CN117887842A

CN117887842A - 一种家族遗传性渐冻症早筛引物组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN117887842A
Application number: CN202410304272.4A
Authority: CN
Inventors: 张海峰; 陈基沈
Original assignee: Zhejiang Baidi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Baidi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-03-18
Filing date: 2024-03-18
Publication date: 2024-04-16

Abstract

本发明属于分子生物学及医学诊断领域，具体涉及一种家族遗传性渐冻症早筛引物组、试剂盒及其应用。本发明的引物组及试剂盒能够快速地帮助家族遗传性ALS患者子女早期确认是否携带遗传突变，检测范围广，检测准确且工作量少，同时所述引物组及试剂盒也可用于散发性ALS的早期筛查，为患者的早期诊断、预后判断乃至治疗提供帮助。

Description

一种家族遗传性渐冻症早筛引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和医学诊断领域，具体涉及一种家族遗传性渐冻症早筛引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

肌萎缩侧索硬化症（ALS）俗称渐冻症，是一种慢性进行性疾病，主要影响上运动神经元（大脑、脑干、脊髓）和下运动神经元（颅神经核、脊髓前角细胞）及其支配的躯干、四肢和头面部肌肉。临床上，ALS通常表现为上、下运动神经元合并受损的混合性瘫痪。具体症状包括上肢周围性瘫痪、下肢中枢性瘫痪，以及上下运动神经元混合性损害。此外，患者还可能出现构音不清、吞咽困难、饮水呛咳等球麻痹症状。体检时，可能会观察到舌肌萎缩、肌束颤动等情况，而双下肢则可能出现痉挛性瘫痪、肌张力增高、腱反射亢进等症状。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）主要分为两种类型：散发性和家族性。

1. 散发性的ALS：这是一种非遗传性的形式，通常表现为散在发病的患者。散发性ALS 的病因尚不清楚。长期以来，人们一直认为它是多因素的，易感基因和多种环境因素共同作用下，导致的可能包括免疫系统异常、毒性暴露、线粒体功能障碍或谷氨酸毒性等所引起。

2. 家族性的ALS：这是遗传性的形式，通常在有遗传倾向的家庭中出现。

全基因组关联研究发现，由于家族性ALS(FALS)及散发性ALS（SALS）患者的基因变异存在许多相似之处。而且患者在临床表现、肌电图特征、病理改变上惊人的相似，因此，FALS成为研究ALS的重要的切入点。ALS的遗传方式有常染色体显性遗传，常染色体隐性遗传或X连锁方式遗传，在过去三十年中研究鉴定了30多种致病基因，其中少数基因已被明确归类为家族性ALS（FALS，占10%）相关致病基因。其中4个基因C9orf72， SOD1， FUS， TARDBP的突变可以解释80%常染色体显性遗传性家族性病例。

SOD1基因位于人类染色体21q22.1，长11kb，5个外显子，编码153个氨基酸，组成32KD的Cu/ZnSOD蛋白，分布于细胞胞浆内。SOD1是SOD家族的成员之一。SOD是机体中主要的抗氧化酶，主要功能是使O₂自由基歧化生成H₂O₂，后者通过过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）催化生成水和O2。 SOD能阻止超氧化物与一氧化氮反应形成过氧化亚硝酸阴离子，后者能产生毒性更强的羟自由基而直接损害细胞。SOD与其他的抗氧化酶（过氧化物酶、CAT、GPx等）一起发挥作用，协同防止活性氧的损伤作用，相互间还有保护作用.如SOD保护CAT和GPx免受O₂自由基灭活，同时后两者又保护SOD不被H₂O₂灭活。因此，一旦系统中某一成员的功能削弱或数量减少，整个酶性保护系统就可能全线崩溃，导致不可逆性的细胞损伤。突变可致SOD1活性丧失，使超氧化的解毒作用减弱致自由基过量积聚细胞损伤。一些散发性的ALS可能也存在2lq22位点的突变。超氧化物歧化酶1（CuZn-SOD；SOD1）的五个外显子的突变是遗传性ALS（FALS）的更常见原因之一。研究表明20%的家族性ALS有SOD1（Cu/Zn过氧化物歧化酶）基因突变。

FUS（又称为脂肪肉瘤易位基因translocation in liposarcoma，TLS）基因位于人类16号染色体16p11.2上，序列高度保守，广泛表达于多种组织。FUS基因由526个氨基酸残基组成，属于FET/TET家族的多功能DNA/RNA结合蛋白。FUS蛋白在细胞核内和细胞质均有分布，但主要分布于核内，并不断穿梭于细胞核和细胞质之间。FUS蛋白病的特征就是异常的FUS蛋白滞留于细胞质内形成FUS免疫反应阳性的包涵体。14、15号外显子，该区域编码核定位信号，故推测突变通过改变核定位信号影响FUS蛋白向核内转运，从而产生致病性，这与病理上看到的大量异常FUS蛋白颗粒滞留胞浆现象是一致的。

TARDBP基因位于人类1号染色体1p36.2上，序列高度保守，广泛表达于多种组织。其6个外显子编码的TARDBP蛋白，由414个氨基酸残基组成，相对分子质量43kD，结构上含有2个RNA识别区和1个富含甘氨酸的羧基末端。该蛋白也编码有核定位信号（NLS），帮助TARDBP蛋白在细胞质中合成后转运至细胞核中。2006年，Arai等发现并证实了ALS患者神经细胞胞浆中聚集的泛素化蛋白颗粒其主要构成是异常的TARDBP蛋白，由此开启了“ALS属于TARDBP蛋白病”的新概念。2008年，Gitcho等首次在ALS患者中发现了TARDBP基因突变，他们对8个欧洲FALS家系进行测序，发现位于6号外显子的A315T突变，而在1505名健康人中未发现此突变。此后又有众多研究小组报道了37种不同突变：D169G、K263E、N267S、G287S、G290A、S292N、G294A、G294V、G295R、G295S、G298S、M311V、A321G、A321V、Q331K、S332N、G335D、M337V、Q343R、N345K、G348C、G348V、N352S、N352T、R361S、P363A、Y374X、N378D、S379C、S379P、A382P、A382T、I383V、G384R、N390D、N390S、S393L，并证明这些TARDBP基因突变确实与ALS发病有关。这38个突变大部分为错义突变（仅Y374X为无义突变），大部分位于TARDBP基因6号外显子蛋白编码区（仅D169G位于4号外显子），且集中在进化上高度保守的富含甘氨酸的羧基末端。目前所报道的TARDBP基因突变率在FALS为0.5~16%（平均约4%），在SALS平均不到1%。

C9orf72基因，全称chromosome 9 open reading frame 72。C9orf72的非编码六核苷酸重复序列（GGGGCC）扩增是导致肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的最为常见的遗传因素，引起神经元的损伤和死亡。ALS和FTD的主要特征分别为运动皮层和脊髓的运动神经元退行，额叶和前颞叶的皮质神经元退行。C9orf72重复序列扩增可以被转录为不同种类的RNA，并翻译产生二肽重复（DPR）蛋白；DPR蛋白在神经元中积累，引起功能获得性毒性（gain-of-function toxicity）。然而，重复序列扩增也会降低C9orf72的RNA和蛋白的水平，影响其正常功能的发挥，而且在ALS/FTD中，C9orf72的缺失会加剧自噬和溶酶体运输缺陷，并协同DPR蛋白的积累和毒性，影响细胞的清除功能，导致细胞死亡，进一步暗示了C9orf72的综合致病机制。

目前，ALS的诊断主要依赖于临床表现、体格检查及电生理检查，并排除其他诊断。对于不典型病例以及对于早期病例这些方法并不能确诊ALS，因此正在开发新的检测技术，如生物学标志物和影像学等技术以帮助早期诊断ALS就很有必要。家族性ALS的病因涉及到许多相关易感基因的突变，常用的基因突变检测技术如荧光原位杂交技术（FISH）、免疫组化检查（IHC）、高通量测序（NGS）等技术从其检测成本，操作复杂性和检测的准确性等因素来说，这些技术不适合用于 ALS这种具有大样本基因变异情况的筛查。

聚合酶链式反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)分析是一种DNA单链凝胶电泳技术，是在PCR技术的基础上发展起来的，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。这项技术具有简便、快速、敏感和经济等特点，适用于大样本基因变异情况的筛查。可用于检测单个碱基置换、数个碱基插入或缺失等基因变异。

发明内容

为克服现有技术之缺陷，本发明目的是提供一种家族遗传性渐冻症早筛引物组及试剂盒，通过选取4个最常见的家族遗传性ALS易感基因（C9orf72, SOD1, FUS, TARDBP），这4个基因的突变涉及80%以上的家族性ALS病例，设计了9对引物，基本涵盖了这4个基因的突变范围，并结合PCR-SSCP分析技术，能够快速地帮助家族遗传性ALS患者子女早期确认是否携带遗传突变，同时所述引物组及试剂盒也可用于散发性ALS的早期筛查，为患者的早期诊断、预后判断乃至治疗提供帮助。

本发明一方面提供了一种用于检测家族遗传渐冻症（FALS）的引物组，所述引物组包括检测SOD1基因第1、2、3、4、5号外显子突变的特异性引物对，检测FUS 基因第14、15号外显子突变的特异性引物对，检测TARDBP基因第6号外显子突变的特异性引物对，以及检测C9orf72基因非编码六核苷酸重复序列GGGGCC异常扩增的特异性引物对。

在一个实施方式中，所述引物组包括如下9个引物对：

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对；

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对；

SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物对；

SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物对；

SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的引物对；

SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的引物对；

SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的引物对；

和SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的引物对。

本发明的另一个方面还提供了所述的引物组在制备家族遗传性渐冻症早筛试剂盒中的应用。

本发明的另一个方面提供了一种用于家族遗传性渐冻症早期筛查的试剂盒，所述试剂盒包括如前所述的引物组、PCR反应试剂以及单链构象多态性SSCP分析试剂。

在一个实施方式中，所述PCR反应试剂包括2×PCR Mix酶试剂、ddH₂O，所述2×PCRMix酶试剂包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液，所述2×PCR Mix酶试剂为各组分浓度均为2×的预混液，使用时稀释为1×工作浓度。

在一个实施方式中，所述SSCP分析试剂包括银染试剂、显色液、SSCP上样缓冲液、8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶、固定液、终止液。

优选地，所述银染试剂包括0.1%的AgNO₃溶液；所述显色液包括1.5%的NaOH，0.01%的NaBH₄，0.15%的甲醛；所述 SSCP上样缓冲液包括95%的甲酰胺，20mmol的EDTA，0.05%的二甲苯和0.05%的溴酚蓝；所述固定液包括10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液；所述终止液包括0.75%的Na₂CO₃。

本发明还提供了所述的试剂盒在家族遗传性渐冻症早筛中的应用，所述应用包括如下步骤：从外周血中提取基因组DNA；用9对引物对检测基因进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行确认；PCR产物变性后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和染色；比较测试者和正常对照者的结果；根据异常泳动变位筛查突变样本。

优选地，所述PCR反应的反应体系包括：10μl 2×PCR Mix酶试剂、50ng 模板DNA、1μl正向引物、1μl反向引物、加至总体系20μl的ddH₂O。

优选地，所述PCR反应程序为：

预变性阶段：95℃ 5 min；

扩增阶段：94℃ 30 s、54-56℃ 30 s、72℃ 45 s，共35个循环；

延伸阶段：72℃ 10 min；

4℃保存。

本发明的有益效果在于：

1）本发明的试剂盒通过检测家族性渐冻症易感基因突变水平，可以帮助家族性渐冻症患者的子女们在早期诊断出患病的风险，从而提前进行治疗和干预。

2）家族性渐冻症的易感基因很多，突变范围很大，普通检测方法耗时耗力且覆盖范围有限，有漏检误诊的概率高。本发明的试剂盒涵盖了导致80%的家族遗传性ALS的四个易感基因 (C9orf72, SOD1, FUS, TARDBP)，从中设计出仅用9对引物并结合PCR-SSCP技术，能过很准确的检测出这几个基因的突变情况，本试剂盒的检测范围广，检测准确且工作量少的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为正常对照者SOD1基因的PCR产物经琼脂糖电泳检测结果。

图2为PCR-SSCP银染结果：图2中的A为 SOD1基因第4号外显子PCR-SSCP银染结果；图2中的B 为SOD1基因第5号外显子PCR-SSCP银染结果。

图3为基因测序结果与相应外显子正常对照：图3中的A为SOD1第4号外显子测序对比结果；图3中的B为SOD1第5号外显子测序对比结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：家族遗传性渐冻症早筛试剂盒

家族遗传性渐冻症早筛试剂盒包括引物组、PCR反应试剂、SSCP分析试剂。

一、引物组：

引物组包括检测SOD1基因第1、2、3、4、5号外显子突变的特异性引物对，检测FUS基因第14、15号外显子突变的特异性引物对，检测TARDBP基因第6号外显子突变的特异性引物对，以及检测C9orf72基因非编码六核苷酸重复序列GGGGCC异常扩增的特异性引物对。

其中检测SOD1基因第1、2、3、4、5号外显子的突变的特异性引物对，共5对引物分别称为引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。检测FUS 基因第14、15号外显子突变的特异性引物对，共两对引物分别称为Ⅵ、Ⅶ。检测TARDBP基因第6号外显子突变的特异性引物对，称为引物Ⅷ。检测C9orf72基因非编码六核苷酸重复序列（GGGGCC）异常扩增的特异性引物对，称为引物Ⅸ。前述引物信息见表1。

表1 PCR扩增引物对信息表

PCR反应体系试剂

PCR反应试剂包括2×PCR Mix酶 1ml/管共2管，ddH2O 1ml/管共2管。

其中2×PCR Mix酶的组分包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液等；

（说明：MIX酶中上述各组分浓度为2x浓度，使用时最终稀释为1x工作浓度即可）。

三银染PCR-SSCP分析所需试剂：

组分1. 银染试剂：0.1%的AgNO₃溶液。

组分2. 显色液：1.5%的NaOH，0.01%的NaBH₄，0.15%的甲醛。

组分3. SSCP上样缓冲液：95%的甲酰胺，20mmol的EDTA，0.05%的二甲苯和0.05%的溴酚蓝。

组分4. 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（30：1，含10%的甘油，APS、TEMED、1×TBE电泳缓冲液）

组分5. 固定液：10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液

组分6. 终止液：0.75%的Na₂CO₃。

实施例二：本试剂盒的使用方法，其操作步骤如下：

（1）样本基因组DNA 提取和浓度测定

用基因组提取试剂盒从外周血中提取人全基因组DNA,用分光光度计测定所提DNA样品在的波长为260nm和280nm的OD值。根据DNA纯度=A260/A280；DNA浓度(ng/μl)=A260×50 公式确定所提取的DNA样品的浓度和纯度后，进行后续步骤或者将DNA样品置于-20℃保存。

（2）PCR扩增待测基因

① PCR反应体系：

② PCR反应循环参数：

95℃ 5 min

94℃ 30 s、54-56℃ 30 s、72℃ 45 s，35个循环

72℃ 10 min

4℃ forever

注意：引物Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ的PCR反应循环参数中的退火温度设置为54℃，引物Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ的退火温度设置为56℃，其余条件都相同。

（3）PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

①配好置胶模具，小心插好梳子形成加样孔，水平放置。将10×TBE电泳缓冲液用纯净水按1:9稀释足够量备用。

②准确称量琼脂糖干粉0.3g，加入盛有20ml 1×TBE电泳缓冲液的锥形瓶中，放入微波炉内加热融化。

③待融化的凝胶稍稍冷却至不烫手后加入1μl溴化乙啶(终浓度为0.5μg/ml),轻轻摇动锥形瓶以充分混匀。

④将温热的琼脂糖凝胶倒入模具中，室温下放置20-30min,待凝胶完全凝结，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。

⑤向电泳槽内倒入1×TBE电泳缓冲液，使电泳液刚好没过凝胶约1mm。

⑥用微量移液器取PCR产物5μl，加入0.5ul 10×loading buffer 混匀后加入凝胶加样孔内，另取2000bp DNA Ladder Marker加入边侧孔内当作对比条带。

⑦盖上电泳槽，接好电极插头，接通电源，红色为正极，黑色为负极，PCR产物由负极往正极移动，电压160V，电泳约25min后关上电源，取出凝胶用Gel-Doc成像仪观察并照相保存。

（4）PCR-SSCP实验

1. PCR反应后通过琼脂糖电泳确认PCR产物。

2. 取10μl电泳确认过扩增产物，加10μl甲酰胺上样缓冲液混合，在98℃变性10分钟，并迅速冰浴。

3.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

①准备50 ml的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，添加25μl的TEMED和250μl的10％的过硫酸铵，混合并倒入胶水，然后插入装填梳子。胶完全聚合后，拉出加载梳，安装电泳装置，添加1XTBE电泳缓冲液，该缓冲液应高于样品孔的上边缘，并使用注射器吸收缓冲液冲洗样品孔。

②取10μl变性处理的PCR扩增产物，加到点样孔中，以1～8 V/cm电泳4～5 h。。

③拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，将其放入塑料皿中，并用蒸馏水冲洗1至2次。

④倒入固定液，固定8-10分钟。

⑤用蒸馏水冲洗1至2次；倒入银染液和银染10至12分钟。

⑥用蒸馏水冲洗几次；倒入显色溶液并显色，直到出现清晰的银染为止。

⑦用终止液终止显色，将聚丙烯酰胺凝胶浸入蒸馏水中，观察PCR-SSCP结果。

PCR-SSCP结果分析:观察变性后的二条单链电泳迁移率，比较测试者和正常对照者有无不同。根据异常泳动变位筛查突变样本，后续将筛查到的突变样本送测序进一步确认具体的基因突变位点，为临床医学预防和治疗提供依据。

实施例三：本试剂盒在家族遗传性渐冻症早筛检测中的实际应用

实验样本获取：三个测试样本分别为样本① FALS确诊者（男 51岁，三年前确诊为FALS）；样本②待测试者（男23岁、FALS确诊者之子）；样本③正常人对照者（男29岁）。

样本基因组DNA 提取和浓度测定：

①用EDTA抗凝采血管分别抽取测试者1ml全外周血，加入等体积（1ml）3%的明胶，盖紧后颠倒混匀，37℃水浴静置5分钟。

②取上清液至另一干净离心管，4000转离心5分钟，弃上清液，留沉淀。

③在留有沉淀的离心管中加TES 2ml，溶解沉淀后加10% SDS 200μl，抽吸混匀，破膜。以后的操作要小心轻柔，以免机械剪切力破坏核酸的完整性（核酸已释出）。

④加入2 ml pH 7.8的饱和酚颠倒充分混匀。4000转离心10分钟。

⑤取上层水相至另一离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，4000转离心5分钟。

⑥将上层水相移至一小玻璃试管中，小心沿试管壁加入2.5倍体积的无水乙醇，此时会看见DNA絮状沉淀析出。

⑦ 将含DNA沉淀的离心管10000转离心5分钟，弃液体留下沉淀，加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀3次（去除共沉淀的盐），离心后将乙醇去除干净，通风厨静置5-10分钟，加入100μlddH₂O,轻轻震荡，使之溶解。

⑧用Nanodrop 2000紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度。

PCR扩增待测基因：

① PCR反应体系：

② PCR反应循环参数：

95℃ 5 min

94℃ 30 s、54-56℃ 30 s、72℃ 45 s，35个循环

72℃ 10 min

4℃ forever

注意：引物Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ的PCR反应循环参数中的退火温度设置为54℃，引物Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ的度设置为56℃，其余条件都相同。

（4）PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳确认：

②准确称量琼脂糖干粉0.3g，加入盛有20ml1×TBE电泳缓冲液的锥形瓶中，放入微波炉内加热融化。

⑥用微量移液器取PCR产物5μl，，加入0.5ul 10×loading buffer 混匀后加入凝胶加样孔内，另取2000bp DNA Ladder Marker加入边侧孔内当作对比条带。

琼脂糖凝胶电泳结果分析：对PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，来确认了本试剂盒所用的9对引物的扩增特异性，结果显示在正常对照者的基因组DNA中，9个引物对的特异性都得到了确认，都扩增出单一且长度一致的条带，如附图1所示：M(Marker)为D2000，自下而上分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp，泳道1-5分别为SOD1基因第1、2、3、4、5号编码外显子，片段长度分别为156bp、207bp、231bp、285bp、558bp，与在NCBI网站上设计引物时计算得到的扩增的片段长度完全符合。

（5）单链构象多态性（SSCP）检测

①取10μl电泳确认过扩增产物，加10μl甲酰胺上样缓冲液混合，在98℃变性10分钟，并迅速冰浴。

②准备50 ml的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，添加25μl的TEMED和250μl的10％的过硫酸铵，混合并倒入胶水，然后插入装填梳子。

③胶完全聚合后，拉出加载梳，安装电泳装置，添加1XTBE电泳缓冲液，该缓冲液应高于样品孔的上边缘，并使用注射器吸收缓冲液冲洗样品孔。

④取10μl变性处理的PCR扩增产物，加到点样孔中，以1～8 V/cm电泳5 h。

⑤拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，将其放入塑料皿中，并用蒸馏水冲洗2次。

⑥往塑料皿倒入固定液10ml，使固定液浸没聚丙烯酰胺凝胶，固定8分钟。

⑦用蒸馏水冲洗2次；倒入银染液和银染10分钟。

⑧用蒸馏水冲洗3次；倒入显色溶液并显色，直到出现清晰的银染为止。

⑨用终止液终止显色，将聚丙烯酰胺凝胶浸入蒸馏水中，观察PCR-SSCP结果。

（6）PCR-SSCP检测结果分析：根据PCR-SSCP 银染结果分析，与正常对照者相比发现样本② 待测试者（FALS确诊者之子）的SOD1基因4号外显子上发生了突变，而样本①（FALS确诊者）第4号外显子基因正常，如图2中的A所示，1 泳道：样本①（FALS确诊者），2泳道：样本②（待测试者），3泳道：正常人（对照者）；与对照者相比显示样本①（FALS确诊者）的SOD1基因第5号外显子上发生突变，样本② 待测试者（FALS确诊者之子）的第5号外显子基因正常，如图2中的B所示，1 泳道：样本①（FALS确诊者），2泳道：样本②（待测试者），3泳道：正常人（对照者）。另外样本①（FALS确诊者）以及样本② 待测试者（FALS确诊者之子）在SOD1基因的1、2、3号外显子，FUS基因的14和15号外显子，TARDBP基因第6号外显子、C9orf72基因非编码六核苷酸重复序列（GGGGCC）的PCR-SSCP检测结果均正常。

（7）将本次实验筛查到的突变样本（检测出的样本② 待测试者（FALS确诊者之子）的SOD1基因4号外显子突变样品和样本①（FALS确诊者）的SOD1基因第5号外显子突变样品）送至第三方测序机构进行测序，并将测序结果与人类 SOD1 基因组 DNA 序列(NCBISequence Viewer NC_000021.8)和 mRNA 序列(NCBI Sequence Viewer NM_000454.4)进行比对。对比发现对样本② 待测试者（FALS确诊者之子）SOD1基因第4号外显子测序比对结果显示c.332G﹥A导致杂合错义突变Cys111Tyr，如图3中的A所示，上面为正常对照测序结果，下面为样本②（待测试者）与对照者对比结果，说明样本② 待测试者（FALS确诊者之子）有FALS携带。而样本①（FALS确诊者）SOD1基因第5号外显子测序对比结果显示为c.440G﹥A导致杂合错义突变Gly147Asp，如图3中的B所示，上面为正常对照测序结果，下面为样本①（FALS确诊者）与对照者对比结果，刚好符合该患者的情况（确诊3年的FALS患者）。该结果充分证明了本发明的试剂盒检测的精准性。

虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员还应理解，可以对实施例进行多种修改而不脱离本发明的范围和精神。本发明的范围由所附权利要求来限定。

Claims

1.一种用于检测家族遗传渐冻症的引物组，其特征在于，所述引物组包括检测SOD1基因第1、2、3、4、5号外显子突变的特异性引物对，检测FUS 基因第14、15号外显子突变的特异性引物对，检测TARDBP基因第6号外显子突变的特异性引物对，以及检测C9orf72基因非编码六核苷酸重复序列GGGGCC异常扩增的特异性引物对。

2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下9个引物对：

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对；

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对；

SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物对；

SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物对；

SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的引物对；

SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的引物对；

SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的引物对；

和SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的引物对。

3.权利要求1-2任一项所述的引物组在制备家族遗传性渐冻症早筛试剂盒中的应用。

4.一种用于家族遗传性渐冻症早期筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-2任一项所述的引物组、PCR反应试剂以及单链构象多态性SSCP分析试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括2×PCR Mix酶试剂、ddH₂O，所述2×PCR Mix酶试剂包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、PCR反应缓冲液，所述2×PCR Mix酶试剂为各组分浓度均为2×的预混液，使用时稀释为1×工作浓度。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述SSCP分析试剂包括银染试剂、显色液、SSCP上样缓冲液、8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶、固定液、终止液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述银染试剂包括0.1%的AgNO₃溶液；所述显色液包括1.5%的NaOH，0.01%的NaBH₄，0.15%的甲醛；所述 SSCP上样缓冲液包括95%的甲酰胺，20mmol的EDTA，0.05%的二甲苯和0.05%的溴酚蓝；所述固定液包括10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液；所述终止液包括0.75%的Na₂CO₃。

8.权利要求4-7任一项所述的试剂盒在家族遗传性渐冻症早筛中的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：从外周血中提取基因组DNA；用9对引物对检测基因进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行确认；PCR产物变性后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和染色；比较测试者和正常对照者的结果；根据异常泳动变位筛查突变样本。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述PCR反应的反应体系包括：10μl 2×PCR Mix酶试剂、50ng 模板DNA、1μl正向引物、1μl反向引物、加至总体系20μl的ddH₂O。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述PCR反应程序为：

预变性阶段：95℃ 5 min；

扩增阶段：94℃ 30 s、54-56℃ 30 s、72℃ 45 s，共35个循环；

延伸阶段：72℃ 10 min；

4℃保存。