CN114107486A - 一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒及其应用 Download PDF

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吴文立
王倩玉
肖江山
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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒及其应用。该发明提供了SOD1基因检测的引物及其试剂盒，通过设计一组引物对，一个反应孔完成逆转录和PCR，然后通过测序、比对，将SOD1基因的5个外显子整合到一起，能够快速、准确且灵敏地检测出整个SOD1基因编码区的序列，实验结果可靠，精密度高。填补了临床SOD1基因位点突变检测的空白，为相关疾病后续的治疗提供及时的预判。本发明检测时间周期短，最快能在8小时内完成检测，极大的节约了检测时间，提高临床诊断效率。操作简单、成本低廉；本方法通过RT‑PCR加sanger测序完成检测，对操作人员的要求极其简单，试剂成本低廉，便于临床推广。

Description

一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒及其应用。
背景技术
肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclero-sis，ALS)是最常见的缓慢进展性运动神经元疾病，以肢体和延髓上、下运动神经元损害并存为特征，临床表现为进行性四肢骨骼肌萎缩、无力、肌束震颤，并伴有肌张力增高、腱反射亢进、病理征阳性，最终呼吸衰竭死亡，患者平均生存期为3～5年。根据其发病和遗传特点可分为遗传型(<10％)和散发型(>90％)，二者临床特征无明显区别。ALS的发病机制尚不完全清楚，目前已发现一些与ALS相关的基因位点，超氧化物歧化酶1(superoxidedis-mutase1，SOD1)基因突变是中国人群高发致病基因。
研究表明，突变产生的SOD1蛋白获得毒性功能，损伤神经元的结构和功能，加剧细胞氧化和应激损伤反应。SOD1基因突变诱发的氧化功能下降或丧失可能不是突变SOD1蛋白毒性的起始因素，但突变产生的SOD1蛋白异常折叠而形成蛋白质的异常聚集亦有可能启动ALS的发生。但是目前没有专门用于SOD1基因突变快速简便检测试剂盒。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒及其应用。
本发明所采用的技术方案为：一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括SOD1基因检测液，所述SOD1基因检测液包括SOD1基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1：ATGGCGACGAAGGCCGTG；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2：GGGATCGCCCAATAA。
上述该试剂盒的检测液仅设计了一组引物对，发明人通过对引物对的设计，可以将SOD1基因的5个外显子整合到一起，能够快速、准确且灵敏地检测出整个SOD1基因编码区的序列，实验结果可靠，精密度高。
作为优选地，所述SOD1基因检测液的所述引物对的浓度为200-400nM。
作为优选地，所述试剂盒还包括扩增反应体系、测序反应液、阳性对照品、阴性对照品和无核酶水。
作为优选地，所述扩增反应体系包括taq DNA聚合酶、dNTPs、dsDNA染料、PCR扩增缓冲液、Mg2+、UNG酶和dUTP。
作为优选地，所述测序反应液包括测序染料、测序反应液和去离子甲酰胺。
作为优选地，所述测序染料包括脱氧核苷三磷酸、双脱氧核苷三磷酸和DNA聚合酶。
作为优选地，所述测序反应液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
作为优选地，所述阳性对照品为含有SOD1基因突变位点的质粒；
所述SOD1基因的突变位点为H46R、V47A、G37R、Cys111Tyr和Gly147Asp。
一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒的应用，所述试剂盒在肌萎缩侧索硬化SOD1基因检测中非诊断目的应用。
本发明的有益效果为：
本发明旨在建立一种能够在临床快速便捷开展超氧化物歧化酶1基因突变检测方法及试剂盒，有助于提高我国超氧化物歧化酶1基因检测水平。
(一)本发明有效满足了临床SOD1基因检测需求，提供了SOD1基因位点检测的引物、试剂盒及检测方法，能够快速、准确且灵敏地检测出基因突变位点。为相关治疗方案的制定提供及时的预判。实验结果重复性好，精密度高。另外，本发明检测时间周期短，最快能在8小时内完成检测，极大的节约了检测时间，加快临床诊断效率，是一种高效的辅助检测手段。
(二)造成肌萎缩侧索硬化的原因多种多样，其中关于基因组学方面，现阶段研究较明确的有超氧化物歧化酶1(superoxidedis-mutase1，SOD1)、反式激活反应-DNA结合蛋白(TARDBP)基因、C9orf72基因、肉瘤熔合(FUS)基因。本发明可以从基因突变的一个层面上辅助找出造成肌萎缩侧索硬化的根本原因，进行针对性治疗和复健。
(三)由于肌萎缩侧索硬化分为家族性和散发性，如果夫妻其中之一是家族性基因突变的携带者，子女患病的概率较大，所以针对此突变的检测对于优生优育有着重大意义。
(四)本发明采用RT-PCR-sanger(reversetranscriptional PCR-sanger)测序法进行检测，该方法以mRNA为模板，直接针对基因编码区域，具有灵敏度高、耗时短、通量高、一次检测全基因编码区等优点。本发明旨在建立一种利用RT-PCR-sanger测序技术简便、快速、准确检测人SOD1基因位点突变的引物及试剂盒，为临床诊断提供参考依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：
本发明建立了一种利用PCR-sanger测序技术简便、快速、准确、高通量检测人SOD1基因突变位点引物及试剂盒，从而为SOD1基因突变的检测提供参考依据，试剂盒保存于-20℃。试剂盒规格：50人份/盒，具体组分见表1。
表1试剂盒组分
Figure BDA0003415580720000041
Figure BDA0003415580720000051
扩增反应液：购自南京诺唯赞生物科技有限公司(货号：PM101-01/02/03)。
检测位点及序列陈列表：
Figure BDA0003415580720000052
Figure BDA0003415580720000061
试剂盒性能验证
1、样本处理
选用企业参考品进行试剂盒性能验证。所有样本按照美基生物核酸提取试剂盒(产品编号：IVD4173)进行核酸，所得DNA样本保存于2-8℃；若样本长时间不使用可保存于-20℃。
2、PCR扩增
按下表配置PCR扩增反应液(每个反应45μL)
组分 1个反应体积
检测液 6μL
扩增反应液 31μL
RNase Free ddH<sub>2</sub>O 8μL
总体积 45μL
将配置好的PCR扩增反应液按45μL每个反应空进行分装。将已提取好的样品DNA、阳性对照品DNA、阴性对照品DNA各5μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。
3扩增程序：
95℃ 5min(1个循环)；95℃ 30sec，60℃ 90sec，72℃ 30sec(35个循环)；72℃10min(1个循环)；4℃∞(1个循环)。
4产物纯化：
PCR扩增结束以后，取5μL PCR产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带扩增(目的条带大小约为450bp)，如观察到目的条带，则将上述PCR产物及时进行纯化，具体操作详见PCR产物纯化试剂盒说明书。按试剂盒步骤纯化获得的PCR产物进行电泳鉴定定值(PCR产物浓度范围为10-50ng)，可立即进行测序PCR或置于-20±2℃保存备用(保存时间不要超过2天)。
5测序PCR：
经过电泳鉴定定值的PCR产物，按下表配制测序PCR体系：
试剂 用量
PCR产物 XμL(约3-10ng)
BigDye 2μL
BigDye Sequencing Buffer 3μL
测序引物 1μL
RNase Free ddH<sub>2</sub>O 14-XμL
总体积 20μL
将各反应管放入定性PCR仪，按下列条件扩增：96℃ 1分钟→(96℃ 10秒→50℃ 5秒→60℃ 4分钟)×25个循环→4℃保温。
6测序准备：
6.1取测序PCR反应结束后的PCR反应管，各PCR反应管加入2μL 125mmol/L EDTA和2μL 3mol/L醋酸钠(pH 5.2)到管底。
6.2再加入50μL 100％无水乙醇，盖紧管盖，短时振荡后，室温避光放置15分钟。
6.3 4℃下12000rpm离心30分钟，立即小心去上清(若不能立即操作，请在操作前重新离心3分钟)。
6.4每管加入150μL预冷70％乙醇，4℃下12000rpm离心10分钟，立即小心去上清(尽量将管底的70％乙醇吸干净，若不能立即操作，请在操作前重新离心3分钟)，此步骤可重复操作一次。
6.5室温避光放置15-30分钟(观察管底液体，使70％乙醇挥发干净)，此步骤产物可密封避光置于-20±2℃保存5天。
6.6加入10μL Hi-Di Formamide，短时振荡溶解DNA，进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底。
6.7溶解后的样品在定性PCR仪上95℃变性5分钟，迅速置冰中冷却4分钟后，准备上样电泳。
7基因分析仪测序：
7.1加样：变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，盖好，按加样顺序编辑样品列表。根据测序仪型号选用具有IVD标志的Seq_std_BDTV3.1_ASSYXL_POP7或Seq_std_BDTV3.1_ASSY_POP7进行测序
7.2使用ABI基因分析仪时，应用ABI公司Data Collectio与Sequencing Analysis软件进行数据收集和分析。Data Collection与Sequencing Analysis分析软件的进一步信息请参阅Data Collection与Analysis Software用户手册。测序结果自动保存在预设位置，反应结束后打开测序结果进行分析，得到.ab1、.phd.1格式的文件。
8结果分析：
8.1运行SeqScanner程序，导入测序结果。
8.2测序结果.应用软件对比野生型序列逐个碱基比较，查找突变点，记录突变的碱基类型即可。
9试剂盒性能：
9.1阳性符合率100％：对企业参考品的阳性(表2)样本进行检测，结果均为阳性，阳性符合率为100％。
表2.SOD1突变位点企业阳性参考品
Figure BDA0003415580720000091
9.2阴性符合率100％：对企业参考品中的阴性(表3)样本进行检测，检测结果为阴性，符合率100％。
表3.SOD1突变位点企业阴性参考品
Figure BDA0003415580720000092
Figure BDA0003415580720000101
9.3重复性：检测20ng/μL的P1，重复检测10次，CV≤5％。
9.4最低检出限：本试剂盒最低检测限为5ng/μL。
本试剂盒对稀释至不低于5ng/μL的P1，检测结果均为阳性。
实验例：
对50份临床样本检测
1.1样本处理
采集10名肌萎缩侧索硬化症患者及40名健康人受检者离体血液标本。
样本采集要点：采用紫色头盖管(含有乙二胺四乙酸以及其盐的采血管)采集静脉血，采集后4℃保存备用。
每份样本取200μL，按照美基生物核酸提取试剂盒(产品编号：IVD4173)进行核酸提取DNA待用。
1.2PCR扩增
按下表配置PCR扩增反应液(每个反应45μL)
Figure BDA0003415580720000102
Figure BDA0003415580720000111
将配置好的PCR扩增反应液液按45μL每个反应空进行分装。将已处理样本DNA、阳性对照品DNA、阴性对照品DNA各5μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。
1.3扩增程序：
95℃ 5min(1个循环)；95℃ 30sec，60℃ 90sec，72℃ 30sec(35个循环)；72℃10min(1个循环)；4℃∞(1个循环)。
1.4产物纯化：
PCR扩增结束以后，取5μL PCR产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带扩增(目的条带大小为465bp)，如观察到目的条带，则将上述PCR产物及时进行纯化，具体操作详见PCR产物纯化试剂盒说明书。按试剂盒步骤纯化获得的PCR产物进行电泳鉴定定值(PCR产物浓度范围为10-50ng)，可立即进行测序PCR或置于-20±2℃保存备用(保存时间不要超过2天)。
1.5测序PCR：
经过电泳鉴定定值的PCR产物，按下表配制测序PCR体系：
Figure BDA0003415580720000112
Figure BDA0003415580720000121
将各反应管放入定性PCR仪，按下列条件扩增：96℃ 1分钟→(96℃ 10秒→50℃ 5秒→60℃ 4分钟)×25个循环→4℃保温。
1.6测序准备：
1.6.1取测序PCR反应结束后的PCR反应管，各PCR反应管加入2μL 125mmol/L EDTA和2μL 3mol/L醋酸钠(pH 5.2)到管底。
1.6.2再加入50μL 100％无水乙醇，盖紧管盖，短时振荡后，室温避光放置15分钟。
1.6.3 4℃下12000rpm离心30分钟，立即小心去上清(若不能立即操作，请在操作前重新离心3分钟)。
1.6.4每管加入150μL预冷70％乙醇，4℃下12000rpm离心10分钟，立即小心去上清(尽量将管底的70％乙醇吸干净，若不能立即操作，请在操作前重新离心3分钟)，此步骤可重复操作一次。
1.6.5室温避光放置15-30分钟(观察管底液体，使70％乙醇挥发干净)，此步骤产物可密封避光置于-20±2℃保存5天。
1.6.6加入10μL Hi-Di Formamide，短时振荡溶解DNA，进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底。
1.6.7溶解后的样品在定性PCR仪上95℃变性5分钟，迅速置冰中冷却4分钟后，准备上样电泳。
1.7基因分析仪测序：
1.7.1加样：变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，盖好，按加样顺序编辑样品列表。根据测序仪型号选用具有IVD标志的Seq_std_BDTV3.1_ASSYXL_POP7或Seq_std_BDTV3.1_ASSY_POP7进行测序。
1.7.2使用ABI基因分析仪时，应用ABI公司Data Collection与SequencingAnalysis软件进行数据收集和分析。Data Collection与Sequencing Analysis分析软件的进一步信息请参阅Data Collection与Analysis Software用户手册。测序结果自动保存在预设位置，反应结束后打开测序结果进行分析，得到.ab1、.phd.1格式的文件。
1.8结果分析：
1.8.1运行SeqScanner程序，导入测序结果。
1.8.2测序结果.应用软件对比野生型序列逐个碱基比较，查找突变点，记录突变的碱基类型即可。
最终试剂盒检测结果显示其中6例阳性，44例阴性(野生型)，下表为本次检测结果与WES检测结果对比，40例阴性完全一致，未列出。
表3. 50例临床阳性样本SOD1突变检测结果与WES对比
Figure BDA0003415580720000131
Figure BDA0003415580720000141
本试剂盒对10例合肌萎缩侧索硬化症患者基因突变检测发现6例基因突变，阳性检出率60％；对40例健康人进行基因突变检测未发现有SOD1基因突变携带者，与WES检测结果一致。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京华诺奥美基因医学检验实验室有限公司
<120> 一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> SOD1–F（上游引物） 核苷酸序列
<400> 1
atggcgacga aggccgtg 18
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> SOD1-R（下游引物）核苷酸序列
<400> 2
gggatcgccc aataa 15
<210> 3
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(465)
<223> SOD1基因野生型cDNA序列
<400> 3
atggcgacga aggccgtgtg cgtgctgaag ggcgacggcc cagtgcaggg catcatcaat 60
ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattaa aggactgact 120
gaaggcctgc atggattcca tgttcatgag tttggagata atacagcagg ctgtaccagt 180
gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga aaacacggtg ggccaaagga tgaagagagg 240
catgttggag acttgggcaa tgtgactgct gacaaagatg gtgtggccga tgtgtctatt 300
gaagattctg tgatctcact ctcaggagac cattgcatca ttggccgcac actggtggtc 360
catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtacaaa gacaggaaac 420
gctggaagtc gtttggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aataa 465

Claims (9)

1.一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SOD1基因检测液，所述SOD1基因检测液包括SOD1基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1：ATGGCGACGAAGGCCGTG；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2：GGGATCGCCCAATAA。
2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述SOD1基因检测液的所述引物对的浓度为200-400nM。
3.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增反应体系、测序反应液、阳性对照品、阴性对照品和无核酶水。
4.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应体系包括taq DNA聚合酶、dNTPs、dsDNA染料、PCR扩增缓冲液、Mg 2+、UNG酶和dUTP。
5.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述测序反应液包括测序染料、测序反应液和去离子甲酰胺。
6.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述测序染料包括脱氧核苷三磷酸、双脱氧核苷三磷酸和DNA聚合酶。
7.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述测序反应液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
8.根据权利要求3所述的一种超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有SOD1基因突变位点的质粒；
所述SOD1基因的突变位点为H46R、V47A、G37R、Cys111Tyr和Gly147Asp。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的超氧化物歧化酶1基因突变检测试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒在肌萎缩侧索硬化SOD1基因检测中非诊断目的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105463083A (zh) * 2015-12-11 2016-04-06 上海新培晶医学检验所有限公司 一种检测进行性家族性肝胆汁淤积症基因突变的试剂盒及其检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105463083A (zh) * 2015-12-11 2016-04-06 上海新培晶医学检验所有限公司 一种检测进行性家族性肝胆汁淤积症基因突变的试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘晓鹏, 姜宁, 余伯胜, 向常青, 袁勤生: "人铜锌超氧化物歧化酶(hCu, Zn-SOD)基因在马铃薯中的表达", 中国生物制品学杂志, no. 02 *
宋凯等: "人SOD基因的克隆与原核表达", 人SOD基因的克隆与原核表达, vol. 27, no. 12, pages 94 *
施惠娟, 范立强, 魏东芝, 袁勤生, 孙建新, 吴祥甫: "人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆、测序及表达", 生物化学与生物物理学报, no. 01 *
邹漳钰: "肌萎缩侧索硬化的遗传学和基础研究", 中国博士电子期刊, pages 9 *

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