CN106244460A - 一种无外源菌dna污染的球虫卵囊的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊的制备方法，属于生物技术领域。本发明通过使用无微生物DNA污染的二次蒸馏水并配制所需试剂，采用1.2M蔗糖漂浮沉淀法对卵囊进行纯化，纯化后的卵囊经15％次氯酸钠溶液和细胞裂解液双重处理，充分裂解残留的细菌等杂质，再通过TE和二次蒸馏水反复漂洗去除粘附于卵囊壁的外源菌DNA。研究表明，经本发明方法处理后的卵囊纯度高，所抽提的基因组DNA经PCR检测无外源菌DNA污染，且整个过程操作简单，成本低，并对卵囊不产生任何影响。本发明的提出对球虫卵囊高纯度基因组DNA提取、基因克隆、全基因组(重)测序，以及表观遗传调控的研究具有重要意义。

Description

一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊的制备方法
技术领域
本发明涉及一种球虫卵囊制备方法，特别涉及一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊制备方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术
全基因组测序，即对一种生物的基因组中的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基序列。全基因组测序覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息；准确性高，其准确率可高达99.99％。全基因组测序是目前生物学研究领域的热门之一，对疾病防治和新药开发具有重要意义。
球虫是一类肠道内寄生原虫，球虫卵囊来源于肠道或粪便，而肠道和粪便中存在大量的细菌和其它杂质，因此，卵囊的分离纯化对球虫基因组研究至关重要。目前，关于卵囊分离纯化的方法旨在获得高纯度卵囊，其中一个重要步骤就是用次氯酸钠溶液对卵囊进行无菌化处理，但忽略了残留在卵囊中的细菌DNA污染的问题，这种细菌DNA污染将对球虫基因组研究产生重大影响，特别是在全基因组测序中产生大量的无效数据，甚至造成实验失败。
卵囊分离纯化和基因组提取过程中，试验用水和试剂也是外源菌DNA污染来源之一，通过细菌16s RNA基因通用引物PCR检测，无论是抽滤或高压灭菌后的试剂中仍存在一定量的细菌DNA污染，这种试剂中存在的DNA很可能粘附于卵囊表面，难以去除，对后续实验造成影响。而商品化的无微生物DNA污染水(如Qiangen公司，Microbial DNA-free water,Cat#：338132)价格昂贵(约60RMB/mL)，不适用于大量试剂配制，因此实验室自制无微生物DNA污染水尤为重要。在本发明中，优选的，利用石英自动亚沸高纯水蒸馏器对实验室常规超纯水进行二次蒸馏得到二次蒸馏水，经PCR检测，所获得的二次蒸馏水中完全去除了试验用水中微生物DNA污染，此方法成本很低并能大量制水。
此外，利用1.2M蔗糖对卵囊进行漂浮，0.3M蔗糖溶液进行沉淀，能很好地去除卵囊中的杂质。卵囊无菌化处理过程中，增加细胞裂解液的处理，能完全裂解次氯酸钠溶液未能杀灭的细菌，显微镜下观察，细胞裂解液对卵囊不造成任何影响，而通过TE和水的反复漂洗，能完全去除残留在卵囊表面的细菌DNA。本发明发明人也曾使用溶菌酶去除卵囊中残留的细菌和DNA消化酶去除卵囊表面残留的细菌DNA，但这两种试剂需要在一定温度下(37℃)发挥作用，温度变化可能对卵囊产生影响，因此不适用于卵囊细菌和DNA污染的去除。
本发明首次针对球虫卵囊中外源菌DNA污染，利用实验室自制的无微生物DNA污染水配制试剂，采用1.2M蔗糖漂浮和0.3M蔗糖沉淀对卵囊进行纯化，纯化后的卵囊经15％次氯酸钠溶液和细胞裂解液双重处理，最大程度裂解卵囊中的细菌，再通过TE和二次蒸馏水反复漂洗去除粘附于卵囊壁的外源菌DNA，获得高纯度的无外源菌DNA污染的球虫卵囊，对球虫卵囊基因组的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊的制备方法。
为了达到所述的目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)置孢子化卵囊于离心管中离心，弃上清；
(2)卵囊沉淀用PBS离心漂洗2次；
(3)卵囊沉淀用1.2M蔗糖漂浮1次，离心，收集上清液；
(4)上清液用二次蒸馏水稀释，离心，弃上清；
(5)卵囊沉淀用0.3M蔗糖漂洗2次，离心，弃上清；
(6)卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次，弃上清；
(7)卵囊沉淀用体积百分数为15％的次氯酸钠溶液处理10-20min，期间多次震荡，得到卵囊的悬浮液，离心，弃上清；
(8)卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次，弃上清；
(9)卵囊沉淀加入细胞裂解液剧烈涡旋10-60s，室温静置，离心，弃上清；
(10)卵囊沉淀用TE离心漂洗2次，弃上清；
(11)卵囊沉淀用二次蒸馏水离心漂洗1次，弃上清；
(12)卵囊沉淀用PBS离心漂洗1次，弃上清，沉淀即为纯化好的卵囊。
在本发明中，优选的，步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)以及步骤(6)-步骤(12)中所述的离心是指以3000rpm离心10min，步骤(3)以及步骤(5)中所述的离心是指以2000rpm离心10min。
在本发明中，优选的，步骤(7)中卵囊沉淀用体积百分数为15％的次氯酸钠溶液处理15min，期间多次震荡，得到卵囊的悬浮液。
在本发明中，优选的，步骤(9)中所述的细胞裂解液为Cellytic M细胞裂解液。
在本发明中，优选的，方法中所用到的溶液或试剂均采用自制的二次蒸馏水制备，所述的二次蒸馏水是通过利用石英自动亚沸高纯水蒸馏器对实验室常规超纯水进行二次蒸馏以及高压灭菌后得到的。
在本发明中，优选的，所述的球虫卵囊为鸡球虫卵囊。更优选的，所述的球虫卵囊为柔嫩艾美耳球虫卵囊。
相较于现有技术，本发明具有以下优点：
1、本发明使用石英自动亚沸高纯水蒸馏器，对超纯水进行二次蒸馏，高压灭菌，得到二次蒸馏水，试验所需试剂的配制均采用此二次蒸馏水，结果表明，水和配制的试剂中均不存在细菌DNA污染。
2、本发明对柔嫩艾美耳球虫卵囊进行了分离纯化，通过对卵囊进行1.2M蔗糖漂浮、0.3M蔗糖沉淀、15％(v/v)次氯酸钠溶液及细胞裂解液处理，使得所获得的卵囊纯度很高，再通过TE和二次蒸馏水反复漂洗之后，不存在外源菌DNA污染。
3、本发明首次针对球虫卵囊中存在的外源菌DNA的污染的问题提出了一种制备无外源菌DNA污染的球虫卵囊的方法，该方法能够分离纯化出不含外源菌DNA的高纯度卵囊，极大降低了外源菌DNA污染在球虫基因组DNA研究中所带来的实验误差和风险，对于球虫卵囊基因组DNA提取、基因克隆、基因组(重)测序，以及表观遗传调控的研究等具有重要意义。
附图说明
图1为实验室普通超纯水PCR检测结果；
M：DL2000标准分子量；1：阳性对照(大肠杆菌JM109)；2：实验室普通超纯水；3：阴性对照(Microbial DNA-free water,Qiangen)
图2为常规方法纯化的柔嫩艾美耳球虫卵囊；
图3为常规方法纯化的柔嫩艾美耳球虫卵囊基因组DNA提取及PCR鉴定结果；
a：基因组DNA提取结果。1：基因组DNA；M：DL5000标准分子量；
b：细菌16s RNA基因通用引物扩增结果。M：DL2000标准分子量；1：PCR扩增结果
图4为实验室自制二次蒸馏水PCR检测结果；
M：DL2000标准分子量；1：实验室自制二次蒸馏水；2：对照(Microbial DNA-freewater,Qiangen)
图5为纯化的无外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊(Bar＝10μm)；
图6为提取的无外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊基因组DNA；
M：DL5000标准分子量；1：基因组DNA抽提结果；
图7为细菌16s RNA基因通用引物扩增结果；
1：抽提的基因组DNA为模板扩增结果；2：阳性对照(大肠杆菌JM109为模板)；3：以第二次TE漂洗卵囊后的上清为模板扩增结果；M：DL2000标准分子量
图8为基因组DNA和阳性对照扩增产物大小差异结果。
1：基因组DNA扩增产物；2：阳性对照扩增产物；M：DL5000标准分子量
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
实施例1无外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球虫卵囊制备方法
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1主要设备
石英自动亚沸高纯水蒸馏器(精达仪器制造有限公司，SYZ-135型)；
低温高速离心机(Eppendorf，5810R，A-4-62转头)；
恒温摇床(Crystal，IS-RDHⅠ)
1.1.2试验动物、卵囊
2周龄黄雏鸡，饲养于无球虫环境；
柔嫩艾美耳球虫广东株(实验室保存)。
1.1.3引物
细菌16s RNA基因通用引物：
27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT
1.1.4试剂
二次蒸馏水(使用石英自动亚沸高纯水蒸馏器对超纯水进行二次蒸馏，高压灭菌后得到)、PBS(含137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4，PH 7.6，二次蒸馏水配制)、TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，PH 8.0，二次蒸馏水配制)高压灭菌；2.5％重铬酸钾溶液(w/w，二次蒸馏水配制)；15％次氯酸钠溶液(v/v，二次蒸馏水配制)；1.2M蔗糖溶液(二次蒸馏水配制，经0.22μm滤器抽滤)；细胞裂解液Cellytic M购自SIGMA公司(Cat#:C2978)；DNA提取试剂DNAzol购自北京百泰克生物技术有限公司(Cat#:DP3001)；其它试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1柔嫩艾美耳球虫卵囊收集与孢子化
柔嫩艾美耳球虫广东株孢子化完全卵囊感染10只2周龄黄雏鸡(5万感染量/只)，感染168h后杀鸡，收集盲肠，纵向剪开肠道，收集肠内容物，肠内容物用15％次氯酸钠消化10min后，经60目、100目铜筛过滤，滤液离心(3500rpm离心10min)，沉淀加入一定量PBS重悬，3500rpm离心10min，沉淀用100mL2.5％重铬酸钾重悬于250mL锥形瓶中，29℃孢子化48h，直至95％以上卵囊完全孢子化。
1.2.2柔嫩艾美耳球虫卵囊常规纯化处理及基因组DNA提取
柔嫩艾美耳球虫卵囊常规处理及基因组DNA提取参照现有的方法进行，所需试剂的配制均采用实验室普通超纯水配制。具体步骤如下：
1)柔嫩艾美耳球虫卵囊的常规纯化处理
(1)置孢子化完全卵囊(2×108个)于50mL离心管中离心(3000rpm，10min)，弃上清；
(2)卵囊沉淀用PBS离心漂洗2次(3000rpm，10min)；
(3)卵囊沉淀用1.2M蔗糖漂浮1次(2000rpm，10min)，收集上清液；
(4)上清液加4倍体积的水稀释，离心(3000rpm，10min)，弃上清；
(5)卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次(3000rpm，10min)，弃上清；
(6)卵囊沉淀用40mL 15％次氯酸钠溶液处理15min，期间多次震荡；
(7)离心(3000rpm，10min)，弃上清；
(8)卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次(3000rpm，10min)，弃上清，沉淀即为纯化好的卵囊。
2)柔嫩艾美耳球虫卵囊的基因组DNA提取
(1)纯化好的卵囊沉淀用2mL DNAzol重悬，加入适量1.4mm珠子(Ceramicbeads，Mo Bio公司，Cat#：13113-325；使用前用20％乙醇浸泡处理，PBS反复清洗)；
(2)机械破碎12～15min，显微镜检查卵囊和孢子囊破碎情况；
(3)卵囊破碎液离心(14000rpm，10min)，去除气泡和大部分卵囊壁等杂质；
(4)收集上清至新的1.5mL EP管中；
(5)离心(14000rpm，10min)；
(6)上清转移至新的1.5mL EP管中，每1mL DNAzol加入500μL无水乙醇，颠倒混匀；
(7)离心(10000rpm，2min)，弃上清；
(8)沉淀用75％乙醇(二次蒸馏水稀释)漂洗2次(10000rpm，2min)；
(9)第二次次漂洗后，弃上清，室温晾干1～2min；
(10)50～100μL TE溶液溶解DNA；
(11)DNA浓度测定，并取5μL提取的基因组DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(12)以提取的基因组DNA为模板，以细菌16s RNA基因通用扩增引物为引物进行PCR扩增，胶回收扩增获得的片段，并进行测序分析。
1.2.3无外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球虫卵囊纯化处理及基因组DNA提取
无外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球虫卵囊无菌化处理在常规处理方法中次氯酸钠处理之后增加了细胞裂解液处理，并增加了TE和二次蒸馏水漂洗去除卵囊表面残留的外源菌DNA，所需试剂的配制均采用实验室自制二次蒸馏水。具体步骤如下：
1)无外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球虫卵囊的纯化处理
(1)置孢子化完全卵囊(3×108个)于50mL离心管中离心(3000rpm，10min)，弃上清；
(2)卵囊沉淀用PBS离心漂洗2次(3000rpm，10min)；
(3)卵囊沉淀用1.2M蔗糖漂浮1次(2000rpm，10min)，收集上清液；
(4)上清液用二次蒸馏水4倍稀释，离心(3000rpm，10min)，弃上清；
(5)卵囊沉淀用0.3M蔗糖漂洗2次(2000rpm，10min)，弃上清；
(6)卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次(3000rpm，10min)，弃上清；
(7)卵囊沉淀用40mL 15％次氯酸钠溶液处理15min，期间多次震荡，得到卵囊的悬浮液，离心(3000rpm，10min)，弃上清；
(8)卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次(3000rpm，10min)，弃上清；
(9)卵囊沉淀加入4mL Cellytic M细胞裂解液剧烈涡旋30s，室温静置1min，离心(3000rpm，10min)，弃上清；
(10)40mL TE离心漂洗2次(3000rpm，10min)，弃上清；
(11)二次蒸馏水离心漂洗1次(3000rpm，10min)，弃上清；
(12)PBS离心漂洗1次(3000rpm，10min)，弃上清，沉淀即为纯化好的卵囊。
2)柔嫩艾美耳球虫卵囊的基因组DNA提取
(1)纯化好的卵囊沉淀用2mL DNAzol重悬，加入适量1.4mm珠子(Ceramicbeads，Mo Bio公司，Cat#：13113-325；使用前用20％乙醇浸泡处理，PBS反复清洗)；
(2)机械破碎12～15min，显微镜检查卵囊和孢子囊破碎情况；
(3)卵囊破碎液离心(14000rpm，10min)，去除气泡和大部分卵囊壁等杂质；
(4)收集上清至新的1.5mL EP管中；
(5)离心(14000rpm，10min)；
(6)上清转移至新的1.5mL EP管中，每1mL DNAzol加入500μL无水乙醇，颠倒混匀；
(7)离心(10000rpm，2min)，弃上清；
(8)沉淀用75％乙醇(二次蒸馏水稀释)漂洗2次(10000rpm，2min)；
(9)第二次漂洗后，弃上清，室温晾干1～2min；
(10)50～100μL TE溶液溶解DNA；
(11)DNA浓度测定，并取5μL提取的基因组DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(12)以提取的柔嫩艾美耳球虫卵囊基因组DNA为模板，以细菌16s RNA基因通用扩增引物为引物进行PCR扩增，同时以大肠杆菌JM109为阳性对照，胶回收扩增获得的片段，并进行测序分析。
2.结果
2.1实验室普通超纯水PCR检测结果
利用细菌16s RNA基因通用引物对实验室普通超纯水进行PCR检测，结果显示，普通超纯水中存在细菌DNA污染，结果如图1所示。
2.2常规方法纯化柔嫩艾美耳球虫卵囊结果
利用常规方法纯化处理的柔嫩艾美耳球虫卵囊，结果如图2所示。
2.3常规方法处理的卵囊基因组DNA提取及PCR鉴定结果
DNA浓度测定结果显示，所提取的常规方法处理的卵囊基因组DNA浓度为150μg/mL，纯度为1.78。用细菌16s RNA基因通用引物进行PCR扩增，扩增结果显示，提取的经常规方法处理的卵囊基因组DNA能扩增出一条大小约为1500bp的条带，且有杂带，结果如图3所示。测序结果显示，提取的经常规方法处理的卵囊基因组DNA中含有大肠杆菌基因组DNA污染。
2.4实验室自制二次蒸馏水PCR检测结果
利用细菌16s RNA基因通用引物对实验室自制二次蒸馏水进行PCR检测，结果显示，自制二次蒸馏水不存在细菌DNA污染，结果如图4所示。
2.5无外源菌DNA污染的卵囊纯化结果
显微镜下观察纯化后的卵囊，所获得的卵囊纯度高，基本没有杂质，结果如图5所示。
2.6无外源菌DNA污染的卵囊基因组DNA提取及PCR鉴定结果
电泳结果显示所提取的卵囊基因组DNA量大，纯度高，且无断裂，结果如图6所示；DNA浓度测定结果显示，所提取的基因组DNA浓度为181μg/mL，纯度为1.771。
细菌16s RNA基因通用引物PCR扩增结果显示，本试验过程处理卵囊所用试剂不能扩增出条带，柔嫩艾美耳球虫卵囊基因组DNA和大肠杆菌JM109都能扩增出大小约为1500bp的单一条带，但条带大小有一定差异，结果如图7和图8所示，以提取的无外源菌DNA污染的卵囊基因组DNA为模板所获得片段测序结果如SEQID NO.1所示，以大肠杆菌JM109为模板所获得片段测序结果如SEQ ID NO.2所示。
对测序结果进行Blast分析结果显示，从提取的柔嫩艾美耳球虫基因组DNA中扩增获得的片段为球虫顶质体基因序列(Eimeria tenella apicoplast gene for 16S smallsubunit ribosomal RNA,complete sequence,strain:NIAH)，阳性对照为大肠杆菌16sRNA基因序列，PCR鉴定和测序结果表明，使用本发明的方法完全消除了外源菌DNA的污染。

Claims (7)

1.一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)置孢子化卵囊于离心管中离心，弃上清；
(2)卵囊沉淀用PBS离心漂洗2次；
(3)卵囊沉淀用1.2M蔗糖漂浮1次，离心，收集上清液；
(4)上清液用二次蒸馏水稀释，离心，弃上清；
(5)卵囊沉淀用0.3M蔗糖漂洗2次，离心，弃上清；
(6)卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次，弃上清；
(7)卵囊沉淀用体积百分数为15％的次氯酸钠溶液处理10-20min，期间多次震荡，得到卵囊的悬浮液，离心，弃上清；
(8)卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次，弃上清；
(9)卵囊沉淀加入细胞裂解液剧烈涡旋10-60s，室温静置，离心，弃上清；
(10)卵囊沉淀用TE离心漂洗2次，弃上清；
(11)卵囊沉淀用二次蒸馏水离心漂洗1次，弃上清；
(12)卵囊沉淀用PBS离心漂洗1次，弃上清，沉淀即为纯化好的卵囊。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)以及步骤(6)-步骤(12)中所述的离心是指以3000rpm离心10min，步骤(3)以及步骤(5)中所述的离心是指以2000rpm离心10min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(7)中卵囊沉淀用体积百分数为15％的次氯酸钠溶液处理15min，期间多次震荡，得到卵囊的悬浮液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(9)中所述的细胞裂解液为Cellytic M细胞裂解液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于方法中所用到的试剂均采用自制的二次蒸馏水制备，所述的二次蒸馏水是通过利用石英自动亚沸高纯水蒸馏器对实验室常规超纯水进行二次蒸馏以及高压灭菌后得到的。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的球虫卵囊为鸡球虫卵囊。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的球虫卵囊为柔嫩艾美耳球虫卵囊。
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