CN101050414A - 无创微量采样dna抽提试剂盒及dna抽提方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物DNA检测技术领域，具体为一种无创微量采样DNA抽提试剂盒及DNA抽提方法本发明的试剂盒中包含裂解液、硅胶吸附剂、洗涤液和洗脱液。使用该试剂盒法抽提的DNA产物含量及质量能很好满足后续PCR、测序等等的一系列操作。使用本发明的试剂盒，操作采用单管式方式进行，可有效防止了DNA成分的流失，避免了提取过程的转移带来的污染，且“原孔原位”的抽提模式，可结合96孔板进行大通量规模化成批抽提，有利于产业化发展。本发明，克服了现有的DNA抽提方法繁琐耗时、效率不高的局限性，不仅能有效地提高抽提产物的质与量，且在一定程度上解决了人体采样难而敏感的问题。

Description

无创微量采样DNA抽提试剂盒及DNA抽提方法

技术领域

本发明属于生物DNA检测技术领域，具体涉及一种可快捷、廉价、无污染、无创伤地进行人体DNA抽提的试剂盒及DNA抽提方法。

背景技术

目前，对人体进行的采样多为血液和组织等，使用的方法普遍为酚氯仿抽提法以及市面上现有的试剂盒。这样的采样方式不仅有损于人体，还会涉及到民族、宗教等敏感问题，而抽提效果也不尽理想。

传统的酚氯仿抽提法，虽然能较高效地抽提血液DNA，但由于使用到大量的有机试剂，不仅会使抽提产物带有化学抑制剂，影响到后续的一系列操作(PCR、酶反应和测序等)，且反复的抽提、离心过程十分繁琐耗时，同时抽提过程中多处使用到的有机试剂对实验操作者本人的伤害较大。同时由于存在酚-氯仿污染，获取的DNA收获率低，纯度不高。

而市场上现有的DNA抽提试剂盒，虽然提取过程相对酚氯仿法操作简单，步骤少，耗时较短，同时有效地降低了抽提产物污染的风险。其DNA获得效果与硅胶吸附法相仿。但由于成本高，一次提取DNA量小，无法在大规模生产应用中使用。

传统的硅胶法着重于古DNA的提取分析。由于其对象特殊，试剂用量和具体操作条件不能直接应用于无创的微量或痕量样本DNA提取。且其传统硅胶法的参数设置较为模糊，实验移植性、可重复性不强。

发明内容

本发明的目的在于提出一种能够无创微量或痕量采样，且能适应规模化生产使用的DNA抽提试剂盒及DNA抽提方法，以便克服现有的DNA抽提方法的不足，改变人体有损伤采样的局面，提高抽提产物的质与量，且在一定程度上解决人体采样难而敏感的问题。

本发明提出的无创微量采样DNA抽提试剂盒，包含裂解液、硅胶吸附剂、洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液中含异硫氰酸胍溶液，裂解无创采样或微量样品中的细胞；所述硅胶吸附剂中包含粒径为200nm-1μm的硅胶颗粒作为吸附载体，特异性吸附DNA；所述洗涤液包括含异硫氰酸胍溶液的洗涤液A、含乙醇溶液的洗涤液B和含丙酮溶液的洗涤液C三种洗涤液；所述洗脱液为1×TE溶液。

上述试剂盒中，所用溶液的组成如下：

(1).裂解液：GuSCN(异硫氰酸胍)，EDTA，Tris-HCl，Triton X-100。

          50-60g    GuSCN

          50-60ml     0.1M Tris-HCl pH 6.4

          4.4-5ml     0.5MEDTA pH 8.0

          1.3-1.5g    Triton X-100

(2).洗涤液A：GUSCN(异硫氰酸胍)，Tris-HCl。

          100-120g    GuSCN

          90-100ml    0.1M Tris-HCl pH 6.4

(3).洗涤液B：70-75％乙醇

(4).洗涤液C：丙酮

(5).洗脱液：Tris-Hcl，EDTA(灭菌)。

本发明的试剂盒中，操作采用单管式方式进行，过程中无须更换eppendorf管，这不仅最大程度地防止了有效DNA成分的流失，以及提取过程的转移带来的污染，还能节省资源，降低成本。且该试剂盒应用另外单管式操作是“原孔原位”抽提的基础，这将成为产业化的理想模式，可结合96孔板进行大通量规模化成批抽提。

使用本发明的试剂盒进行DNA(人体)抽提的步骤如下：

(1)提取样品放入样品管内。

(2)加1-1.5mL裂解液，放入50-56℃温浴中充分反应；

(3)加50-100μl(可根据实际情况调整)硅胶吸附剂，混匀，充分颠换；

(4)充分离心，弃上清；

(5)用1-1.5mL洗涤液A重悬，充分离心，弃上清；重复本步骤1次；

(6)用1-1.5mL洗涤液B重悬两次，充分离心；

(7)用1-1.5mL洗涤液C重悬一次，充分离心；

(8)室温烘2-5min；

(9)加50-100μl洗脱液，56-65℃溶解；

(10)离心，取上清。

本发明的有益效果是，可以在人体无创伤采样的基础上有效地进行DNA抽提，提高了抽提产物的质与量，且抽提产物能满足后续一系列操作。

经实验对比表明，本发明试剂盒抽提口腔细胞DNA在方法上可行，效率明显高于普通的酚氯仿法，同目前的试剂盒(博光)抽提结果类似。见图1-图3所示。

本发明试剂盒抽提整个抽提过程约为1-1.5小时，明显比酚氯仿法快捷，如果加上RNaseA的DNA纯化步骤，略慢于一般的试剂盒抽提法。

本发明试剂盒单个成本约为1.5～2RMB，远低于一般的试剂盒成本。

本发明试剂盒由于采用硅胶吸附DNA的方法进行提取，弃用杂质时操作较酚氯仿法更为简便。

本发明是基本按照裂解、吸附、清洗、洗脱的过程将DNA提取出来。由于让DNA吸附在硅胶上，从而进行不断地清洗提取，最后从硅胶上洗脱出纯化后的DNA，故亦称为硅胶吸附法。硅胶吸附法通过吸附住DNA，并对吸附了DNA的硅胶在溶液中沉淀或不沉淀的状态控制，从而能更方便的处理上清，简化了操作和避免了污染。能够在相对较短时间内对大批人体无创微量样品中进行快速高效的DNA提取。

附图说明

图1-图3为分别用本发明试剂盒、酚氯仿法和通常的DNA试剂盒，从相同等量口腔细胞样品中提取DNA的效果比较。其中，1、2为用本发明的试剂盒抽提结果，3、4为用酚氯仿法抽提结果，5、6用通常的试剂盒法抽提结果。

图1、抽提电泳：

未做RNaseA消化前，3、4、5、6都参杂很多RNA，效果很差。

图2、经RNaseA 55℃30min处理。可见，用本发明试剂抽提结果优于一般试剂盒方法更优于酚氯仿方法。

图3、PCR产物电泳检测(Taq I，zdd)。各DNA均有明显PCR产物条带。

图4：人体头发及唾液DNA提取产物凝胶电泳图谱。图中，1-3分别为：1、3、5根头发的DNA抽提物，4、5均为唾液样DNA抽提产物。

图5：人体头发及唾液DNA提取产物PCR产物检测。图中，1-3分别为1、3、5根头发DNA的PCR产物，4：空白对照组，5、6：唾液DNA的PCR产物，

具体实施方式

实施例1，试剂盒各组分的配置

溶液成份：

(1)裂解液：GuSCN(异硫氰酸胍)，EDTA，Tris-HCl，Triton X-100；

(2)洗涤液A：GUSCN(异硫氰酸胍)，Tris-HCl；

(3)洗涤液B：70％乙醇；

(4)洗涤液C：丙酮；

(5)洗脱液：Tris-Hcl，EDTA(灭菌)。

实施例2，人体头发及唾液DNA提取

首先进行无创微量采样：

(1)头发：拔取实验对象的头发，分别取1根、3根、5根，用洁净干燥的剪刀剪取发根基部约0.5-1cm置于1.5mL的eppendorf管中；

(2)唾液：用1.5mL的eppendorf管直接装取实验对象的唾液约0.3mL。

具体抽提步骤如下：

(1)分别加入裂解液1mL，56℃水浴1h；

(2).加20μl硅胶吸附剂混匀，充分颠换；

(3)充分离心后，弃上清；

(4)1mL洗涤液A重悬，充分离心，弃上清。重复该步骤一次；

(5)1mL洗涤液B重悬两次，充分离心；

(6)1mL洗涤液C重悬一次，充分离心；

(7)室温烘干2-5min；

(8)加50μl洗脱液，65℃溶解；

(9)离心，取上清。

实施例3，DNA提取产物的检验

对实施例2中得到的抽提产物经紫外分光光度计于260nm处测定，计算可得，1、3、5根头发DNA提取量分别约为100ng、300ng、500ng，0.3mL唾液DNA提取量约为2.0ug，换算成实验次数分别为10、30、50、200次。抽提物的凝胶电泳图谱见图4所示。

实施例4，DNA提取产物的PCR鉴定

对实施例2中得到抽提产物用PCR鉴定，

1.PCR扩增反应所用引物为：

L15974：5’TCCACCATTAGCACCCAAAG 3’

H16488：5’AGGAACCAGATGTCGGATACAG 3’

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.反应循环条件为：

3.反应体系：10μl

PCR结果见图5所示。

Claims (3)

1、一种无创微量采样DNA抽提试剂盒，其特征在于包含裂解液、硅胶吸附剂、洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液中含异硫氰酸胍溶液；所述硅胶吸附剂中包含粒径为200nm-1μm的硅胶颗粒作为吸附载体，特异性吸附DNA；所述洗涤液包括含异硫氰酸胍溶液的洗涤液A、含乙醇溶液的洗涤液B和含丙酮溶液的洗涤液C三种洗涤液；所述洗脱液为1×TE溶液。

2.根据权利要求1所述的无创微量采样DNA抽提试剂盒，其特征在于所述的各溶液组分如下：

(1).裂解液：

          50-60g     异硫氰酸胍

          50-60ml    0.1M Tris-HCl pH 6.4

          4.4-5ml    0.5MEDTA pH 8.0

          1.3-1.5g   Triton X-100

(2).洗涤液A：

          100-120g   异硫氰酸胍

          90-100ml   0.1M Tris-HCl pH 6.4

(3).洗涤液B：70-75％乙醇

(4).洗涤液C：丙酮

(5).洗脱液：Tris-Hcl，EDTA。

3.一种如使用如权利要求1所述的无创微量采样DNA抽提试剂盒抽提DNA的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1).提取适量样品放入样品管内；

(2).加1-1.5mL裂解液，放入50-56℃温浴中充分反应；

(3).加50-100μl硅胶吸附剂，混匀，充分颠换；

(4).充分离心，弃上清；

(5)用1-1.5mL洗涤液A重悬，充分离心，弃上清；重复本步骤一次；

(6).用1-1.5mL洗涤液B重悬两次，充分离心；

(7).用1-1.5mL洗涤液C重悬一次，充分离心；

(8).室温烘2-5min；

(9).加50-100μl洗脱液，56-65℃溶解；

(10).离心，取上清。

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