CN102220310B - 一种提取纯化唾液dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取纯化唾液DNA的方法。该方法包括以下步骤：1)预处理：将唾液与预处理裂解液接触，去除生物细胞所粘附的固体物质，得到粗裂解液；2)核酸吸附：将步骤1)得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，形成含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA的复合体；3)洗涤：将步骤2)得到的磁性纳米微球-DNA的复合体依次用洗涤液I、洗涤液II洗涤，然后用洗脱液溶出DNA。本发明提供的方法提取DNA的效率可达90％，提取的DNA可应用于STR复合扩增、DNA测序、DNA定量等下游分析操作。

Description

一种提取纯化唾液DNA的方法

本申请是如下发明的分案申请：申请日为2009年8月5日、申请号为200910090336.0、发明名称为一种提取纯化DNA的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种提取纯化DNA的方法。

背景技术

DNA分离纯化是分子生物学实验中非常重要的操作，核酸的质量直接关系到后续操作能否顺利进行。生物学、法医学和基因组学的发展，强化了对从各种生物检材中获得核酸的复杂方法的需求。例如，脱氧核糖核酸提供了广泛的关于遗传起源和遗传多态性信息。这些信息可用于法医遗传学鉴定实践。

目前所存在的各种核酸纯化方法皆可分成以下两大类：液相纯化和固相纯化。在液相纯化中，核酸维持为液体状态，而杂质通过沉淀、离心被除去或者核酸被沉淀出来，而杂质被保留；在固相纯化中，核酸被结合到固相载体上，而杂质被选择性洗脱。例如，采用液相纯化来分离的DNA保留在液相中，而杂质被通过诸如沉淀和/或离心之类的方法除去。在固相纯化中DNA结合到固相载体上，而杂质如RNA、蛋白质和磷脂等被选择性洗脱。在DNA纯化中，如果起始材料包括细胞，液相方法和固相方法都需要细胞或病毒共破裂，或裂解步骤。破裂或裂解步骤产生与污染物如RNA、脂质、碳水化合物、蛋白质等混合的DNA。这种混合物还含有降解DNA的必须被除去和/或灭活以不感染产生基本上未降解的DNA的DNA酶。两个纯化大类以前都利用常规的方法，需要繁琐的步骤，且通常用到有害的试剂，现在也出现了更快速的提取方法，如Chelex-100法，仅需要较少的步骤，且通常较少的有害试剂。

Chelex-100法一种快速液相DNA纯化方法，Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力.能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合金属离子，防止DNA降解。利用螯合剂去除生物样本中金属杂质而达到纯化的目的。该法首先用去离子水洗涤生物样本，加入螯合树脂的悬浮液56℃孵育一定时间，100℃孵育8分钟，然后通过离心去除杂质。该方法简单、快速(仅涉及到两种试剂的使用)。但该法提取得到的DNA纯度不够，不能满足微量DNA生物样本DNA提取纯化的要求。

固相提取方法近年来发展迅速，在核酸提取领域占有非常重要的地位。这类方法一般需要四个主要步骤：裂解细胞使细胞膜、核膜DNA破裂以释放DNA；释放的DNA与固相载体结合；杂质的洗涤；洗脱而得到纯化的DNA。对于固相DNA纯化，已使用了多种固相载体，如二氧化硅微球、薄膜过滤器、金属氧化物、胶乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。当核酸存在于在高浓度离液盐以及低的pH溶液中时，能够吸附到硅类介质表面，并在低盐高pH溶液中洗脱下来，从而达到提取纯化目的。Vogelstein直接使用玻璃粉从琼脂糖凝胶中提取到DNA，而Marko使用玻璃粉成功提纯质粒DNA。Boom等对该方法加以改进，用二氧化硅和硅藻土为固相吸附剂，用来提取纯化人血清或尿液中的微量病原体基因组DNA。该方法需要六步离心、五种试剂从全血种纯化DNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取纯化DNA的方法。

本发明提供的提取纯化DNA的方法，包括以下步骤：

1)预处理：将生物样品与预处理裂解液接触，去除生物细胞所粘附的固体物质，得到粗裂解液；

2)核酸吸附：将步骤1)得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，DNA将与磁珠结合，形成了含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA的复合体；

3)洗涤：将步骤2)得到的磁性纳米微球-DNA的复合体依次用洗涤液I、洗涤液II洗涤，然后用洗脱液溶出DNA，得到纯化的DNA。

上述步骤1)中，所述生物样品是血液、血斑、组织、阴道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑或脱落细胞时，所述预处理裂解液的pH为7.4-8.5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：10-100mM缓冲盐，0.5-5g/100ml的表面活性剂，1-100mM的螯合剂和50-150mM的可溶性盐，0.2-4mg/ml的蛋白酶K。

精斑和毛发中DNA的提取，需在预处理裂解液中加入DTT(二硫苏糖醇)，上述步骤1)中，所述生物样品是精液、精斑或毛发时，所述预处理裂解液的pH为7.4-8.5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：10-100mM缓冲盐，0.5-5g/100ml的表面活性剂，1-100mM的螯合剂，50-150mM的可溶性盐，0.2-4mg/ml的蛋白酶K和0.025-0.05M的二硫苏糖醇。

上述预处理裂解液中，缓冲盐的浓度优选为20-80mM，表面活性剂的浓度优选为0.5-4g/100ml，螯合剂的浓度优选为20-80mM，可溶性盐的浓度优选为50-130mM，更优选为80-100mM；蛋白酶K的浓度优选为0.2-2mg/ml，更优选浓度为0.2-1mg/ml。

所述预处理裂解液中的表面活性剂为阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂，优选是阴离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠或十二烷基肌氨酸钠。

所述预处理裂解液还包括一种可溶性盐溶液，DNA从细胞核中释放并与组蛋白分离后，需要提高DNA在溶液中的溶解度。DNA在一定浓度氯化钠溶液中的溶解度很高，Na⁺与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这使DNA在溶液中呈溶解状态并维持DNA在溶液中的稳定性。所以在某些实施例中，可以使用NaCl等可溶性盐。

蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛。

各种生物样品，如血液、血斑、精液、精斑、毛发、组织、阴道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑或脱落细胞等首先要经过预处理裂解液浸泡，并在50-65℃的温度下孵育0.5h-4h时间后，方可进行后续提取操作。孵育的温度可优选为56℃。

通过预处理裂解液对生物样本的预处理，一是能够使载体上黏附的细胞(如血白细胞、精子细胞、上皮细胞等)和DNA与载体分离或与组织脱离，游离在预处理裂解液中；二是裂解细胞，使DNA和蛋白质、磷脂等污染物释放至消化液中，通过离心等方法去除载体后即形成粗裂解液并完成样本预处理。

所述步骤1)预处理中，本发明中的生物样品如血斑、唾液斑等一般取3*3mm为宜，这类样本比较小，预处理裂解液可在100-200ul范围内变化；对于体积较大样本，预处理裂解液的量一般以完全覆盖住生物样本为宜，但最多不能超过300ul。

预处理后形成的粗裂解液中包含DNA及蛋白质、细胞碎片、磷脂等细胞污染物。为了更充分的裂解细胞，最大程度的使DNA从细胞中释放出来，并使释放出来的DNA与磁性微球结合以达到分离纯化的目的，可以使用裂解结合液。

所述步骤2)核酸吸附中，每ml磁珠悬浮液的组分如下：直径为50-1200nm的纳米级硅包被磁性微球50-100mg，其余为水。每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球优选是50mg。

所述裂解结合液的pH＝6.4-7.4，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：20-150mM的缓冲盐，3-8M的Chaotropic盐，1-10％(体积百分比)的表面活性剂，0.5-4g/100ml的兼性离子去污剂，10-100mM的螯合剂以及15-30％(体积百分含量)的醇。

上述裂解结合液中，离液盐(Chaotropic盐)优选为4-6M，缓冲盐优选为50-120mM的Tris-HCl，螯合剂优选为20-80mM，表面活性剂的浓度优选为1-8％(体积百分比)，兼性离子去污剂的浓度优选为1-3g/100ml，醇优选为20-28％(体积百分含量)；所述裂解结合液中的表面活性剂优选用非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂为Triton X-100、Tween 20、Tween 21、Tween.40、Tween 60、Tween80、Tween 85、NP-40、Brij 30或Span 20；所述兼性离子去污剂是3-(3-胆胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸；所述醇是乙醇、异丙醇或聚乙二醇。

所述步骤2)核酸吸附中，粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合可以先将粗裂解液与裂解结合液混合，然后再往粗裂解液和裂解结合液中加入磁珠悬浮液。加入磁珠悬浮液混合的条件是室温(20-30℃)混合5-8分钟。

上述裂解结合液与粗裂解液的比例关系是(2～3)∶1。

上述磁珠悬浮液与裂解结合液、粗裂解液的比例关系是(10-30)μl∶(200-900)μl∶(100-300)μl。

上述步骤3)洗涤中，所述洗涤液I的溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：4-6M的Chaotropic盐，25-50％(体积百分含量)的醇和10-100mM的螯合剂；所述洗涤液II是75％-80％的乙醇水溶液；所述洗脱液是是TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是0-20mM的Tris-HCl，0-2mM的EDTA。

上述洗涤液I和II用来洗涤DNA-磁性纳米微球形成的复合体，以除去与磁珠结合的除核酸以外的污染物如蛋白质、磷脂。

上述洗涤液I中，Chaotropic盐的浓度优选为4.2-5.8M，醇优选为30-45％(体积百分含量)的乙醇，螯合剂优选为20-80mM；所述洗涤液II优选75％的乙醇水溶液。

所述洗脱液中的Tris-HCl的浓度优选10mM、EDTA优选是1mM，所述洗脱液pH优选为8.0。在除去与固相载体结合的蛋白质、磷脂等污染物后，必须将与固相载体结合的DNA洗脱至水相溶液中才能应用于后续法医DNA分析。DNA-磁性微球复合体与洗脱液接触后，可以使DNA与固相载体分离。洗脱液可以是低离子强度的水相溶液，也可以是无离子水或是一定PH的低离子强度的水溶液。洗脱液PH值必须能够保证DNA稳定性、完整性。可以是低浓度TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)洗脱与固相载体结合的DNA。

上述步骤3)洗涤可一次或多次。

步骤3)中，对于DNA含量较低的样本(如脱落细胞，腐败微量生物样本等)，为了增加获得DNA的浓度，选择用30ul洗脱液。常规样本一般选择50ul洗脱体积

上述缓冲盐为Tris-HCl、磷酸缓冲盐或HEPES缓冲盐。

上述的Chaotropic盐在水性溶液中具有高溶解度。高浓度的Chaotropic盐能够引起蛋白质打开折叠、破坏核酸的二级结构并使变性的蛋白质和双链DNA溶解。通常认为，这是由于Chaotropic盐离子能够破坏其所在溶液体系中的氢键网络，使变性的蛋白质和变性DNA表现出比其正确折叠或天然构象时更高的热动力学稳定性，而且能够保证让DNA优先结合到磁性纳米微球上。这种Chaotropic盐可以是任何已知的Chaotropic盐，如异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍、尿素、碘化钠、碘化钾、氯化锂、高氯酸钠、三氯醋酸盐。发明中使用的是胍盐(如异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍)。尤其是异硫氰酸胍，能够更好的裂解细胞并抑制核酸酶的活性，是一中非常有效DNA纯化试剂。Chaotropic盐可以3～8M浓度存在于裂解结合液中。在本发明任何一种含有Chaotropic盐的试剂中，Chaotropic盐的浓度必须要低于其所在该试剂中的溶解度。一定Chaotropic盐的浓度大小能够影响DNA与磁性纳米微球结合。Chaotropic盐必须达到一定的浓度才能促使DNA与磁性微球的结合。但是过高的盐浓度会使蛋白质变性和DNA降解，并从溶液中沉淀出来。蛋白质和大分子的双链DNA在Chaotropic盐浓度为0.5～2M时稳定存在于溶液中。相反，RNA、小分子DNA如单链DNA、DNA片段，在浓度为2～5M时稳定纯在于溶液体系中。

上述的螯合剂是一种能够与Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+等金属离子相结合的复合物。螯合剂中至少有两个的非金属离子与游离金属阳离子形成共价键并与其结合，与螯合剂结合的金属离子将不再游离于溶液体系中。当溶液体系中有螯合剂存在时，会降低溶液中金属离子的浓度。游离金属离子浓度的降低使核酸酶失活，能够有效防止DNA被核酸酶降解、起到保护DNA完整性的作用。很多可供使用的螯合剂，不仅限于EDTA、EGTA、CDTA等。

本发明所提供的方法能够实现从各种类型生物样本(血液、血斑、精液、精斑、毛发、组织、阴道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑、脱落细胞等接触性检材、腐败陈旧检材)烟蒂中提取、纯化DNA。且能够同时满足常规及微量DNA的样本的提取要求。利用本发明方法所得的DNA无需进一步纯化，即可应用于STR复合扩增、DNA测序、DNA定量等下游分析操作。利用本发明的方法提取的DNA特别适合应用于PCR扩增(STR、DNA测序、实时荧光定量PCR等)。

本发明提供的方法基于磁性微球的固相分离技术从各种不同类型生物样本中提取纯化DNA。包被有二氧化硅的磁性或超顺磁性纳米微球具备与核酸发生可逆结合的能力。通过改变磁珠和DNA所处的溶液环境条件，能够控制DNA与磁珠的结合和分离；通过改变外加磁场力，能够控制固相载体和液相的分离。磁珠等固相载体在某些化学物质和盐配制的结合液中能够与DNA结合，形成磁性纳米微球-DNA复合体，磁分离去除液相成分后，用洗涤液洗去磁珠上结合的除核酸以外的污染物如蛋白质、磷脂等。最后通过加入低盐浓度的洗脱液或去离子水将结合在磁珠表面的DNA洗脱下来，达到分离纯化的目的。

本发明的有益效果如下：

整体操作简单、快速

广泛的生物样本适用范围，能够实现大多数生物样本的DNA提取

裂解效果好，保证细胞的充分裂解以释放DNA

纯化能力强，能够在混合有大量PCR抑制剂或污染物的样本中得到足够纯且可完全满足于下游PCR、DNA测序、实时荧光定量等操作的DNA

提取效率高。能够达到90％以上的提取效率，最大化避免DNA在提取操作过程的损失。将该发明提供的试剂和方法应用于已知浓度的DNA标准品的提取，经过整个提取过程，通过以下公式计算得到提取效率(洗脱得到的DNA量(ng)/加入DNA标准品(G1471，Promega公司)总量(ng))。

能够有效提高痕量、降解等微量DNA生物样本的STR分型成功率。

灵活的试剂体系，通过扩大试剂的操作体系，可实现大体积样本中所含微量DNA样本的富集。

整个操作能够避免离心操作，可适用用于各种DNA自动化提取操作平台。

附图说明

图1为采用实施例1的试剂和方法提取DNA的效果验证图，其中图1A是微量血液的DNA STR分型图谱，图1B是荧光定量PCR电泳图谱。

图2为3×3mm血斑(FTA卡)STR分型图谱。

图3为棉签上血斑(2ul抗凝血)STR分型图谱。

图4为2μl液态抗凝血与PCR抑制剂等混合在无色棉布上形成血斑的STR图谱。

图5为2μl液态抗凝血滴在牛仔裤形成血斑的STR分型图谱。

图6为1μl精液在无色棉布上形成精斑的STR分型图谱。

图7为50μl唾液滴在棉签上形成的口腔拭子的STR分型图谱。

图8为烟蒂STR分型图谱。

图9为自然脱落毛发STR分型图谱。

图10为人体组织块的DNATyper^TM15STR分型图谱。

图11为手机上的脱落细胞STR分型图谱。

图12为毛衣上的脱落细胞STR分型图谱。

图13为钱包上脱落细胞STR分型图谱。

图14为杯口脱落细胞STR分型图谱。

图15为键盘脱落细胞STR分型图谱。

图16为腐败血斑STR分型图谱。

图17为腐败组织STR分型图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、提取纯化微量血液中的DNA以及效果验证

一、提取纯化微量血液中的DNA以及STR复合扩增分析

1、试剂

试剂如下：

预处理裂解液：pH为7.4，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：10mMTris-HCl，0.5g/100ml的十二烷基磺酸钠(SDS)，1mM的EDTA和50mM的NaCl水溶液，0.5mg/ml的蛋白酶K。

裂解结合液：pH为6.4，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：50mM的Tris-HCl，3M的异硫氰酸胍，1％(体积百分比)的Triton X-100，0.5g/100ml的3-(3-胆胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，10mM的EDTA以及15％(体积百分含量)的乙醇。

洗涤液I：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：4M的盐酸胍，25％(体积百分含量)的乙醇和10mM的EDTA。

洗涤液II：75％(体积百分含量)乙醇水溶液。

洗脱液：是TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA。

磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是60nm)(奥润微纳新材料科技有限公司)为50mg，其余为水。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

1)预处理

在1.5ml离心管中首先加入100ul预处理裂解液，然后将0.1ul液态抗凝血加入预处理裂解液中，涡旋振荡，56℃温浴30min。充分振荡后，通过离心去除载体(指生物细胞所粘附或附着的固体物质)，得到粗裂解液。

2)核酸吸附于固相载体

往步骤1得到的粗裂解液中分别加入磁珠悬浮液(加入量为10μl浓度为50mg/ml的溶液)和300μl的裂解结合液，形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中。

3)复合体分离

将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中分离出。

4)洗涤

往离心管中加入500μl洗涤液I，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；

往离心管中加入500μl洗涤液II，漩涡振荡洗涤后吸弃液体，重复本操作一次。

洗涤可以将结合在固相载体(磁性纳米微球)上的核酸之外的物质去除。

5)洗脱

在洗涤结束后，用20ul枪头吸干残留液体，室温晾干5-10min(室温超过30℃时，晾干5min即可；室温低于30℃时晾干7-10分钟，但最多不可超过10min)。然后往离心管中加入30μl的洗脱液，65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

3、STR复合扩增分析

将实施例1提取的DNA进行STR复合扩增，复合扩增采用的是市售的商业STR复合扩增试剂盒(如美国ABI公司的Id试剂盒)。然后用3130型遗传分析仪检测，结果如图1A所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA纯度高，完整性好。

二、提取纯化微量血液中的DNA以及浓度检测

1、提取DNA

从不同体积(1、2、3、4和5μl)的液态抗凝血中提取DNA。提取的方法与上述步骤一相同，其区别在于所用试剂的量：

提取1、2、3、4μl液态抗凝血中的DNA的方法与上述步骤一相同，并且所用的预处理裂解液均是100μl；磁珠悬浮液均是10ul；裂解结合液均是300ul；洗涤液I均是500ul；洗涤液II均是500ul；洗脱液均是30ul。

提取5μl液态抗凝血中的DNA，所用的预处理裂解液200μl；磁珠悬浮液20ul；裂解结合液600ul；洗涤液I 500ul；洗涤液II500ul；洗脱液50ul。

利用实时荧光定量PCR试剂盒(Quantifler^TM Human，ABI公司)和

荧光定量系统检测所提取的DNA的浓度，结果如表1所示，该试剂盒整体提取效率高。

表1还显示：采用两种不同的定量方法(实时荧光定量PCR和染料定量)，两种方法定量结果相当，表明DNA完整性卓越，表明DNA在提取的过程中DNA断裂极少。

表1.不同体积液态抗凝血中提取的DNA的浓度检测结果

三、DNA提取效率评价

采用300ng DNA标准品(G1471，Promega公司)作为初始DNA(60ul)，采用实施例1步骤一提供的试剂和方法进行提取，通过DNA荧光定量方法检测出最终回收的DNA量，并按照公式【提取效率＝洗脱得到的DNA回收量(ng)/加入DNA标准品的量(300ng)】计算出DNA提取效率。

其中，荧光定量PCR的实验设计如下：

1)配制7份含300ng DNA(30ul体系)的标准品，其中6份作为样本，采用本发明的试剂和方法进行提取。余下一份作为阳性对照，与其余6份同样的标准品在DNA提取后进行电泳比较；

2)为了便于比较，6个提取样本仍然采用30ul体系洗脱；

3)在获得6个30ulDNA样本后，最终在每个30体系中同样取20ul样本，上样并进行电泳检测。

电泳图如图1B(M为分子量Marker(λ/HindIII DNA分子量Marker)，其分子量范围500bp-23kb；1-6为该专利提供试剂和方法提取得到的DNA(在30ul体系中取20ul电泳)；阳性对照为含有300ng DNA标准品(在30ul体系中取20ul电泳)所示，通过1-6号样本和阳性对照的电泳结果比较，发现1-6号样本在DNA电泳条带的亮度、宽度和位置等方面与阳性对照样本基本一致，表明在提取过程中DNA损失小，DNA提取效率高，所提取DNA完整性好。而且，DNA荧光定量结果表明该发明提供的试剂和方法DNA提取效率高于90％。

定量结果如表2所示，DNA提取效率高达93.67％。

表2.DNA提取效率

实施例2、提取纯化血斑中的DNA以及效果验证

将FTA卡上3×3mm血斑作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

一、提取纯化血斑中的DNA

1、试剂

试剂如下：

预处理裂解液：pH为8.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：50mMTris-HCl，3g/100ml的十二烷基磺酸钠(SDS)，50mM的CDTA和100mM的NaCl水溶液，0.2mg/ml的蛋白酶K。

裂解结合液：pH为7.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：100mM的Tris-HCl，5M的异硫氰酸胍，5％(体积百分比)的Triton X-100，2g/100ml的3-(3-胆胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，50mM的EDTA以及20％(体积百分比)的乙醇。

洗涤液I：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：5M的盐酸胍，35％(体积百分含量)的乙醇和50mM的EDTA。

洗涤液II：75％(体积百分含量)乙醇水溶液。

洗脱液：是TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA。

磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是200nm)(奥润微纳新材料科技有限公司)为50mg，其余为水。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

1)预处理

在1.5ml离心管中首先加入200ul预处理裂解液，然后将FTA卡上3×3mm血斑加入预处理裂解液中，涡旋振荡，56℃温浴30min。

充分振荡后，通过离心去除载体(指生物细胞所粘附或附着的固体物质)，得到粗裂解液。

2)核酸吸附于固相载体

往步骤1得到的粗裂解液中分别加入磁珠悬浮液(加入量为20μl浓度为50mg/ml的溶液)和600μl的裂解结合液，形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中。

3)复合体分离

将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中分离出。

4)洗涤

往离心管中加入500μl洗涤液I，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；重复本操作一次

往离心管中加入500μl洗涤液I，漩涡振荡洗涤后吸弃液体，重复本操作一次。

洗涤可以将结合在固相载体(磁性纳米微球)上的核酸之外的物质去除。

5)洗脱

在洗涤结束后，用20ul枪头吸干残留液体，室温晾干5-10min(室温超过30℃时，晾干5min即可；室温低于30℃时晾干7-10分钟，但最多不可超过10min)。然后往离心管中加入50μl的洗脱液，65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图2所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA纯度高，完整性好。

实施例3、提取纯化血斑中的DNA以及效果验证

将2μl抗凝血滴在棉签上的样品作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

一、提取纯化DNA

1、试剂

试剂如下：

预处理裂解液：pH为8.5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：100mM磷酸盐(100mM NaH₂PO₄，20mM NaCl，pH 8.2)，5.0g/100ml的十二烷基肌氨酸钠(SLS)，100mM的EGTA和150mM的NaCl水溶液，5.0mg/ml的蛋白酶K。

裂解结合液：pH为7.4，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：150mM的Tris-HCl，8M的硫氰酸胍，10％(体积百分比)的Tween 20，4.0g/100ml的3-(3-胆胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，100mM的EGTA以及30％(体积百分含量)的异丙醇。

洗涤液I：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：6M的硫氰酸胍，50％(体积百分含量)的乙醇和100mM的EDTA。

洗涤液II：80％(体积百分含量)乙醇水溶液。

洗脱液：是TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是20mM的Tris-HCl，2mM的EDTA。

磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是600nm)(奥润微纳新材料科技有限公司)为50mg，其余为水。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

1)预处理

在1.5ml离心管中首先加入200ul预处理裂解液，然后将滴在棉签上的2ul液态抗凝血加入预处理裂解液中，涡旋振荡，56℃温浴30min。

充分振荡后，通过离心去除载体(指生物细胞所粘附或附着的固体物质)，得到粗裂解液。

2)核酸吸附于固相载体

往步骤1)得到的粗裂解液中分别加入磁珠悬浮液(加入量为20μl浓度为50mg/ml的溶液)和600μl的裂解结合液，形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中。

3)复合体分离

将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中分离出。

4)洗涤

往离心管中加入500μl洗涤液I，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；重复本操作一次

往离心管中加入500μl洗涤液II，漩涡振荡洗涤后吸弃液体，重复本操作一次。

洗涤可以将结合在固相载体(磁性纳米微球)上的核酸之外的物质去除。

5)洗脱

在洗涤结束后，用20ul枪头吸干残留液体，室温晾干5-10min(室温超过30℃时，晾干5min即可；室温低于30℃时晾干7-10分钟，但最多不可超过10min)。然后往离心管中加入50μl的洗脱液，65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图3所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法能够有效提取到载体表面所粘附细胞内的DNA，得到的DNA纯度高，完整性好。

实施例4、提取纯化血斑中的DNA以及效果验证

将2μl抗凝血、PCR抑制剂滴在棉布上形成的血斑作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA，其中，该抑制剂为1ul血红素(0.5mM)和1ul腐殖酸(2.5mg/ml)组成的混合物。

一、提取纯化DNA

1、试剂

试剂如下：

预处理裂解液：pH为7.7，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：30mMTris-HCl，2.0g/100ml的十二烷基肌氨酸钠(SLS)，30mM的EGTA和80mM的NaCl水溶液，2.0mg/ml的蛋白酶K。

裂解结合液：pH为7.1，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：80mM的Tris-HCl，4M的硫氰酸胍，2％(体积百分比)的Tween 20，1.5g/100ml的3-(3-胆胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，30mM的EGTA以及24％(体积百分含量)的异丙醇。

洗涤液I：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：4.4M的盐酸胍，30％(体积百分含量)的乙醇和30mM的EDTA。

洗涤液II：80％(体积百分含量)乙醇水溶液。

洗脱液：是TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是1mM的EDTA。

磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是1000nm)(奥润微纳新材料科技有限公司)为50mg，其余为水。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

1)预处理

在1.5ml离心管中首先加入200ul预处理裂解液，然后将本实施例的生物样品加入预处理裂解液中，涡旋振荡，56℃温浴30min。

充分振荡后，通过离心去除载体(指生物细胞所粘附或附着的固体物质)，得到粗裂解液。

2)核酸吸附于固相载体

往步骤1得到的粗裂解液中分别加入磁珠悬浮液(加入量为20μl浓度为50mg/ml的溶液)和600μl的裂解结合液，形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中。

3)复合体分离

将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中分离出。

4)洗涤

往离心管中加入500μl洗涤液I，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；重复本操作一次

往离心管中加入500μl洗涤液II，漩涡振荡洗涤后吸弃液体，重复本操作一次。

洗涤可以将结合在固相载体(磁性纳米微球)上的核酸之外的物质去除。

5)洗脱

在洗涤结束后，用20ul枪头吸干残留液体，室温晾干5-10min(室温超过30℃时，晾干5min即可；室温低于30℃时晾干7-10分钟，但最多不可超过10min)。然后往离心管中加入50μl的洗脱液，65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图4所示，STR峰型较好，峰值较高，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例5、提取纯化血斑中的DNA以及效果验证

将2μl抗凝血滴在牛仔裤上作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

一、提取纯化DNA

1、试剂

试剂如下：

预处理裂解液：pH为8.3，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：70mMTris-HCl，4g/100ml的十二烷基肌氨酸钠(SLS)，70mM的EGTA和120mM的NaCl水溶液，4mg/ml的蛋白酶K。

裂解结合液：pH为7.3，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：120mM的Tris-HCl，6M的盐酸胍，3％(体积百分含量)的Tween 20，3g/100ml的3-(3-胆胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，70mM的EGTA以及26％(体积百分含量)的聚乙二醇。

洗涤液I：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：5.6M的碘化钾，45％(体积百分含量)的乙醇和70mM的EDTA。

洗涤液II：75％(体积百分含量)乙醇水溶液。

洗脱液：是TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl。

磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是1200nm)(奥润微纳新材料科技有限公司)为50mg，其余为水。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

提取纯化DNA的方法与实施例3提供的方法的区别在于提取纯化DNA的试剂不同，其余完全相同。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图5所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例6、提取纯化精斑中的DNA以及效果验证

将1μl精液滴在无色棉布上作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

精斑的提取与常规检材存在微小差异，即在预处理裂解液中需加入DTT(二硫苏糖醇)才能正常提取。

一、提取纯化DNA

1、试剂

试剂如下：

预处理裂解液：pH为7.6，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：90mMTris-HCl，4.5g/100ml的十二烷基磺酸钠(SDS)，6mM的EDTA和70mM的NaCl水溶液，1.0mg/ml的蛋白酶K，0.05M DTT(二硫苏糖醇)。

裂解结合液：pH为7.2，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：20mM的Tris-HCl，7M的硫氰酸胍，2.5％(体积百分比)的Tween 21，1.0g/100ml的3-(3-胆胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，20mM的EGTA以及18％(体积百分含量)的异丙醇。

洗涤液I：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：4.6M的高氯酸钠，40％(体积百分含量)的乙醇和15mM的EDTA。

洗涤液II：75％乙醇水溶液。

洗脱液：是TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA。

磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是50nm)(奥润微纳新材料科技有限公司)为100mg，其余为水。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

1)预处理

在1.5ml离心管中首先加入200ul预处理裂解液，然后将本实施例的生物样品加入预处理裂解液中，涡旋振荡，56℃温浴30min。

充分振荡后，通过离心去除载体(指生物细胞所粘附或附着的固体物质)，得到粗裂解液。

2)核酸吸附于固相载体

往步骤1)得到的粗裂解液中分别加入磁珠悬浮液(加入量为20μl浓度为100mg/ml的溶液)和600μl的裂解结合液，形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中。

3)复合体分离

将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从粗裂解液和裂解结合液组成的溶液体系中分离出。

4)洗涤

往离心管中加入500μl洗涤液I，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；重复本操作一次

往离心管中加入500μl洗涤液II，漩涡振荡洗涤后吸弃液体，重复本操作一次。

洗涤可以将结合在固相载体(磁性纳米微球)上的核酸之外的物质去除。

5)洗脱

在洗涤结束后，用20ul枪头吸干残留液体，室温晾干5-10min(室温超过30℃时，晾干5min即可；室温低于30℃时晾干7-10分钟，但最多不可超过10min)。然后往离心管中加入50μl的洗脱液，65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃或-20℃保存。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图6所示，STR图谱显示STR峰值较高，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例7、提取纯化唾液中的DNA以及效果验证

将50μl唾液滴在棉签上形成的口腔拭子作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

一、提取纯化DNA

1、试剂

所用试剂与实施例2的区别在于所述氯化钠水溶液的浓度为130mM，其余试剂完全相同。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

用步骤1的试剂提取纯化DNA的步骤与实施例2提供的步骤以及所用的各试剂的量完全相同。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图7所示，STR图谱显示STR峰值较高，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例8、提取纯化烟蒂中的DNA以及效果验证

将烟蒂作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

一、提取纯化DNA

1、试剂

所用试剂与实施例7的区别在于所用氯化钠溶液的浓度为90mM，其余试剂完全相同。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

提取方法与实施例7相同。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图8所示，STR图谱显示STR峰值较高，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例9、提取纯化毛发中的DNA以及效果验证

将自然脱落的毛发的毛根部分(总长度约为1-3mm)作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

毛发的提取与常规检材还存在差异，即在预处理裂解液中需加入DTT(二硫苏糖醇)才能正常提取。

一、提取纯化DNA

1、试剂

所用试剂与实施例6的区别在于所用氯化钠溶液的浓度为110mM，其余试剂完全相同。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

提取步骤与实施例6相同。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图9所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例10、提取人体组织中的DNA以及效果验证

将人体组织块(1-2mm³肌肉组织)作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

一、提取纯化DNA

1、试剂

所用试剂与实施例7的区别在于所用氯化钠溶液的浓度为140mM，其余试剂完全相同。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

提取步骤与实施例7相同。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图10所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例11、提取人体脱落细胞中的DNA以及效果验证

将手机上的脱落细胞作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。其中，脱落细胞的获取步骤包括以下步骤：用镊子取少许棉签(10-20mg)浸湿后擦拭脱落细胞所在物体表面，随后取少许干燥棉签(10-20mg)重复擦拭湿润表面，将两粘附有脱落细胞的载体一并加入到预处理裂解液中，涡旋振荡。

一、提取纯化DNA

1、试剂

所用试剂与实施例1相同。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

提取步骤与实施例2相同。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图11所示，STR峰值较高，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例12-15

实施例12提取的是毛衣上的脱落细胞的DNA，实施例13提取的是钱包上脱落细胞的DNA，实施例14提取的是杯口脱落细胞的DNA，实施例15提取的是键盘脱落细胞的DNA。

实施例12-15中的脱落细胞的获得方法、提取该脱落细胞的DNA所用的试剂和提取的方法与实施例11均相同，其STR复合扩增分析检测结果如图12、13、14和15所示，STR峰值较高，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好并具较好的完整性。

实施例16、腐败生物样品DNA提取结果

将3×3mm的腐败血斑作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

一、提取纯化DNA

1、试剂

所用试剂与实施例1相同。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

提取步骤与实施例2相同。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图16所示，STR位点完整，无大片段位点丢失现象，分型准确，无等位基因丢失、Pull up峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，获得了符合STR复合扩增要求的模板DNA

实施例17、腐败生物样品DNA提取结果

将1-2mm³的腐败组织作为生物样品，提取纯化该样品中的DNA。

一、提取纯化DNA

1、试剂

所用试剂与实施例1相同。

2、用步骤1的试剂提取纯化DNA

提取步骤与实施例2相同。

二、STR复合扩增分析

将上述步骤得到的DNA进行STR复合扩增分析，其方法与实施例1提供的方法相同，结果如图17所示，STR位点完整，无大片段STR位点丢失，分型准确，无Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，所得DNA纯度高，该试剂能够在腐败生物样本中纯化得到相对完整的DNA片段。

Claims (1)

1.提取纯化人体唾液DNA的方法，包括以下步骤：

1）预处理：用预处理裂解液裂解生物样品，得到粗裂解液，所述生物样品是唾液；其中，

预处理裂解液：pH为8.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：50mM Tris-HCl，3g/100ml的十二烷基磺酸钠SDS，50mM的CDTA和130mM的NaCl水溶液，0.2mg/ml的蛋白酶K；

2）核酸吸附：将步骤1）得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，形成含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA的复合体；其中，

裂解结合液：pH为7.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：100mM的Tris-HCl，5M的异硫氰酸胍，体积百分比为5%的Triton X-100，2g/100ml的3-(3-胆胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸，50mM的EDTA以及体积百分比为20%的乙醇；

磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球为50mg，其余为水，纳米级硅包被磁性微球的直径是200nm；

3）洗涤：将步骤2）得到的磁性纳米微球-DNA的复合体依次用洗涤液I、洗涤液II洗涤，然后用洗脱液溶出DNA，得到纯化的DNA；其中，

洗涤液I：溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：5M的盐酸胍，体积百分含量为35%的乙醇和50mM的EDTA；

洗涤液II：体积百分含量为75%的乙醇水溶液 ；

洗脱液：是TE溶液，所述TE溶液的pH为8.0，溶剂是水，溶质是10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA。 

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