CN110484450A - 一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法。通过0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液和1.1 M蔗糖分离液的梯度离心，将卵囊壁从卵囊破碎液中分离纯化。实验证明，采用本方法可实现快速分离纯化艾美耳球虫未孢子化卵囊壁，回收量是传统方法的2倍以上，且纯度高，卵囊壁蛋白结构完整；另外，本方法还具有试剂配制方法简单，操作步骤简单方便等优点，对开展艾美耳球虫的研究实验具有重要价值和很强的实用性。

Description

一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法

技术领域

本方法是涉及一种用于分离纯化艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的密度梯度离心法，属于分离纯化技术领域。

背景技术

球虫是一类细胞内的专性寄生虫，在分类上隶属顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoea）、真球虫目（Eucoccidiida），其中艾美耳科（Eimeriidae）的球虫是畜禽的重要病原，引起的球虫病（Coccidiosis）给畜牧业尤其是养鸡业带来巨大的经济损失。卵囊是球虫类寄生虫的一个重要发育阶段，它由配子生殖期间受精的大配子形成，并随宿主的粪便或尿液等排出体外，在体外环境中经孢子生殖形成具有感染性的孢子化卵囊，后者污染饲料和饮水，经口感染宿主。开展对卵囊壁组成及其形成机制的深入研究，将有助于寻找用化学或免疫因子杀灭卵囊的靶点，从而为球虫类寄生虫病的防治提供新方法。因此，分离与纯化大量的球虫卵囊壁是上述研究工作的重要基础，并且，卵囊壁分离纯化的好坏将直接影响到卵囊壁的纯度及完整性，从而间接影响后期相关卵囊壁实验结果的可靠性。

本申请人实验发现，采用传统的蔗糖溶液分离方法（将卵囊破碎物在1 M蔗糖溶液中重悬，2500 g离心15 min，重复5次）纯化卵囊壁时，纯化速度慢，至少需要90 min，得到的卵囊壁含有大量未破碎的卵囊和卵囊内容物的污染，回收量低，而且由于纯化时间长，很容易导致卵囊壁蛋白降解，使得卵囊壁蛋白结构不完整。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本分离方法的目的是提供一种可提高分离速度，卵囊壁回收量和纯度的艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，以满足快速、高效率地纯化回收艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的需求。

申请人创造性地认为影响卵囊壁纯化速度慢、回收量及纯度低的主要因素是蔗糖溶液的浓度条件，改用密度梯度离心，使卵囊壁在最适的蔗糖分离液浓度下分离，可以大大缩短卵囊壁的回收时间，而且可以明显降低未破碎的卵囊和内容物的污染，提高卵囊壁的回收量和纯度。但目前还没有一种可实现用于分离纯化艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的密度梯度离心方法，以致阻碍了对艾美耳球虫卵囊壁组成及其形成机制的研究实验。为实现上述发明目的，本分离方法采用的技术方案如下：一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，在灭菌的离心管底部加入1.1 M蔗糖分离液，离心管上部缓慢加入0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液，离心得到沉淀物，所得沉淀物经PBS缓冲液洗涤若干次，离心，得到纯化的艾美耳球虫卵囊壁。加入的0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液位于1.1 M蔗糖分离液的上方，且加入0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液时不扰动1.1 M蔗糖分离液的液面。即，先将1.1 M蔗糖分离液加入离心管，然后将0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液加入离心管。

前述的PBS缓冲液的具体组成为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mMKH₂PO₄，pH 7.4。PBS缓冲液起到盐平衡的作用，保护卵囊壁蛋白的结构和生物学特性。

加入0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液后，离心条件为：3000-3200 g，15-20 min。1.1 M蔗糖分离液、0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液的体积比为1:（1.5-3）。与一般的梯度离心法相比，本方法只需要配制两个梯度区带，使用3000-3200 g低速离心即可，且试剂成本低，配制简单，离心时间短，15-20 min即可结束。

0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液的制备方法是：将纯化后的艾美耳球虫未孢子化卵囊用PBS缓冲液重悬后，加入至含有直径≤106 μm、经过酸处理的玻璃珠的管中，在涡旋混合仪上涡旋，涡旋方式为：涡旋1 min，间隔30 s，共涡旋15 次；期间用显微镜镜检卵囊破碎程度，确保卵囊破碎率达80%以上，吸取卵囊壁破碎液至管中，2500-3000 g离心5-7 min，收集沉淀物；用0.5 M蔗糖溶液重悬沉淀物，制备成0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液。经0.5 M蔗糖溶液重悬沉淀后，可将卵囊壁破碎物在分离之前呈均匀分散的状态，从而降低卵囊壁在分离过程中的阻力。选用直径≤106 μm玻璃珠可使卵囊在破碎时受力均匀，破碎程度一致；用酸处理玻璃珠，可除去玻璃珠表面的杂质，防止污染卵囊壁；采用该涡旋方式，可避免因连续涡旋导致物理产热而破坏卵囊壁蛋白结构，同时确保卵囊破碎率达80%，提高卵囊壁回收量。

0.5 M蔗糖溶液的配制方法是：称取17.1g蔗糖，用蒸馏水定容至100 mL，充分搅拌溶解，115℃，高压灭菌15 min。

1.1 M蔗糖分离液的配制方法是：称取37.62 g蔗糖，用蒸馏水定容至100 mL，充分搅拌溶解，115℃高压灭菌15 min。

将纯化后的艾美耳球虫未孢子化卵囊用PBS缓冲液重悬的步骤中，PBS缓冲液的具体组成为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH 7.4。

相较于现有技术，本分离纯化方法具有如下有益技术效果：

本方法将卵囊破碎物配置成0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液，不仅使得卵囊破碎物在分离前分散均匀，而且降低了卵囊壁在分离过程中的阻力。采用1.1 M蔗糖溶液为分离液，利用卵囊和卵囊壁的密度差异，有效的去除了未破碎的卵囊和杂质，从而实现了快速、高效分离纯化回收艾美耳球虫未孢子化卵囊壁。实验结果表明，通过3 mL 1.1 M蔗糖分离液，5 mL 0.5M蔗糖卵囊壁破碎液，在3000-3200 g离心15-20 min后即可完成分离纯化过程，回收量是传统方法的2倍以上，且纯度高，卵囊壁蛋白结构完整。另外，本分离方法还具有试剂配制方法简单，操作步骤简单方便，纯化效率高等优点，对开展艾美耳球虫的研究实验具有重要价值和很强的实用性；因此，本纯化方法对于现有技术，取得了显著性进步。

附图说明

图1是分离纯化的艾美耳球虫未孢子化卵囊（400×）；

图2是用本梯度离心法分离纯化的艾美耳球虫未孢子化卵囊壁（400×）；

图3是用传统方法分离纯化的艾美耳球虫未孢子化卵囊壁（400×）；

图4是蛋白定量标准曲线；

图5是本梯度离心法分离纯化的艾美耳球虫未孢子化卵囊壁和传统方法分离纯化的艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的蛋白定量结果；

图6是未孢子化卵囊蛋白，本梯度离心法分离纯化的艾美耳球虫未孢子化卵囊壁蛋白和传统方法分离纯化的艾美耳球虫未孢子化卵囊壁蛋白的SDS-PAGE分析，M：标准蛋白质相对分子质量标记；1：未孢子化卵囊蛋白（10 µg）；2：本梯度离心法所得卵囊壁蛋白（10 µg）；3：传统方法所得卵囊壁蛋白（10 µg）。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

将1×10⁸个纯化后的艾美耳球虫未孢子化卵囊（图1）用2 mL PBS缓冲液重悬后，加入至含有2 g玻璃珠 （直径≤106 μm，酸处理）的5 mL指形管中，在微型涡旋混合仪上涡旋（涡旋1 min，间隔30 s，共涡旋15 次），期间用显微镜镜检卵囊破碎程度，确保卵囊破碎率达80%以上，吸取卵囊破碎液至1.5 mL指形管中，3000 g离心5min，收集沉淀物。用5 mL0.5 M蔗糖溶液重悬沉淀物，制备成0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液。

在灭菌的15 mL玻璃离心管底部加入3 mL 1.1M 蔗糖分离液，上部缓慢加入5 mL0.5 M 蔗糖卵囊壁破碎液（切勿破坏液面），3000 g离心15min，用200 μL 移液器缓慢伸入离心管底部吸取沉淀物，所得沉淀物经PBS缓冲液（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mMNa₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH 7.4）重复洗涤3次以后8000 g离心5 min，所得沉淀物即为纯化后的艾美耳球虫未孢子化卵囊壁，定容到1 mL后，吸取10 μL卵囊壁混悬液，均匀涂布到载玻片上，显微镜下观察，可见卵囊壁含量多，纯度高，几乎没有杂质（图2）。

同时取1×10⁸个纯化后的艾美耳球虫未孢子化卵囊，采用传统方法收集卵囊壁（将卵囊破碎物在1 M蔗糖溶液中重悬，2500 g离心15 min，重复5次），定容到1 mL后，吸取10 μL卵囊壁混悬液，均匀涂布到载玻片上，显微镜下观察，可见卵囊壁含量少，纯度低，有大量杂质（图3）。

用本梯度离心法纯化的未孢子化卵囊壁（由1×10⁸个卵囊破碎后梯度离心分离纯化所得），传统方法纯化的未孢子化卵囊壁（由1×10⁸个卵囊破碎后分离纯化所得），分别加入液氮研磨成粉末，在1 mL PBS中重悬后冰浴超声裂解（功率30%，超声2s，间歇3s，超声4min），4℃，12000 g离心15 min，取上清，即为两种方法所得卵囊壁总蛋白。用TaKaRaBradford Protein Assay Kit试剂盒进行蛋白定量，以BSA Standard Solution作为标准品建立标准曲线（图4），横坐标为吸光度值，纵坐标代表蛋白含量，标准曲线的相关系数为0.9821，标准曲线可信度高，满足蛋白定量要求。测得本梯度离心法纯化的未孢子化卵囊壁蛋白浓度为399.543 µg/mL，蛋白总量为399.543 µg；传统方法纯化的未孢子化卵囊壁蛋白浓度为189.691µg/mL，蛋白总量为189.691µg。本梯度离心法纯化的未孢子化卵囊壁蛋白总量是传统方法纯化的未孢子化卵囊壁总量的2.1倍（图5）。

分别取分离纯化后的未孢子化卵囊蛋白，本梯度离心法分离纯化的未孢子化卵囊壁蛋白和传统方法纯化的未孢子化卵囊壁蛋白各10 µg与6×上样缓冲液按1：5的体积混合均匀，煮沸10 min，12000 g离心10 min，取上清进行SDS-PAGE分析，采用5%浓缩胶，12%分离胶，90V恒压电泳120min，电泳完毕后取出凝胶，使用考马斯亮蓝快速染色法进行显色（图6）。结果显示，未孢子化卵囊蛋白和本梯度离心法纯化的卵囊壁蛋白条带清晰，未孢子化卵囊蛋白条带大小主要集中于18.4-116.0 KDa之间，有21条主带，本梯度离心法纯化的卵囊壁蛋白条带大小主要集中于18.4-66.2 KDa之间，有16条主带。与未孢子化卵囊蛋白相比，本梯度离心法纯化的卵囊壁蛋白的所有主带均存在于卵囊蛋白的多个条带中。与传统方法纯化的未孢子化卵囊壁蛋白相比，本梯度离心法纯化的卵囊壁蛋白主带清晰，且在约40KDa，44 KDa处条带明显亮于传统方法纯化的未孢子化卵囊壁蛋白。说明本梯度离心法纯化的卵囊壁蛋白与传统方法相比较，结构完整。

以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，在灭菌的离心管底部加入1.1 M蔗糖分离液，离心管上部缓慢加入0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液，离心得到沉淀物，所得沉淀物经PBS缓冲液洗涤若干次，离心，得到纯化的艾美耳球虫卵囊壁。

2.根据权利要求1所述的一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液的具体组成为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH7.4。

3.根据权利要求1所述的一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，加入0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液后，离心条件为：3000-3200 g，15-20 min。

4.根据权利要求1所述的一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，1.1 M蔗糖分离液、0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液的体积比为1:（1.5-3）。

5.根据权利要求1所述的一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液的制备方法是：将纯化后的艾美耳球虫未孢子化卵囊用PBS缓冲液重悬后，加入至含有直径≤106 μm、经过酸处理的玻璃珠的管中，在涡旋混合仪上涡旋，涡旋方式为：涡旋1 min，间隔30 s，共涡旋15 次；期间用显微镜镜检卵囊破碎程度，确保卵囊破碎率达80%以上，吸取卵囊壁破碎液至管中，2500-3000 g离心5-7 min，收集沉淀物；用0.5 M蔗糖溶液重悬沉淀物，制备成0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液。

6.根据权利要求5所述的一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，0.5 M蔗糖溶液的配制方法是：称取17.1g蔗糖，用蒸馏水定容至100 mL，充分搅拌溶解，115℃，高压灭菌15 min。

7.根据权利要求1所述的一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，1.1 M蔗糖分离液的配制方法是：称取37.62 g蔗糖，用蒸馏水定容至100 mL，充分搅拌溶解，115℃高压灭菌15 min。

8.根据权利要求1所述的一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，加入的0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液位于1.1 M蔗糖分离液的上方，且加入0.5 M蔗糖卵囊壁破碎液时不扰动1.1 M蔗糖分离液的液面。

9.根据权利要求5所述的一种艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的制备方法，其特征在于，将纯化后的艾美耳球虫未孢子化卵囊用PBS缓冲液重悬的步骤中，PBS缓冲液的具体组成为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH 7.4。