CN116837108A - 眼镜蛇的特异性pcr鉴别方法及鉴别引物 - Google Patents

眼镜蛇的特异性pcr鉴别方法及鉴别引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能够快速鉴别眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物，具体包括模板DNA提取、PCR扩增反应、琼脂糖电泳检测、结果判定四个步骤；所述特异性鉴别引物为鉴别引物1、鉴别引物2，其序列为：鉴别引物1，上游引物：5´AAGAAGTTTGACTACCAGGGAGAG´，下游引物：5´GTGCCGAGGGGGTTATTA3´；鉴别引物2，上游引物：5´TGAAACTATGAATACTCAGATGGAATT3´，下游引物：5´GCCGTAAAAAACCCCTACC3´。本发明提供的鉴别方法操作简单、高效准确，对鉴别人员实验操作要求低，客观性强，鉴别引物对眼镜蛇特异性强，采用本发明方法能够快速、准确的鉴别眼镜蛇与其他常见蛇类，结果准确、成本低，可有效的对眼镜蛇进行真伪鉴定，从而保证眼镜蛇药材的用药安全。

Description

眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物
技术领域
本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种能够快速鉴别眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物。
背景技术
眼镜蛇（学名：Naja）为眼镜蛇属动物的通称，别名：饭匙倩、蝙蝠蛇、胀颈蛇、扇头风等，是眼镜蛇科眼镜蛇属的一种蛇，其成员大多被统称为眼镜蛇。眼镜蛇属约有20多个已确认物种，但分类学上经常就物种的独立性问题而存有争论，因此某些资料也可能有所出入。此属的成员主要分布于中东、东南亚、非洲、印度尼西亚等地。在我国，眼镜蛇主要分布在南方云南、贵州、安徽、浙江、江西、湖南、福建、台湾、广东、广西、海南等地，北方亦偶尔可见，尤其以湖南永州的量多。我国常见的眼镜蛇有3种，分别为中华眼镜蛇（Najaatra），又名舟山眼镜蛇，孟加拉眼镜蛇（拉丁学名：Najakaouthia），又名单眼镜蛇，以及印度眼镜蛇（拉丁学名：Najanaja），亦是眼镜蛇属中的重要代表种，主要分布于印度次大陆，因此得名。
眼镜蛇的药材基源为眼镜蛇科眼镜蛇属动物眼镜蛇除去内脏的全体，有通经络，袪风湿的作用，主风湿痹痛，中风瘫痪，小儿麻痹症。眼镜蛇全身都是宝，经济价值很高，近年来，眼镜蛇在市场上一直是供不应求。该蛇肉味道鲜美，极富营养，内脏、骨骼、血液、胆汁及附生物均可入药，尤其是眼镜蛇毒，现已制成镇痛药，其止痛效果良好，且无成瘾性，可取代吗啡等成瘾药。另外，眼镜蛇毒制剂对治疗运动神经元疾病，如进行性脊髓性肌萎缩症、原发性侧索硬化症等，有很好的疗效。眼镜蛇毒对某些神经系统疾病如帕金森氏综合征亦有一定效果。眼镜蛇干燥的蛇体中含有具降压作用的肌苷（inosine）和甲状旁腺提取物。
眼镜蛇作为动物药材功效确切，药用价值和经济价值高，对于眼镜蛇的鉴别，目前主要采用性状鉴别的方式，但商品来源复杂、药材形态鉴别较难，依其外部形态的特征进行性状鉴别，具有一定的主观性，而且如果外形不完整、有损伤就很难鉴别，同时也要求鉴别者具备相当丰富的鉴别经验。且由于多种蛇类形态近似，药材鉴别困难，特别是加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认。经济利益的驱使，市场充假现象较为严重，仅根据形态特征来进行鉴别较难对眼镜蛇正伪品做出准确的判断，难以满足市场的需求。因此，为保证眼镜蛇质量和用药安全，需要一种简单可靠，能够准确快速、稳定鉴别眼镜蛇正品的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足而提供的一种眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物，该鉴别方法操作简单、稳定，鉴别引物对眼镜蛇有高度特异性，采用该方法能够快速、准确的鉴别眼镜蛇与其他常见蛇类，有效的对眼镜蛇进行真伪鉴定，从而保证眼镜蛇药材的临床疗效和用药安全，有利于眼镜蛇市场的健康发展。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种眼镜蛇的特异性PCR鉴别引物，所述引物为鉴别引物1、鉴别引物2，其序列为：鉴别引物1，上游引物：5´AAGAAGTTTGACTACCAGGGAGAG´（SEQ ID NO:1），下游引物：5´GTGCCGAGGGGGTTATTA3´（SEQ ID NO:2）；鉴别引物2，上游引物：5´TGAAACTATGAATACTCAGATGGAATT3´（SEQ ID NO:3），下游引物：5´GCCGTAAAAAACCCCTACC3´（SEQID NO:4）。
一种眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法，包括以下步骤：
（1）模板DNA提取：取供试品样品，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA，另取眼镜蛇对照药材，同法制成对照药材模板DNA溶液；
（2）PCR反应：
采用所述的鉴别引物1：5´AAGAAGTTTGACTACCAGGGAGAG´（SEQ ID NO:1）和5´GTGCCGAGGGGGTTATTA3´（SEQ ID NO:2）；PCR反应体系：反应总体积为20μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌水8μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性10分钟；循环反应35次（95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒）；72℃延伸10分钟；
采用所述的鉴别引物2：5´TGAAACTATGAATACTCAGATGGAATT3´（SEQ ID NO:3）和5´GCCGTAAAAAACCCCTACC3´（SEQ ID NO:4）；PCR反应体系：反应总体积为20μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌水8μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性10分钟；循环反应35次（95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒）；72℃延伸10分钟；
（3）琼脂糖电泳检测：
照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），配置2%琼脂糖电泳，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed,取供试品与对照产物药材PCR反应液的上样量分别为2～5μl，DNA分子量标记上样量为2.5μl（0.5μg/μl），电泳结束后，在凝胶成像仪上进行检视；
（4）结果判定：供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，引物1在300bp处应有单一的DNA条带，空白对照无条带，引物2在200～300bp间不能检出条带。
进一步的，上述的眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法，步骤（1）中，模板DNA提取的方法具体包括如下步骤：
①取供试品粉末约30mg置1.5 mL离心管中，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮，加入20μl 蛋白酶K溶液，在56℃放置直至组织溶解（约3h）；简短离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μl缓冲液GB，充分颠倒均匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
②加入200μl无水乙醇，充分振荡均匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中），离心30 sec（转速为每分钟12000转），倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，离心30sec（转速为每分钟12000转），倒掉废液；将吸附柱CB3放入收集管中，向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，离心30sec（转速为每分钟12000转），倒掉废液将吸附柱CB3放入收集管中；重复上一步操作；将吸附柱CB3放回收集管中，离心2 min（转速为每分钟12000转），倒掉废液；
③将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，离心2min（转速为每分钟12000转），将溶液收集到离心管，混匀，作为供试品溶液，置-20℃保存备用；
④另取眼镜蛇对照药材30mg，同法制成对照药材模板DNA溶液。（或按各血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒方法提取）
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物，为眼镜蛇的鉴别提供了一种新的高效、准确的鉴别方法，该鉴别方法操作简单、稳定可靠，鉴别引物对眼镜蛇的特异性高、灵敏度好，而且采用本发明方法无需依赖检验人员的经验，对鉴别人员实验操作要求低，客观性强，能够满足市场的需求。采用本发明方法及两对鉴别引物交叉检测，能够快速、准确的鉴别眼镜蛇与其他常见蛇类，结果准确、成本低，可有效的对眼镜蛇进行真伪鉴定，从而保证眼镜蛇药材的临床疗效和用药安全，有利于眼镜蛇市场的健康发展。
附图说明
图1 眼镜蛇退火温度考察结果图，图中，1、500 DNA Marker，2、54℃，3、56℃，4、58℃，5、60℃，6、62℃，7、64℃，8、66℃，9、空白对照；
图2 眼镜蛇专属性考察结果图，图中，1、1000 DNA Marker，2、S1，3、S2，4、S3，5、S4，6、S5，7、S6，8、S7，9、S8，10、S9，11、S10，12、S11，13、S12，14、S13，15、S14，16、S15，17、S16，18、S17，19、S18，20、S19，21、S20，22、S21，23、空白对照；
图3 眼镜蛇引物酶种类考察结果图，图中，1、1000 DNA Marker，HS 酶(2、S13-M1，3、S13-Y1，4、S13-Z1 5、空白对照)， MAX酶(6、S13-M1，7、S13-Y1，8、S13-Z1，9、空白对照)，F8 酶(10、S13-M1，11、S13-Y1，12、S13-Z1，13、空白对照)；
图4 眼镜蛇仪器品牌考察结果图，图中，伯乐S1000 (1、S13-M1，2、S13-Y1，3、S13-Z1，4、空白对照) ，5、1000DNA Marker，德国耶拿TA96SG(6、S13-M1，7、S13-Y1，8、S13-Z1，9、空白对照)；
图5 眼镜蛇灵敏度考察结果图，图中，1、空白对照，2、0.5ng，3、1ng，4、2ng，5、3ng，6、5ng，7、10ng，8、50ng，9、1000DNA Marker；
图6 眼镜蛇循环数考察结果图，图中，1、空白对照，2、35S，3、34S，4、33S，5、32S，6、31S，7、30S，8、1000 DNA Marker；
图7 眼镜蛇适应性考察结果图，图中，1、1000 DNA Marker， 2～29：眼镜蛇，30、空白对照；
图8 眼镜蛇退火温度考察结果图，图中，1、1000 DNA Marker，2、52℃，3、54℃，4、56℃，5、58℃，6、60℃，7、62℃，8、64℃，9、66℃，10、空白对照；
图9 赤练蛇引物专属性考察结果图，图中，1：1000 DNA Marker，2：空白对照，3～29：眼镜蛇，30：赤链蛇；
图10 赤练蛇引物酶种类考察结果图，图中，1：1000 DNA Marker，TKS 酶(2、空白对照，3、S19-1，4、S13-M1，5、S13-Y1，6、S13-Z1)， HS酶(7、空白对照，8、S19-1，9、S13-M1，10、S13-Y1，11、S13-Z1)，MAX酶(12、空白对照，13、S19-1 ，14、S13-M1 ，15、S13-Y1，16、S13-Z1)，F8 酶(17、空白对照，18、S19-1 ，19、S13-M1，20、S13-Y1，21、S13-Z1)；
图11 赤练蛇仪器品牌考察结果图，图中，伯乐S1000(1、空白对照，2、S19-1，3、S19-2 )，德国耶拿TA96SG(4、空白对照，5、S19-1，6、S19-2 )，7、1000DNA Marker；
图12 赤练蛇蛇灵敏度考察结果图，图中，1、1000DNA Marker，2、0.5ng，3、1ng 4、2ng ，5、3ng，6、5ng，7、10ng ，8、50ng，9、空白对照；
图13 赤练蛇循环数考察结果图，图中，1、1000 DNA Marker，2、30S，3、31S，4、32S，5、33S，6、34S，7、35S，8、空白对照。
具体实施方式
实施例1
1材料
1.1 样本收集自全国各地和广西区内，主要来自企业养殖基地。样品由广西食品药品检验所黄清泉主管药师鉴定，凭证标本保存于广西食品药品检验所标本室，见表1。
1.2仪器 梯度PCR扩增仪（伯乐Bio-rad S1000）；梯度PCR扩增仪（TA96SG,德国耶拿）；电泳仪（BIO-RAD）；微量紫外分光光度计(Nano Value PLUS)；GelDoc XR+全自动凝胶成像系统(BIO-RAD )；ME203电子天平(Mettle)； MIKRO220R型高速冷冻离心机（Hettich）；漩涡震荡仪( Scientificin-dustries )。
1.3 试剂琼脂糖（BIOWEST）；GelRed（BIOTIUM）； PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TAKARA）、2X F8 LongFast PCR MasterMix（艾德莱）、PrimeSTARHS DNA Polymerase（TAKARA）、PrimeSTARTKS DNA Polymerase（TAKARA），DNA Marker1000（TaKaRa）；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（天根）；引物由华大基因合成，其他试剂均为国产分析纯。
2 试验方法
2.1 模板DNA提取取供试品新鲜肌肉，取供试品约100mg。采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA，对所得DNA用微量紫外分光光度计(Nano ValuePLUS)测定浓度和纯度。
2.2差异序列获得从NCBI上并各种蛇类的线粒体基因组信息，把序列并导入到Mega中进行比对，查找有差异的片段区域，设计特异性引物进行扩增和琼脂糖电泳检测。
2.3特异性引物设计对于上述差异区域，设计引物，最终删选出2对引物，见表2，分别可以扩出眼镜蛇和赤链蛇。
3、眼镜蛇引物方法学验证
PCR体系为20μL，DNA聚合酶预混液10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1μl，无菌水补足20μL。PCR反应程序为95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，X℃退火30秒，72℃延伸30秒，此阶段运行35个循环；72℃延伸10分钟。
3.1 退火温度考察使用2X F8 LongFast PCR MasterMix（艾德莱），按上述反应体系，退火温度分别考察了54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃，经试验，退火温度除了在64℃、66℃时没有明显条带，其余温度均能扩增出条带，见图1。
3.2 专属性考察
取21种蛇DNA提取液，用设计的引物进行扩增，扩增用的酶为2X F8 LongFast PCRMasterMix（艾德莱）Taq酶预混液，PCR体系为25μL，预混液12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.75 μL，模板DNA1μl，无菌水补足25 μL。PCR反应程序为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，运行35个循环；72℃延伸5分钟。经反复优化实验，退火在56℃时除了赤练蛇，其他种类蛇没干扰，而选择退火温度56℃，结果如检出条带，则可能为眼镜蛇或赤练蛇，见图2，另设计赤练蛇的特异性引物鉴别两者。
3.3 酶的种类考察
除了方法开发用的2X F8 LongFast PCR MasterMix（艾德莱）酶外，我们还尝试PrimeSTARHS(MIX)（TAKARA）Taq、PrimeSTARMAX(MIX)（TAKARA）、等不同的酶，均能扩增出条带。见图3。
3.4 仪器品牌考察因实验室条件限制，只考察了2个品牌的PCR仪，分别为梯度PCR扩增仪（伯乐S1000）和德国耶拿PCR扩增仪（TA96SG），结果均能得到很好的扩增效果，说明该方法对仪器没有特殊要求。见图4。
3.5 灵敏度考察 DNA样本加入量我们考察了0.5ng、1ng、2ng、3ng、5ng、10ng、50ng，实验结果在DNA样本加入量为3ng时就有清晰可见的条带，可见该引物灵敏度较好。见图5。
3.6 反应循环数考察针对摸索好的实验条件，对反应循环数进行考察，结果显示上样量2μl眼镜蛇在30个循环条带已有拖尾现象，表明该引物扩增效率高，30个循环反应已达检测要求。见图6。
3.7 适用性考察针对摸索好的实验条件，对所有采集到的眼镜蛇28个样本进行验证，结果显示所有样本均能扩增出条带，表明该引物适应性好。见图7。
3.8因眼镜蛇引物能扩增出眼镜蛇和赤练蛇，故特设计出赤练蛇的特异性引物，该引物只能扩增出赤练蛇，不能扩增出眼镜蛇，从而达到鉴别目的。
3.8.1 退火温度考察使用2X F8 LongFast PCR MasterMix（艾德莱），按上述反应体系，退火温度分别考察了52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃，经试验，退火温度除了在64℃、66℃时没有明显条带，其余温度均能扩增出条带，见图8。
3.8.2 专属性考察
经反复优化实验，退火在58℃时除了赤练蛇，眼镜蛇不能扩增出条带，取眼镜蛇DNA提取液，用设计的赤练蛇引物进行扩增验证，结果见图9，所有眼镜蛇均不能扩增出条带，结果显示赤练蛇引物的特异性强，能鉴别两者。
3.8.3 酶的种类考察
除了方法开发用的2X F8 LongFast PCR MasterMix（艾德莱）酶外，我们还尝试PrimeSTARHS(MIX)（TAKARA）Taq、PrimeSTARMAX(MIX)（TAKARA）、PrimeSTAR TKS等不同的酶，在摸索出的反应条件下，赤练蛇均能扩增出条带，而三种眼镜蛇均未能扩增出条带，说明该引物对酶没有特殊要求。见图10。
3.8.4 仪器品牌考察因实验室条件限制，只考察了2个品牌的PCR仪，分别为梯度PCR扩增仪（伯乐S1000）和德国耶拿PCR扩增仪（TA96SG），结果均能得到很好的扩增效果，说明该方法对仪器没有特殊要求。见图11。
3.8.5 灵敏度考察 DNA样本加入量我们考察了0.5ng、1ng、2ng、3ng、5ng、10ng、50ng，实验结果电泳图PCR反应液上样量在2μl，在DNA样本加入量为2ng时就有隐约可见的条带，加入量为5ng时就有明显的条带，可见该引物灵敏度较好。见图12。
3.8.6 反应循环数考察针对摸索好的实验条件，对反应循环数进行考察，结果显示上样量2μl眼镜蛇在30个循环条带已有明显条带，表明该引物扩增效率高，30个循环反应已达检测要求。见图13。
4 结论经方法学试验，眼镜蛇引物和赤练蛇引物特异性较好，使用两对引物交叉实验，能够鉴别眼镜蛇与其他常见蛇类，供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，引物1在300bp处应有单一的DNA条带，空白对照无条带，引物2在200～300bp处不能检出条带，可以作为眼镜蛇的检验方法。
实施例2
一种眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法，包括以下步骤：
（1）模板DNA提取：取供试品样品，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA，另取眼镜蛇对照药材，同法制成对照药材模板DNA溶液；
（2）PCR反应：
采用鉴别引物1：5´AAGAAGTTTGACTACCAGGGAGAG´（SEQ ID NO:1）和5´GTGCCGAGGGGGTTATTA3´（SEQ ID NO:2）；PCR反应体系：反应总体积为20μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌水8μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性10分钟；循环反应35次（95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒）；72℃延伸10分钟；
采用鉴别引物2：5´TGAAACTATGAATACTCAGATGGAATT3´（SEQ ID NO:3）和5´GCCGTAAAAAACCCCTACC3´（SEQ ID NO:4）；PCR反应体系：反应总体积为20μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌水8μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性10分钟；循环反应35次（95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒）；72℃延伸10分钟；
（3）琼脂糖电泳检测：
照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），配置2%琼脂糖电泳，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed,取供试品与对照产物药材PCR反应液的上样量分别为2～5μl，DNA分子量标记上样量为2.5μl（0.5μg/μl），电泳结束后，在凝胶成像仪上进行检视；
（4）结果判定：供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，引物1在300bp处应有单一的DNA条带，空白对照无条带，引物2在200～300bp间不能检出条带。
实施例3
一种眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法，包括以下步骤：
（1）模板DNA提取：
①取供试品粉末30mg置1.5 mL离心管中，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮，加入20μl 蛋白酶K溶液，在56℃放置直至组织溶解（约3h）；简短离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μl缓冲液GB，充分颠倒均匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
②加入200μl无水乙醇，充分振荡均匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中），离心30 sec（转速为每分钟12000转），倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，离心30sec（转速为每分钟12000转），倒掉废液；将吸附柱CB3放入收集管中，向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，离心30sec（转速为每分钟12000转），倒掉废液将吸附柱CB3放入收集管中；重复上一步操作；将吸附柱CB3放回收集管中，离心2 min（转速为每分钟12000转），倒掉废液；
③将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，离心2min（转速为每分钟12000转），将溶液收集到离心管，混匀，作为供试品溶液，置-20℃保存备用；
④另取眼镜蛇对照药材30mg，同法制成对照药材模板DNA溶液（或按各血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒方法提取）；
（2）PCR反应：
采用鉴别引物1：5´AAGAAGTTTGACTACCAGGGAGAG´（SEQ ID NO:1）和5´GTGCCGAGGGGGTTATTA3´（SEQ ID NO:2）；PCR反应体系：反应总体积为20μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌水8μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性10分钟；循环反应35次（95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒）；72℃延伸10分钟；
采用鉴别引物2：5´TGAAACTATGAATACTCAGATGGAATT3´（SEQ ID NO:3）和5´GCCGTAAAAAACCCCTACC3´（SEQ ID NO:4）；PCR反应体系：反应总体积为20μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌水8μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性10分钟；循环反应35次（95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒）；72℃延伸10分钟；
（3）琼脂糖电泳检测：
照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），配置2%琼脂糖电泳，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed,取供试品与对照产物药材PCR反应液的上样量分别为2～5μl，DNA分子量标记上样量为2.5μl（0.5μg/μl），电泳结束后，在凝胶成像仪上进行检视；
（4）结果判定：供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，引物1在300bp处应有单一的DNA条带，空白对照无条带，引物2在200～300bp间不能检出条带。

Claims (3)

1.一种眼镜蛇的特异性PCR鉴别引物，其特征在于， 所述引物为鉴别引物1、鉴别引物2，其序列为：鉴别引物1，上游引物：5´AAGAAGTTTGACTACCAGGGAGAG´，下游引物：5´GTGCCGAGGGGGTTATTA3´；鉴别引物2，上游引物：5´TGAAACTATGAATACTCAGATGGAATT3´，下游引物：5´GCCGTAAAAAACCCCTACC3´。
2.一种眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）模板DNA提取：取供试品样品，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA，另取眼镜蛇对照药材，同法制成对照药材模板DNA溶液；
（2）PCR反应：
采用权利要求1中所述的鉴别引物1：5´AAGAAGTTTGACTACCAGGGAGAG´和
5´GTGCCGAGGGGGTTATTA3´；PCR反应体系：反应总体积为20μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物，10μmol/L，各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌水8μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性10分钟；循环反应35次，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒；72℃延伸10分钟；
采用权利要求1中所述的鉴别引物2：5´TGAAACTATGAATACTCAGATGGAATT3´和5´GCCGTAAAAAACCCCTACC3´；PCR反应体系：反应总体积为20μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物，10μmol/L，各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌水8μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性10分钟；循环反应35次，95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；72℃延伸10分钟；
（3）琼脂糖电泳检测：
照琼脂糖凝胶电泳法，配置2%琼脂糖电泳，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed,取供试品与对照产物药材PCR反应液的上样量分别为2～5μl，DNA分子量标记上样量为2.5μl，0.5μg/μl，电泳结束后，在凝胶成像仪上进行检视；
（4）结果判定：供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，引物1在300bp处应有单一的DNA条带，空白对照无条带，引物2在200～300bp间不能检出条带。
3.根据权利要求2所述的眼镜蛇的特异性PCR鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中模板DNA提取的方法，具体包括如下步骤：
①取供试品粉末30mg置1.5 mL离心管中，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮，加入20μl 蛋白酶K溶液，在56℃放置直至组织溶解；简短离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μl缓冲液GB，充分颠倒均匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
②加入200μl无水乙醇，充分振荡均匀15 sec，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，离心30 sec，转速为每分钟12000转，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，离心30 sec，倒掉废液；将吸附柱CB3放入收集管中，向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，离心30 sec，转速为每分钟12000转，倒掉废液将吸附柱CB3放入收集管中；重复上一步操作；将吸附柱CB3放回收集管中，离心2 min，倒掉废液；
③将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，离心2min，转速为每分钟12000转，将溶液收集到离心管，混匀，作为供试品溶液，置-20℃保存备用；
④另取眼镜蛇对照药材30mg，同法制成对照药材模板DNA溶液。
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