、１１００℃のアカホヤから構成される核酸吸着材によりＤＮＡが吸着された通過液では、サンプル１以外においてもカンピロバクター・ジェジュニＤＮＡが増幅されたことを示すバンドが検出された。尚、焼成温度８００℃、１０００℃、１１００℃のアカホヤから構成される核酸吸着材の溶出液には、サンプル１〜７の全てにおいてバンドが検出された。すなわち、アカホヤの焼成温度の上昇に伴い核酸吸着材の吸着性能が低下することが確認された。
詳しくは、アカホヤの焼成は、径３００ｎｍ以下の細孔は１０体積％以上、さらに好ましくは径３００ｎｍ以下の細孔は１０体積％以上かつ径１００ｎｍ以下の細孔を４体積％以上有し、その比表面積が３．９ｍ２ｇ−１以上（好ましくは３６．０〜６９．０ｍ２ｇ−１）となる焼成温度１０００℃以下（好ましくは８００℃以下）で行われることにより、アカホヤの細孔による核酸の物理的な吸着能力を維持することが確認された。すなわち、核酸の物理的な吸着能力には、細孔の径と小さな径の細孔の割合、比表面積が重要であることが判明した。
また、アカホヤ等の火山灰土壌は、未処理の状態では核酸に対する吸着力がかなり強いことから、乾熱滅菌後の焼成温度を調整することにより適正な吸着力となり、核酸の吸着性能および回収性能を最適化することができる。また、焼成温度の調整に限らず、火山灰土壌に対してリン酸等により前処理を行うことで、核酸との反応を抑制して核酸の吸着性能および回収性能を最適化してもよい。
以上、本発明の実施例を図面により説明してきたが、具体的な構成はこれら実施例に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における変更や追加があっても本発明に含まれる。
例えば、前記実施例１では、核酸吸着材に乾熱滅菌され、粒径０．５ｍｍ以下に調整されたアカホヤ、前記実施例２では、核酸吸着材に乾熱滅菌および焼成され、粒径０．５ｍｍ以下に調整されたアカホヤが用いられる例について説明したが、これに限らず、Ａｌ２Ｏ３を３０ｗｔ％以上含有している火山灰土壌であれば、例えば乾熱滅菌され、粒径０．５ｍｍ以下に調整された赤玉土であってもよく、鹿沼土や粘土やシラス等の火山灰土壌にＡｌ２Ｏ３を３０ｗｔ％以上含有させるように加工処理したものであってもよい。
また、前記実施例１、２においては、精製・抽出されたＤＮＡを吸着させる態様について説明したが、核酸吸着材は、生物材料から核酸を精製するために使用されてもよい。例えば生物材料の破砕液を核酸吸着材に通過させて核酸を吸着させた後、タンパク質等の核酸以外の物質を除去するために核酸吸着材に洗浄液を通過させ、さらに核酸吸着材にスキムミルク等の溶出液を通過させ核酸吸着材に吸着された核酸を回収してもよい。また、核酸の溶出に少量の溶出液を使用することで、核酸の濃縮が可能である。これによれば、コストが安く、設備に負担を掛けない核酸の濃縮・精製・抽出方法を実現することができる。尚、洗浄液や溶出液は使用条件に応じて自由に選択されてよい。また、核酸吸着材に対して各種溶液を通過させる際には遠心機を使用しなくてもよい。
また、核酸吸着材は、核酸であればＤＮＡに限らず、各種ＲＮＡの濃縮・精製・抽出に使用されてもよい。尚、ＲＮＡは、ＤＮＡと比べて長さが短いものが多いことから、核酸吸着材の細孔内に入り込むことで吸着されやすくなり、吸着効率が高い。
また、本発明の核酸吸着材は、核酸の濃縮・精製・抽出に使用されるものに限らず、例えば細菌の内毒素（リポ多糖体）を精製する際、最終標品への核酸の混入を避けるために核酸の吸着・除去に使用されてもよい。
１．分子生物学分野でゲノム解析に用いる核酸抽出技術としての利用。
２．感染症診断のための病原体ＤＮＡの検出に用いる簡易・迅速核酸抽出キットとしての利用。
３．試験研究において、生物材料に混入した核酸を除去するツールとしての利用。
２．感染症診断のための病原体ＤＮＡの検出に用いる簡易・迅速核酸抽出キットとしての利用。
３．試験研究において、生物材料に混入した核酸を除去するツールとしての利用。
Claims (7)
- Ａｌ２Ｏ３が３０ｗｔ％以上であり、１８０℃以上で乾熱滅菌された火山灰土壌の粒径０．５ｍｍ以下の粉末を用いたことを特徴とする核酸吸着材。
- 前記火山灰土壌は、Ｆｅ２Ｏ３が３〜８ｗｔ％である鬼界アカホヤ火山灰土壌であることを特徴とする請求項１に記載の核酸吸着材。
- 前記火山灰土壌は、ＳｉＯ２が３９〜６５ｗｔ％、Ａｌ２Ｏ３が３１〜４５ｗｔ％、Ｆｅ２Ｏ３が３〜８ｗｔ％、その他が０〜２２ｗｔ％からなることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸吸着材。
- 前記火山灰土壌は、１８０〜１０００℃で焼成されていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸吸着材。
- 前記火山灰土壌は、細孔は径３００ｎｍ以下のものが全細孔容積に対して１０体積％以上であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の核酸吸着材。
- 前記火山灰土壌は、細孔は径１００ｎｍ以下のものが全細孔容積に対して４体積％以上であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の核酸吸着材。
- 前記火山灰土壌は、比表面積が３．９ｍ２ｇ−１以上であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の核酸吸着材。
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