KR100415726B1 - Dna 채취용 스티커 및 이를 이용한 dna 채취방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DNA 채취용 스티커 및 이를 이용한 DNA 채취방법에 관한 것으로서, EDTA, Tris, SDS 성분이 포함된 도포액을 함유한 본 발명에 의한 스티커를 각질이 떨어질 수 있는 피부에 부착하고 탈착한 후에 스티커로부터 각질성분만을 분리하므로서 인체로부터 간편하게 유전자를 채취하고, 이를 본 발명에 의한 방법으로 DNA 를 분리한 후, PCR 등을 이용하여 유전자를 증폭하고 이렇게 증폭된 유전자를 친자확인이나 범죄수사에 사용되는 유전지문 (finger print) 또는 유전적 질병의 검색 목적에 사용할 수 있게 하는 방법을 제공한다.

Description

DNA 채취용 스티커 및 이를 이용한 DNA 채취방법{STICKER FOR DNA ISOLATION AND ISOLATION METHOD THEREBY}

본 발명은 DNA 채취용 스티커 및 이를 이용한 DNA 채취방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 혈액이나 모발의 필요없이 인체 피부로부터 떨어져나가 부착된 각질만을 용이하게 분리할 수 있음으로서 인체로부터 간편하게 유전자를 채취하고 이를 PCR 기술을 이용하여 증폭함으로서 친자확인, 범죄수사 등에 간편하게 이용할 수 있는 DNA 채취용 스티커 및 이를 이용한 DNA 채취방법에 관한 것이다.

일반적으로 DNA(deoxyribonucleic acid)는 인체내의 유전정보를 담고 있는 분자로서 인간의 23쌍 염색체내에 저장되어 있으며 유전정보의 측면에서 살펴보면 단백질을 코드하고 있는 엑손(exon)과 단백질 비코드 영역인 인트론(intron)으로 구성되어 있다. 특히, 상기 인트론 중 Alu 서열은 그 유전적 계보의 영향으로 개인마다 특이한 반복 패턴을 나타내므로 이 부위를 예를 들어 게놈 상에 흩어져 있는 유사 내지 동일한 짧은 서열(예컨데, 마이크로세털라이트(microsatellite) 또는VNTR(Variable Number of Tandem Array)) 등을 검색하는 방법으로 조사하여 유전지문(finger print)으로 활용하고 있다.

상기한 인체로부터 DNA를 채취하는 기술로는 혈액이나 모발을 이용하는 방법이 종래에 알려져 왔다. 그러나 상기한 방법은 일반적으로 거부감을 줄 뿐만 아니라 그 절차가 복잡한 문제점이 있었다.

한편, 인체로부터 각질이 수시로 용이하게 떨어진다는 점을 이용하여 스티커를 이용하여 DNA를 얻고자 할 경우 종래의 스티커는 그 접착성분으로부터 인체의 각질 즉, 인체의 DNA만이 분리되지 않는다는 문제점이 있었다. 이는 일반적으로 접착성분은 중합체이고 DNA 또한 중합체이므로 DNA를 분리해내는 조건에서 접착성분이 DNA와 함께 응고하여 서로 분리할 수 없었기 때문이다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 주요한 목적은 상기한 DNA 채취용 스티커로부터 DNA를 분리하는 방법 을 위한 DNA 채취용 스티커를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 부차적인 목적은 혈액이나 모발의 필요없이 인체 피부로부터 떨어져나가 부착된 각질만을 용이하게 분리할 수 있음으로서 인체로부터 간편하게 유전자를 채취하고 이를 일반적인 PCR 기술을 이용하여 증폭함으로서 친자확인, 범죄수사 등에 간편하게 이용할 수 있는 DNA 채취용 스티커로부터 DNA를 분리하는 방법을 제공하는 데에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인체 성분으로부터 유전자를 채취·분석하는 방법에 있어서, 그 전단계로 EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetate), Tris, SDS(Sodium Dodecyl Sulphate)로 이루어진 도포액이 도포된 스티커를 인체 피부에 부착 및 탈착시키고 상기 도포액에 상기 탈착된 스티커를 30-45℃, 40-80분 동안 인큐베이션(incubation)한 후, 프로티나제 K(proteinase K)를 가하여 40-68℃에서 30-100분 동안 작용시킴을 특징으로 한다.

도 1 은 스티커로부터 DNA 를 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.

이하, 단계별로 나누어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 DNA 채취용 스티커를 제작하고 이를 이용하여 DNA를 채취하고 그것을 이용하여 유전자를 확인한다는 차원에서 대체로 다음 단계로 구성되어 있다.

(1) 일반적으로 알려진 인체용 스티커의 일면에 EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetate), Tris, SDS(Sodium Dodecyl Sulphate)로 이루어진 도포액을 도포하여 본 발명의 DNA 채취용 스티커를 제조하는 단계.

(2) 상기한 스티커를 인체 피부에 부착하였다가 분리함으로써 인체의 각질을 수득하는 단계.

(3) 상기에서 수득한 인체의 각질을 처리하여 DNA 성분만을 채취하는 단계.

(4) 상기에서 수득한 DNA를 일반적인 공지기술인 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 증폭시키는 단계.

(5) 상기에서 수득한 DNA를 시료로 한 각종 유전자 및 개인의 유전적 구성의 확인방법의 적용 단계.

제 1단계: DNA 채취용 스티커의 제조 단계

본 발명에서 사용되는 스티커는 인체에 무해한 접착성분이 함유된 인체용 스티커로서 일반적으로 알려진 스티커를 사용한다. 상기 일반적인 인체용 스티커의 접착성분이 묻혀진 일면 위에 EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetate), Tris, SDS(Sodium Dodecyl Sulphate)로 이루어지는 액이 도포됨으로서 본 발명의 DNA 채취용 스티커가 제조된다.

도포량은 상기 DNA 채취용 스티커가 인체에 접착되지 않을 정도로 과도하여서는 아니되며 반대로 접착성분과 인체 각질 성분이 서로 분리되지 않을 정도로 과소하여서도 아니된다. 즉, 접착표면의 70%-85% 범위가 상기 도포액으로 도포되어야 하며, 바람직하게는 75%로 하는 것이 좋다. 도포의 두께는 접착성분과 인체가 서로 닿지 않을 정도로 두꺼워서는 아니되는 바, 3mm 이하의 두께로 하여야 한다.

상기 도포액에서 EDTA는 세포막의 전체 구조를 유지하는데 필수적인 마그네슘이온을 제거하여 세포막을 약화시키고 DNA를 분해하는 세포 내 효소를 저해함으로써 DNA가 온전히 채취될 수 있도록 돕는 역할을 한다. 또한, Tris는 비독성이며 저렴하여 많이 사용하는 완충시스템이며, SDS 는 일종의 세제(detergent)로서 지질 분자를 제거함으로써 세포 용해(lysis)의 과정을 돕고 이에 의해 세포막의 해체를 유발하는 작용을 한다. 상기한 도포액의 각각의 조성물이 제 역할을 하려면 스티커에 도포되는 상기 도포액의 조성은 EDTA 0.05-0.1 mol, Tris 5-15 mmol 에 SDS 30-40 부피%가 되도록 SDS를 첨가하고 증류수를 가하여 전체 7000-8000ml가 되도록 하여야 하며, 바람직하게는 EDTA 0.1 mol, Tris 10 mmol 에 SDS 37.5 부피%가 되도록 SDS를 첨가하고 증류수를 가하여 전체 7500 ml가 되도록 함이 좋다.

제 2단계: 인체의 각질을 수득하는 단계

본 발명의 스티커는 인체의 어느 부위에든 접착하여도 무관하지만 바람직하게는 팔꿈치, 겨드랑이, 팔뚝, 복숭아 뼈나 얼굴 등 각질이 많이 생기는 부분에 적용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 스티커는 접착시간에도 크게 구애되지 않으므로 접착 후 바로 떼어내도 적정량의 시료를 채취할 수 있다.

제 3단계: DNA 성분만을 채취하는 단계

DNA 성분만을 상기한 스티커로부터 수득한 인체의 각질을 처리하여 채취하는 방법은 본 발명의 핵심으로서 다음과 같은 순서로 이루어진다.

i) 우선 스티커로부터 접착부위를 적절한 크기(약 4 cm x 6 cm)로 오려낸 후 상기 도포액과 같은 조성 및 성분비의 DNA 추출용액에 담근다. 이와 같이 같은 조성 및 성분비로 함은 스티커의 접착성분과 수득된 인체 각질 사이의 도포액이 DNA 추출용액에 용해됨으로서 스티커의 접착성분과 수득된 인체 각질 사이가 용이하게 분리되도록 하기 위함이다.

상기한 도포 용액에 담겨진 상태로 30 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 37 ℃에서 40분 내지 80분, 더욱 바람직하게는 60분동안 인큐베이션(incubation)한다. 이는 30 ℃ 미만에서 인큐베이션할 경우 상기한 도포액, DNA 추출용액의 활성(activity)이 떨어져 그 만큼 상기한 스티커의 접착성분과 수득된 인체 각질 사이의 도포액이 DNA 추출용액에 용해되는 비율이 낮아지게 되므로서 결과적으로 인체 각질의 DNA 회수율이 60% 이하로 떨어지게 되어 분석하기 어려워지기 때문이다. 반대로 45℃를 초과하는 경우에는 중합체인 스티커의 접착성분까지 스티커로부터 DNA 추출용액으로 방출되고 도포액, DNA 추출용액의 활성(activity)도 떨어져 결과적으로 인체 각질의 DNA 회수량에 비해 접착성분의 회수량이 크게 증가하여 후술하는 PCR 증폭은 물론 DNA 분석도 할 수 없게 되기 때문이다.

한편, 상기 40분 미만으로 인큐베이션할 경우 용해되는 시간이 짧아 스티커의 접착성분과 각질의 분리가 최종적으로 PCR 증폭 및 DNA 분석할 수 있을 정도까지 이르지 못하게 되며, 80분을 초과하게 될 경우 DNA추출과정에서 마지막 단계인 알콜처리에서 접착성분이 추출되기 때문에 PCR을 할 수 없게된다. 따라서, 이러한 인큐베이션 조건을 만족하는 것이 매우 중요하다.

ii) 상기한 인큐베이션 후 단백질 분해 효소인 프로티나제 K(proteinase K)를 가하여 단백질을 제거한다. 이 때에 40-68℃에서 30-100분 동안 프로티나제 K를 작용시킨다. 바람직하게는 65℃, 90분이 좋다. 이는 100분을 초과하여 작용시킬 경우 피부로부터 함께 분리된 디에나제(Dnase)의 작용으로 채취하고자 하는 DNA의 양이 감소하기 때문이며, 30분 미만으로 할 경우 충분한 단백질 제거가 이루어지지 않기 때문이다. 한편, 40℃ 미만으로 하거나 68℃를 초과할 경우 온도에 민감한 단백질 제거효소인 상기 프로티나제 K의 활동이 감소되어 인체로부터 수득된 각질 등이 덩어리 상태로 머물러 있어 결과적으로 DNA 회수율이 떨어지게 되고 특히 68℃를 초과할 경우에는 분석하려는 DNA에 변성을 일으키게 된다.

iii) 이하의 과정은 일반적으로 공지된 혈액 등을 이용해 DNA를 분석하기 위한 과정과 동일하다. 이하, 구체적으로 서술하면 다음과 같다.

상기 용액에 페놀을 시료와 같은 부피로 가한후 원심분리시키면 층분리가 일어난다(1차 페놀 추출). 상층에 위치한 수층을 파이펫만으로 분리해 낸 후 이 분리액에 페놀:클로로포름(1:1) 용액을 같은 부피로 가하여 다시 원심분리시킨다(2차 페놀 추출). 상층을 다시 분리해낸 후 이 분리액에 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform-isoamylalcohol)을 같은 부피로 가하고 다시 원심분리하여 3차 추출을 행한다. 여기서 얻어낸 시료에 나트륨이온과 같은 염 존재하에 99% 에탄올을 시료와 같은 부피로 가하여 - 20℃에서 원심분리하면 DNA가 침전을 형성한다(DNA 농축).

제 4단계: PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 DNA 증폭 단계

PCR 은 증폭시키고자 하는 DNA 시료에 대해 가닥분리 (denaturation), 프라이머와 결합 (annealing) 및 DNA 중합효소에 의한 신장 (extention) 을 반복하면서 10⁶배 이상으로 표적 DNA 를 단시간 내에 증폭시키는 일반적인 공지기술이다.

따라서, 상기에서 수득한 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고 TE 완충액에 용해시키고 이를 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 단시간 내에 상기 DNA를 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 스티커로 채취한 DNA도 상기 PCR 기술에 의해 증폭할 수 있다. 본 발명에 따른 적용시 PCR 의 2 내지 3 사이클로도 효과적인 DNA 양을 수득할 수 있다.

제 5단계: 각종 유전자 및 개인의 유전적 구성의 확인 단계

상기에서 수득한 DNA를 시료로 하여 여러가지 유전자 및 개인의 유전적 구성의 확인방법(genetic screening)을 적용시킬 수 있다. 이러한 유전적 구성의 특성을 이용하여 응용면에서 있어서 친자확인이나 범죄현장에서의 용의자 색출에 활용될 수 있다. 본 발명에 의해 채취한 DNA 는 이러한 유전 지문 검색시의 활용 외에도 유전질환의 검색에 사용될 수 있다. 여러가지 유전자 및 개인의 유전적 구성의 확인방법으로는 DNA 간의 혼성화 (hybridization) 원리를 이용한 서던 블롯팅(southern blotting) 이나 DNA 칩 등을 들 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 이하의 실시예에 의하여 한정되어 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 사상의 범위내에서 당업자에게 통상의 변화가 가능함은 물론이다.

실시예 1

스티커의 제조예 및 인체 각질의 수득

EDTA 0.1 mol, Tris 10 mmol 에 SDS 37.5 부피%가 되도록 SDS를 첨가하고 증류수를 가하여 전체 7500 ml가 되도록 한 도포액을 인체에 무해한 접착성분이 함유된 인체용 스티커의 일면 면적의 75%에 걸쳐 2mm의 두께로 도포하였다.

상기 도포한 스티커를 손바닥에 접착하고 난 후 10분 후 다시 탈착하였다.

실시예 2

스티커에 부착된 인체의 각질부분으로부터 DNA 의 분리과정

상기 실시예 1의 스티커를 4 cm x 6 cm의 사각형으로 오려낸 후 상기 실시예 1의 도포액과 같은 조성 및 성분비의 도포 용액에 담가 37 ℃에서 60분동안 인큐베이션(incubation)하였다. 인큐베이션 후 단백질 분해 효소인 프로티나제 K(proteinase K) 를 가하여 65℃에서 90분 동안 프로티나제 K를 작용시켰다.

실시예 3

상기한 실시예 1, 2의 실험을 스티커의 접착성분 조성 및 인큐베이션 온도, 시간, 프로티나제 K (proteinase K) 의 작용 시간, 온도를 달리하여 실험하였으며, 그 결과를 이하의 표로 나타내었다.

* DNA 의 채취량은 자외선 흡광의 정도로 결정하였다. 260nm 에서의 흡광도가 1인 경우 ds DNA 가 ml 당 50 μg 에 해당하는 것을 기준으로 하였다.

* DNA 의 채취량은 자외선 흡광의 정도로 결정하였다. 260nm 에서의 흡광도가 1인 경우 ds DNA 가 ml 당 50 μg 에 해당하는 것을 기준으로 하였다.

* DNA 의 채취량은 자외선 흡광의 정도로 결정하였다. 260nm 에서의 흡광도가 1인 경우 ds DNA 가 ml 당 50 μg 에 해당하는 것을 기준으로 하였다.

* DNA 의 채취량은 자외선 흡광의 정도로 결정하였다. 260nm 에서의 흡광도가 1인 경우 ds DNA 가 ml 당 50 μg 에 해당하는 것을 기준으로 하였다.

* DNA 의 채취량은 자외선 흡광의 정도로 결정하였다. 260nm 에서의 흡광도가 1인 경우 ds DNA 가 ml 당 50 μg 에 해당하는 것을 기준으로 하였다.

상기한 바와 같이 본 발명의 DNA 채취용 스티커 및 이를 이용한 DNA 채취방법은 혈액이나 모발의 필요없이 인체 피부로부터 떨어져나가 부착된 각질만을 용이하게 분리할 수 있음으로서 인체로부터 간편하게 유전자를 채취하고 이를 PCR 기술을 이용하여 증폭함으로서 친자확인, 범죄수사 등에 간편하게 이용할 수 있는 효과를 갖는다.

즉, 본 발명에 의한 특수한 스티커를 피부에 부착하였다가 분리하고, 이로부터 효과적으로 DNA 를 추출함으로써 간편하게 개인의 유전자를 조사할 수 있다.

Claims (2)

1. EDTA 0.05~1mol(pH 8.0), Tris 0.002~0.015mol(pH 8.0)에 SDS를 30-40부피%(약 1-1.4mol)가 되도록 SDS(SDS는 순도99％, 분자량 288.4의 분말형태로 제품화 되어 있음)를 첨가하고 증류수를 가하여 전체부피가 7,000-8,000mol이 되도록 한 도포액을 인체에 무해한 스티커의 일면에 그 접착표면의 70%-85% 범위 및 3mm 이하의 두께로 도포하여 제조한 DNA 채취용 스티커.
2. 제 1 항의 DNA 채취용 스티커를 인체 피부에 부착 및 탈착하여 인체의 각질을 수득하고 이 스티커를 상기 도포액과 같은 조성 및 성분비의 도포 용액에 담가 30℃-45 ℃, 40분-80분동안 인큐베이션한 후 단백질 분해 효소인 프로티나제 K(proteinase K) 를 가하여 40-68℃, 30-100분 동안 작용시키는, DNA 성분만을 채취하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA를 분리하는 방법.