ES2226434T3 - Metodo para obtener muestras de dna de la piel humana con una lamina adhesiva. - Google Patents
Metodo para obtener muestras de dna de la piel humana con una lamina adhesiva.Info
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Abstract
Un método para la obtención de DNA humano para análisis genético, que consiste en la etapa de extraer DNA de una región de epidermis con una lámina adhesiva, en el que la epidermis se toma de una persona a estudiar mediante una lámina adhesiva.
Description
Método para obtener muestras de DNA de la piel
humana con una lámina adhesiva.
La presente invención se refiere en general a un
método para obtener muestras de DNA empleando una lámina adhesiva y,
más en particular, a un método para obtener muestras de DNA a partir
de pedazos de la epidermis humana que se arrancan mediante una
lámina adhesiva. La presente invención se refiere además a láminas
combinadas para almacenar DNA y a un kit para la obtención de DNA a
partir de pedazos de la epidermis.
El material genético DNA (ácido
desoxirribonucleico) constituye el material genético que codifica la
síntesis de los componentes celulares y el metabolismo de todos los
seres vivos. El gran progreso de la biología en la segunda mitad del
siglo XX, incluido el "proyecto genoma", apunta a la
generalización de los análisis genéticos.
Como consecuencia del "proyecto genoma", los
seres humanos son capaces de leer toda la información genética del
DNA humano y se han descubierto uno tras otro los genes que provocan
o participan en las enfermedades hereditarias. Además, las anomalías
genéticas se enfocan ahora desde un nivel de secuencia de
nucleótidos. Por consiguiente, el conocimiento de los tipos de genes
que provocan las enfermedades permitirá a los pacientes potenciales
adoptar las precauciones apropiadas y además permitirá a los
facultativos recetar la prescripción y tratamiento adecuados.
Dado que el DNA es omnipresente en cada célula y
el tipo de DNA es diferenciable entre los individuos, se han
desarrollado métodos de identificación genética (o perfilado de DNA)
que permiten distinguir los individuos entre sí a nivel genético.
Gracias a su precisión, la técnica de identificación genética se
considera como la mejora herramienta en ámbitos tales como los
análisis forenses y las pruebas de paternidad. De hecho, en G.B. y
en los EE.UU., se han establecido ya bancos de datos de perfiles de
DNA para presos y se utilizan ya para examinar a los sospechosos
mediante ordenadores que comparan los perfiles de DNA obtenidos de
muestras tomadas en los mismos escenarios de los crímenes.
Tanto si se utiliza para el diagnóstico de una
enfermedad como para la identificación genética, el DNA se obtiene
normalmente de la sangre. Sin embargo, la extracción de sangre para
obtener un perfil de DNA es problemática por los motivos
siguientes:
primero, la extracción de sangre debería
realizarse por personas especializadas, por ejemplo médicos o
enfermeras;
segundo, las personas objeto de estudio sufren la
incomodidad que conlleva una extracción de sangre;
tercero, siempre existe la posibilidad de que los
donantes de sangre resulten infectados con enfermedades, por ejemplo
la hepatitis o el SIDA;
cuarto, puede ser inviable la extracción de
sangre en algunos casos por razón de edad, salud, religión, etc.
quinto, la extracción de sangre puede conllevar
problemas molestos; en este sentido, la identificación directa de
las personas a estudiar es imposible basándose en las muestras de
sangre tomadas de dichas personas, hay que tomar además las
fotografías y las huellas dactilares para asegurar que existe una
conexión fiable entre el donante de sangre y la persona a estudiar,
y los recolectores, transportadores y analizadores relevantes
constituyen la cadena de documentos a custodiar. Por ejemplo, el FBI
de los EE.UU. ha establecido una directiva de modo que todos y cada
uno de los funcionarios que intervienen en la cadena de custodia
firmen o marquen del modo que sea su participación, incluidos
aquellos que transportan o manejan las muestras de sangre (grupo
técnico encargado de métodos de análisis de DNA, "Guidelines for a
quality assurance program for DNA analysis", Crime Laboratory
Digest 22, 21-43, 1995);
sexto, la extracción forzosa de sangre en
cumplimiento de las leyes se considera inconstitucional en los
EE.UU. (Lehman, Nature 394, 818, 1998).
Con el fin de superar estos inconvenientes se han
realizado últimamente ensayos en los que, en lugar de sangre, se
emplean células epiteliales de la boca. Las células epiteliales de
la boca tienen ventajas con respecto a las muestras de sangre en
muchos aspectos. Sin embargo, tales procedimientos son complicados y
en el caso de la extracción de sangre se necesitan documentos y
testigos para asegurar con fiabilidad la asociación entre el donante
de sangre y una persona concreta a estudiar. Además, la toma de
muestras de células epiteliales del interior del cuerpo provoca
rechazo en la persona objeto de estudio.
La investigación intensa y exhaustiva en el campo
de la investigación genética, repetida por los inventores presentes
con el objetivo de superar los problemas convencionales que surgen
durante la toma de muestras de sangre o de células orales, se ha
traducido en el hallazgo de que la epidermis podría ser la fuente
ideal de DNA y que los materiales de DNA podrían obtenerse de la
epidermis en una cantidad suficiente para permitir el análisis del
DNA utilizando una lámina adhesiva, con la ventaja de que no sería
necesario tomar otras medidas de identificación adicionales. Es
decir, cuando se obtiene el DNA de la epidermis de los dedos, de las
palmas, de las plantas del pie o de los dedos de los pies utilizando
láminas adhesivas, se reservan cantidades suficientes de DNA en las
láminas adhesivas junto con las huellas dactilares, huellas de las
palmas o huellas de los dedos de los pies, que permiten que los
dadores de muestras de DNA pueden distinguirse en todo momento como
individuos sin necesidad de fotografiarlos ni de utilizar otras
técnicas de identificación. Dado que los pedazos de epidermis
pegados a la lámina adhesiva de la presente invención se hallan en
estado seco, el DNA de los pedazos arrancados puede conservarse de
forma estable durante un largo período de tiempo. Junto con las
huellas impresas sobre la lámina adhesiva, los perfiles de DNA que
se obtienen de la epidermis pegada a la lámina pueden utilizarse
para la identificación de cadáveres desconocidos, para las pruebas
de paternidad, para la investigación de enfermedades hereditarias,
etc.
Es, pues, un objeto de la presente invención la
superación de los problemas anteriores, propios de la técnica
anterior y desarrollar un método para la obtención de DNA en el que
tanto la toma de muestras de DNA como la identificación de la
persona a estudiar puedan realizarse de modo simultáneo.
Otro objeto de la invención consiste en
proporcionar un medio de obtención o almacenaje de muestras de DNA a
partir de individuos o de una población.
En otro aspecto de la invención se proporciona un
método para obtener DNA humano para análisis genéticos que consiste
en la etapa de extraer DNA de un pedazo de la epidermis arrancado
con una lámina adhesiva, en el que la epidermis se toma de una
persona a estudiar mediante una lámina adhesiva.
En otro aspecto de la presente invención se
proporciona un método de análisis genético empleando DNA humano que
consta de las etapas de visualización de las huellas epidérmicas en
forma de imagen, en las que los pedazos de la epidermis se han
tomado de la piel de una persona a estudiar mediante una lámina
adhesiva; de grabación de la imagen en un medio óptico o
electrónico; de extracción del DNA de los pedazos de epidermis
arrancados con la lámina adhesiva; y de medición de las propiedades
físicas y químicas del DNA.
En otro aspecto de la invención se proporciona un
método de tomar epidermis o de almacenar DNA que consiste en pegar
piel sobre láminas combinadas, en el que las láminas combinadas
constan de una lámina adhesiva y de una lámina de protección para
proteger la superficie adhesiva de la lámina adhesiva.
En otro aspecto se proporciona un kit para tomar
pedazos epidérmicos o de extraer DNA que consiste en una solución
violeta cristalina y por lo menos un conjunto de láminas combinadas
que consiste en una lámina adhesiva y una lámina protectora para
proteger la superficie adhesiva de la lámina adhesiva.
Los objetos anteriores y diversos, los aspectos y
otras ventajas de la presente invención se entenderán mejor con la
siguiente descripción detallada, realizada en combinación con las
figuras anexas, en ella:
en la figura 1 se representa una estructura de
una lámina adhesiva para arrancar la epidermis, con arreglo a la
presente invención;
en la figura 2 se representa una imagen de una
huella palmaria que, después de la tintura sobre la lámina adhesiva,
se introduce en un sistema computerizado;
en la figura 3 se representan imágenes de huellas
dactilares ampliadas a partir de la imagen de la huella
palmaria;
en la figura 4 se representan electroferogramas
que ilustran la influencia de varios factores empleados para aislar
el DNA en el análisis del DNA;
en la figura 5 se representan electroferogramas
que ilustran el efecto de la purificación adicional por
cromatografía a través de Sephadex G-50 en la
eliminación de materiales inhibidores;
en la figura 6 se representa la cuantificación
indirecta del DNA epidérmico extraído de una pieza de 1,5 cm x 0,5
cm de lámina adhesiva;
en la figura 7 se representan electroferogramas
que ilustran que el análisis del DNA es imposible cuando la
epidermis se toma con un papel no adhesivo o con una lámina adhesiva
solamente por una cara recubierta con una película;
en la figura 8 se representan las características
alélicas en tres STR (short tandem repeats) y un gen de amelogenina
como resultado de una prueba de paternidad, en la que se aíslan
nueve STR y se amplifican los genes de amelogenina mediante una
reacción PCR múltiplex en la que el DNA aislado de una lámina
adhesiva se emplea como molde;
en la figura 9a se representa una secuencia de
nucleótidos de un gen ACE (enzima convertidora de
angiotensinógeno), obtenido empleando el DNA aislado de la
sangre;
en la figura 9b se representa una secuencia de
nucleótidos del mismo gen ACE resultante de la secuenciación del DNA
obtenido usando la lámina adhesiva de la presente invención; y
en la figura 9c se representa una secuencia de
nucleótidos de una región F13A01 que se determina empleando el DNA
obtenido empleando la lámina adhesiva.
En la presente invención, el DNA puede obtenerse
de la epidermis. En este sentido se utiliza la lámina adhesiva para
obtener pedazos epidérmicos que son fuentes de DNA. Es decir, el DNA
extraído de los pedazos epidérmicos arrancados con la lámina
adhesiva.
Además, en un aspecto, la presente invención
proporciona un método para obtener DNA de la epidermis mediante el
uso de una lámina adhesiva.
El término "epidermis o pedazos de
epidermis" empleado en esta descripción indica tejidos existentes
en la superficie de la piel humana o animal o materiales secretados
por la misma, que se utilizan como fuente de DNA a partir de la cual
puede extraerse el DNA, en la presente invención.
El término "lámina adhesiva" utilizado en la
presente significa una estructura de tipo lámina en la que el agente
adhesivo se aplica por lo menos sobre una de las caras del soporte.
Una lámina adhesiva útil en la presente invención está compuesta
básicamente por un soporte y un adhesivo aplicado sobre el mismo,
tal como se indica en la figura 1. El soporte es de un material
sólido que puede moldearse en forma de lámina y puede recibir un
adhesivo sobre su superficie. Son ejemplos de materiales soporte
utilizables en la presente invención el papel, las resinas
sintéticas, por ejemplo la celulosa, el polipropileno, el
polietileno y el PVC, las fibras, por ejemplo las empleadas en
emplastos adhesivos y los metales, por ejemplo el aluminio.
La lámina adhesiva se fabrica fundamentalmente
aplicando un adhesivo sobre una de las caras del soporte.
Opcionalmente, una cara del soporte puede recibir un adhesivo,
mientras que la cara opuesta se forra por ejemplo con una lámina de
plástico que no puede despegarse.
Cuando el soporte es papel, sus caras opuestas se
recubren con preferencia con una lámina insoluble, porque varios
materiales inhibidores podrían desprenderse del papel durante la
extracción del DNA.
El adhesivo y el recubrimiento desempeñan un
papel muy importante en la toma del DNA de la epidermis (ver figura
7). Cuando se toma la epidermis empleando una papel sin adhesivo,
entonces es virtualmente imposible detectar el DNA incluso después
de una amplificado por una reacción en cadena de polimerasa (PCR)
con cebos fluorescentes o radiomarcados. Se cree que las láminas
adhesivas sin recubrir o recubiertas por una cara arrancan pedazos
de la epidermis en el mismo grado que las láminas adhesivas
recubiertas por ambas caras, pero los materiales inhibidores de la
extracción del DNA se desprenden de las láminas no recubiertas o
recubiertas por una cara, haciendo imposible leer los picos de DNA
después de la PCR primaria. En este caso, la
re-amplificación del producto de la PCR primaria
puede permitir la detección del DNA, pero no se recomienda porque es
un procedimiento complejo, tiene inconvenientes económicos y
conlleva grandes márgenes de error.
Es preferible cubrir la superficie adhesiva con
una lámina protectora recubierta que no reaccione con el adhesivo,
con el fin de proteger la superficie adhesiva y los pedazos de
epidermis pegados a la misma, tal como se indica en la figura 1.
La lámina adhesiva de la presente invención debe
tener unas dimensiones suficientes para poder albergar en su
interior la mano o el pie, por ejemplo un tamaño A5 o B5. Si fuera
necesario para el almacenaje, el transporte u otras razones, la
lámina adhesiva puede reducirse a un tamaño idóneo para contener
solamente los dedos de la mano o del pie.
Es preferible que los pedazos epidérmicos se
obtengan de las palmas, de los dedos, de la planta del pie y/o de
los dedos del pie. Las huellas de estas partes del cuerpo permiten
la identificación de los donantes de epidermis (ver figuras 2 y
3).
Es más preferible obtener pedazos epidérmicos de
la palma de la mano. En el caso de que la palma de la mano no
proporcione huellas claras en los bebés recién nacidos, las muestras
de epidermis podrán obtenerse pegando la lámina adhesiva sobre otras
superficies de la piel, por ejemplo la planta del pie, el pecho,
etc. Las superficies de la piel que deben dejar su huella sobre la
lámina adhesiva deben estar limpias y secas, de lo contrario la toma
de muestras de la epidermis resultaría obstaculizada por una
película formada entre las superficies de la piel y el adhesivo por
polvos, agua, aceites, etcétera, extendida sobre dichas
superficies.
La epidermis arrancada por la lámina adhesiva se
emplea para la extracción del DNA. Aunque se dispone de varios
métodos conocidos para la extracción del DNA, es preferido el método
siguiente de extracción del DNA de la epidermis arrancada con las
láminas adhesivas: la lámina que contiene la epidermis se sumerge
total o parcialmente en un tampón de extracción, que seguidamente se
hierve y después se precipita el DNA con alcohol. El tampón de
extracción del DNA se compone de resinas mixtas de intercambio
iónico y proteasas. Son ejemplos de ello la
Chelex-100 (Bio-Rad, EE. UU.) y la
Amberlite IRN-150 (Supelco, EE.UU.), las resinas
mixtas de intercambio iónico que pueden utilizarse en la presente
invención contienen componentes catiónicos y aniónicos. En la
presente invención puede emplearse cualquiera de las proteasas no
específicas, incluida la proteasa K, que se emplea habitualmente
para el aislamiento del DNA.
En detalle se introduce una pieza (1,5 cm x 0,5
cm) de lámina adhesiva que contiene epidermis en un tubo de ensayo
que contiene el tampón de extracción de DNA. Como alternativa, para
arrancar la epidermis de la lámina adhesiva puede utilizarse una
barra de algodón impregnada con una solución 0,2 N de NaOH. En este
caso se añade la epidermis recogida al tampón de extracción.
En un ejemplo de la invención, los inhibidores de
la PCR se eliminan por acción de una resina de intercambio iónico
(por ejemplo la Chelex-100) y de la proteasa del
tampón de extracción. Si no se trata la epidermis con la resina de
intercambio iónico, entonces pueden aparecer muchos picos no
específicos, dificultando la lectura de los picos importantes que
aparecen en el electroferograma (ver figura 4). La siguiente etapa
de ebullición es el medio más eficaz y directo para extraer el DNA
liberando la epidermis de la lámina adhesiva y trasladándola a la
fase solución, tal como se indica en la figura 4. No se obtiene DNA
sin etapa de ebullición. Con la precipitación alcohólica se recupera
el DNA en forma de perdigones. Una vez secados, los perdigones se
disuelven en una volumen idóneo de un tampón. El DNA obtenido puede
amplificarse por PCR, si fuera necesario.
En la mayoría de casos, el procedimiento anterior
proporciona DNA purificado en una cantidad suficiente para los
análisis genéticos ulteriores. Sin embargo, puede ocurrir que los
materiales inhibidores se eliminen de modo insuficiente en función
de los rasgos personales: tipos de piel y estados epidérmicos
durante la toma de muestras. En este caso es necesario un proceso
adicional de purificación. Es preferible un proceso cromatográfico
que puede descartar materiales de pesos moleculares bajos, del orden
de decenas de millares. Por ejemplo, las impurezas que tienen pesos
moleculares bajos, del orden de decenas de millares, pueden
eliminarse eficazmente empleando una resina cromatográfica de
tamizado molecular, por ejemplo la Sephadex G-50
(Sigma, EE. UU.) y un filtro del tipo Microcon 100 (Amicon, EE.UU.).
Después de esta purificación adicional puede obtenerse mayor
cantidad de DNA purificado y mejores resultados de la PCR, como se
indica en la figura 5.
En lo que respecta a la cantidad de DNA obtenido
de la lámina adhesiva, esta cantidad es muy pequeña de modo que no
es fácil realizar una medición precisa, pero puede realizarse
indirectamente. Por ejemplo, cuando se realiza una medición precisa,
el DNA extraído de la sangre puede diluirse hasta un intervalo de
concentración similar al del DNA extraído con la lámina adhesiva.
Cuando se amplifica el DNA por PCR, la amplificación es proporciona
al número de copias del molde de DNA empleado hasta que se alcanza
un estado de saturación completa. Por lo tanto, una estimación
indirecta de la cantidad de DNA obtenido de la lámina adhesiva puede
realizarse amplificando el DNA, al mismo tiempo que una muestra de
DNA diluido de control, en las mismas condiciones. Gracias a esta
medición indirecta se ha encontrado que se puede obtener 1 ng de DNA
epidérmico de una superficie de 1,5 cm x 0,5 cm de lámina adhesiva
(ver figura 6).
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método de análisis de genes humanos, en el que los
pedazos de epidermis se obtienen empleando una lámina adhesiva y se
aísla el DNA de los pedazos epidérmicos y se miden las propiedades
físico-químicas. El método del análisis genético
incluye las etapas siguientes:
a) arranque de pedazos epidérmicos de una persona
a estudiar empleando una lámina adhesiva;
b) visualización de la huella epidérmica en forma
de imagen;
c) grabación de la imagen en un medio óptico o
electrónico;
d) aislamiento del DNA de los pedazos epidérmicos
arrancados con la lámina adhesiva; y
e) determinación de las propiedades físicas y
químicas del DNA.
Las etapas de a) a d) pueden complementarse con
el método de obtención de DNA definido anteriormente.
Cuando en la lámina adhesiva de imprime la huella
de una palma de la mano o de una planta del pie, la huella de la
palma, la huella dactilar o la huella de los dedos de los pies que
se han formado en la lámina adhesiva puede visualizarse con un
colorante idóneo. El colorante preferido es el violeta cristal.
Después de haberse estampado la huella de la palma de la mano o de
la planta del pie sobre la lámina adhesiva, se obtiene la impresión
de las arrugas superficiales de la epidermis en la lámina adhesiva.
Sumergiendo la lámina en una solución de violeta cristal al 1%
durante unos 10 segundos y lavando la lámina con agua destilada, la
imagen de la huella de la palma o la huella de la planta del pie
aparece en un color azul claro (ver figuras 2 y 3).
Por lo general, la cantidad de DNA que puede
obtenerse de la lámina adhesiva es proporcional a la intensidad del
colorante violeta cristal con el que se ha teñido la lámina
adhesiva. En lo que respecta a la huella de la palma de la mano, la
porción central de la palma deja una huella menos marcada, mientras
que la porción más baja de la palma resulta bien teñida. La
intensidad de la tintura depende también del tipo de piel de cada
persona, de la sequedad de la mano en el momento de tomar la
muestra, etcétera. Una porción de lámina impresa con la huella, de
tamaño 1,5 cm x 0,5 cm, correspondiente a la porción bien teñida,
permite obtener DNA en una cantidad de 1 ng (ver figura 6). Este
tamaño cabe dentro de un microtubo de 1,5 ml.
En lo que respecta a la grabación y almacenaje de
la imagen epidérmica visualizada con el colorante, se necesita un
instrumento óptico o electrónico para realizarlos. Por ejemplo,
debido a que la huella de la palma o la huella dactilar tiene
dibujos (patrones) muy finos, resultan muy difíciles de discernir a
simple vista. Puede emplearse una lupa para observar la imagen desde
más cerca, siendo útil una lente amplificadora para tomar
fotografías de la imagen. La imagen fotografiada en una película con
una cámara analógica puede computerizarse en un archivo digital
mediante un escaneo. Como alternativa, la huella de la palma de la
mano o la huella dactilar puede introducirse directamente en forma
de archivo de ordenador utilizando una cámara digital o un escáner.
La similitud entre dos o más huellas de palmas de las manos, huellas
dactilares o huellas de los pies puede determinarse mediante una
lupa o un programa informático convencional. Estas imágenes
computerizadas de las huellas dactilares, huellas de las palmas y
huellas de los pies de la persona a estudiar pueden grabarse y
almacenarse junto con los resultados de los análisis obtenidos en la
etapa e).
En lo que respecta a la determinación de las
propiedades físicas y químicas del DNA, dicha determinación puede
realizarse examinando las propiedades
físico-químicas de la secuencia de nucleótidos, por
ejemplo la longitud de los fragmentos de DNA amplificados por PCR,
los comportamientos de hibridación, la movilidad electroforética,
etc. por secuenciación directa del DNA. Los exámenes en los que se
investigan los comportamientos de hibridación incluyen el análisis
Southern blot, los análisis automatizados empleando chips de DNA,
etcétera. Además, los exámenes en los que se estudia la movilidad
electroforética incluyen los ensayos SSNP, SSCP, etcétera.
El objeto del análisis del DNA es determinar qué
tipo de examen tiene que aplicarse. Si el análisis del DNA tiene
como objetivo la escritura (typing) del DNA, por ejemplo en las
pruebas de paternidad o en los ensayos forenses, los muestras de DNA
se utilizarán para determinar el tipo de un gen especificado. A tal
fin, los genes o segmentos de genes de interés se seleccionan en
función del objeto final del análisis del DNA. Por ejemplo, cuando
el objeto es la identificación genética de individuos asociada con
la prueba de la paternidad o con ensayos forenses, el objetivo se
dirigirá a diversos lugares STR (short tandem repeat). Cuando el
interés se dirige a una enfermedad concreta o a la investigación de
un gen particular en sí mismo, el objetivo serán uno o varios genes
dentro del conjunto de los genes humanos que se estiman en ochenta
mil. Se amplifican algunas de las secuencias de nucleótidos de los
genes diana.
Para determinar las propiedades
físico-químicas del DNA pueden utilizarse
procedimientos convencionales de marcado (labeling), en los que se
marcan el gen diana o su secuencia de nucleótidos complementaria
para realizar un análisis cuantitativo o cualitativo. Los
procedimientos preferidos de marcado incluyen la autorradiografía,
el marcado de fluorescencia, etcétera. Como alternativa puede
utilizarse la tintura de plata para la detección del DNA no
marcado.
Los análisis genéticos de la etapa e) se dividen
en general en dos categorías.
La discriminación de los alelos es objeto de uno
de los dos. Por ejemplo, los diferentes tipos de los STR se
determinan presuntamente por los tamaños de los fragmentos de DNA
amplificado. En un ejemplo de la presente invención, los STR y los
genes de amelogenina se investigan en términos de diferencia de
longitud de los genes empleando un kit perfilador de DNA. En otro
ejemplo, el kit perfilador se aplica prácticamente a la prueba de
paternidad. Cuando se aísla el DNA de pedazos epidérmicos arrancados
con las láminas adhesivas, se amplifica por PCR y los alelos STR,
que son comunes entre un hijo real y sus padres, se detectan de modo
apreciable, como se indica en la figura 8.
El segundo tipo de análisis genético es
determinar la secuencia de nucleótidos de un gen. Dado que la
diferencia en la longitud de los fragmentos de DNA es, en
consecuencia, debida a una inserción o deleción de nucleótidos, la
determinación de las secuencias de nucleótidos proporciona
información acerca de las mutaciones que tienen una influencia
absoluta en la fisiología del organismo, pero no aportan diferencias
en la longitud de los fragmentos de DNA. Estas mutaciones incluyen
la trasposición o la inversión y son difíciles de detectar cuando se
emplean técnicas distintas a la secuenciación directa.
En la presente invención se amplifican para la
secuenciación el F13A01 (uno de los lugares STR) y la ACE parcial
(enzima convertidora de angiotensinógeno). Al igual que otros genes
relacionados con el cáncer o con enfermedades hereditarias, los
genes de la ACE y el F13A01-STR son genes únicos en
todo el genoma, por lo que se llaman también genes de copia simple
(single-copy genes). Esto demuestra que incluso un
gen de copia simple puede detectarse y secuenciarse de modo
razonable cuando el DNA se obtiene a partir de la lámina adhesiva y
se amplifica.
En relación con la figura 9, se trata de
resultados de la secuenciación del DNA en un secuenciador
automático. En la figura 91 se representa una secuencia de
nucleótidos del gen ACE que se obtiene a partir de 5 ng de DNA
aislado de la sangre, mientras que en la figura 9b se representa una
secuencia de nucleótidos de la misma región que se obtiene por
secuenciación del DNA arrancado con la lámina adhesiva de la
presente invención. En la figura 9c se representa una secuencia de
nucleótidos de una región F13A01, que se determina empleando DNA
arrancado con la lámina adhesiva. En particular, dado que el gen
F13A01 tiene alelos 3.2 y 4, se elige un DNA genómico, extraído de
un heterocigoto, para la determinación de sus secuencias de
nucleótidos. Esto se produce por la coexistencia de diferentes
secuencias de nucleótidos en una porción de dos fragmentos de DNA
amplificado, lo cual demuestra que el DNA arrancado con la lámina
adhesiva de la presente invención puede ser útil para investigar el
SNP (polimorfismo de nucleótidos simples) o para analizar la
mutación de las secuencias de nucleótidos.
En los ejemplos correspondientes a las figuras de
4 a 8 se determina si el DNA extraído de la lámina adhesiva es
idóneo para la identificación genética. Se utiliza en particular un
kit perfilador de DNA (Profiler-Plus, Perkin Elmer,
EE.UU.) que se ha desarrollado para la identificación genética y
posteriormente se efectúa un examen con un secuenciador automático
de nucleótidos ABI310 (Perkin Elmer, EE. UU.) con el fin de
determinar los patrones de los alelos.
El kit Profiler-Plus se ha
desarrollado para desarrollar simultáneamente 10 regiones de los
genes, incluidas 9 regiones STR y un gen de amelogenina, cuyas
diferencias en las secuencias de nucleótidos de los cromosomas X e Y
se utilizan para discriminar el sexo. Esta amplificación simultánea
de múltiples genes es más difícil de realizar que la amplificación
de una o dos secuencias de nucleótidos en otros ensayos. Por lo
tanto, si los productos de la PCR de las diez regiones del kit
Profiler-Plus y sus patrones electroforéticos se
obtienen de modo apreciable, esto confirma que la muestra de DNA
puede utilizar en todas las PCR generales y en electroforesis. El
kit Profiler-Plus contiene los nueve pares de
cebadores STR y solamente se marca con un colorante fluorescente un
cebador del extremo 5' de cada par. Tres STR, en los que los
intervalos de los tamaños de los fragmentos de los alelos no se
solapan, se adjudican a un grupo, y los grupos se distinguen entre
sí empleando tres colores diferentes de colorantes fluorescentes.
Cuando se someten a electroforesis en un secuenciador automático de
nucleótidos, se determina la movilidad de los fragmentos de DNA por
el período de tiempo que requieren para alcanzar un punto irradiado
con un rayo láser, mientras que las bandas que aparecen en la
electroforesis convencional se presentan en forma de picos sobre el
eje X de las figuras. En este electroferograma, su extremo izquierdo
es la posición del foco láser, correspondiente al extremo inferior
de un gel convencional, y los fragmentos mayores ocupan posiciones
más a la derecha. Por reflejar la intensidad de la fluorescencia, la
altura de los picos es proporcional a la cantidad del DNA. Los tres
marcadores fluorescentes diferentes se reconocen por separado y se
representan en forma de tres colores distintos.
Si el DNA obtenido con las láminas adhesivas está
suficientemente purificado y abundante para detectarse con tal
sistema de marcado fluorescente, se leerán picos claros en las
posiciones de cada alelo de STR y amelogenina del electroferograma;
en caso contrario no se detectarán picos, aparecerán picos que son
demasiado bajos para discernirse de la línea base o se detectarán
picos no específicos que son demasiado diferentes para asegurar la
fiabilidad.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona láminas combinadas que se utilizan para arrancar
epidermis de individuos y almacenar el DNA de los donantes de
epidermis. Las láminas combinadas para tomar muestras de epidermis o
para almacenar el DNA consisten en una lámina adhesiva para arrancar
epidermis y una lámina protectora.
La lámina adhesiva para arrancar epidermis es
idéntica en su estructura a la lámina adhesiva empleada en la etapa
a) del método de obtención de DNA epidérmico. Es decir, la lámina
adhesiva para arrancar epidermis consta de un soporte, una de cuyas
caras está recubierta con un adhesivo. El soporte puede ser de
papel, de resina sintética, de fibras o de metal y se fabrica
recubriendo por lo menos una de sus caras con una película
insoluble.
La lámina protectora puede ser de cualquier
material flexible que no se pegue sobre la superficie adhesiva. No
es preferido un material que reaccione con la superficie adhesiva o
con los pedazos de epidermis pegados a la misma. El material
preferido para la lámina adhesiva es por ejemplo un papel, una de
cuyas caras esté recubierta con una película insoluble.
Las láminas combinadas para arrancar epidermis o
para almacenar DNA pueden utilizarse como medio para almacenar
muestras de epidermis de un individuo o de una población o como
medio para entregar el DNA a un instituto que realice pruebas
genéticas.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un kit para arrancar epidermis o para extraer DNA, el
kit contiene una o varias láminas combinadas para arrancar epidermis
o para almacenar DNA.
Los usos del kit incluyen la toma de muestras de
la epidermis de una o de varias personas a estudiar, la reserva de
la epidermis para usos posteriores, la obtención de epidermis para
poder extraer DNA, etcétera.
El componente fundamental del kit son las láminas
combinadas para arrancar epidermis o almacenar DNA, cuyas
características se han descrito anteriormente.
Los componentes adicionales del kit pueden ser la
solución de violeta cristal; resinas mixtas de intercambio iónico;
proteasas y tampones de las mismas; soluciones de acetato sódico,
acetato potásico y cloruro sódico; tampón TE o tampón Tris; columnas
para la cromatografía de tamizado molecular; filtros; manual de
instrucciones; etcétera.
Entre los componentes adicionales, la solución de
violeta cristal se emplea para teñir la huella de la palma de la
mano, las huellas dactilares, etcétera, suministrada con preferencia
en una concentración del 1% (p/v).
Las resinas mixtas de intercambio iónico; las
proteasas y los tampones de las mismas; la solución de acetato
sódico, de acetato potásico o de cloruro sódico; y el tampón TE o el
tampón Tris son agentes de extracción del DNA de la epidermis. Son
ejemplos de resinas mixtas de intercambio iónico la
Chelex-100 (Bio-Rad, EE.UU.) y la
Amberlite IRN-150 (Supelco, EE.UU.). Las proteasas
están representadas por la proteasa K y los tampones de proteasa
contienen con preferencia 50 mM de Tris (pH 7,5) y 5 mM de cloruro
sódico. Las soluciones de acetato sódico, de acetato potásico y de
cloruro sódico, las sales empleadas en la precipitación alcohólica
convencional, pueden suministrarse con preferencia en una
concentración 0,3 M. En el kit de la presente invención puede
incluirse además alcohol diluido (con preferencia del 95% o del
70%). El tampón TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 8,0) o el tampón
Tris se emplean para resuspender los perdigones de DNA o para
conservar el DNA durante un largo período de tiempo. El tampón Tris
se prepara con preferencia en una concentración 10 mM y se ajusta a
pH 8,0.
Las columnas para la cromatografía de tamizado
molecular y los filtros son útiles para la purificación adicional en
caso de ser insuficiente la eliminación de los inhibidores de la
reacción posterior. Son preferidos las columnas o filtros que puedan
excluir moléculas de peso molecular inferior a decenas de millares
de kDa. Un ejemplo óptimo de resina para la columna es la Sephadex
G-50 (Sigma, EE.UU.) y de filtro el Microcon 100
(Amicon, EE.UU.).
El kit puede contener además microtubos de 1,5 ml
como instrumento para la extracción del DNA.
El kit puede contener además una serie de
reactivos para la PCR, por ejemplo un tampón de PCR, nucleótidos,
una especie de polimerasa de DNA que sea resistente al calor y
cebadores. La región que se pretende amplificar con la intervención
de los cebadores se determina en función del objetivo final del
análisis de DNA. Por ejemplo, puede efectuarse la amplificación de
la totalidad de la región o de una parte de la región de uno o de
varios genes en el caso del diagnóstico de una enfermedad o de la
investigación genética. Los genes amplificados en el caso de la
identificación genética pueden ser uno o varios STR y/o una porción
de un gen diana, por ejemplo la amelogenina.
A la luz de los ejemplos siguientes podrá
conseguirse una mejor comprensión de la presente invención, dichos
ejemplos se presentan a título ilustrativo, pero en modo alguno
pretenden limitar el alcance de la presente invención.
En la figura 1 se ilustra una forma de ejecución
preferida de una lámina adhesiva utilizada en el método de
aislamiento del DNA de la epidermis. La lámina adhesiva
representada en la figura 1 contiene un adhesivo que se pondrá en
contacto con la piel, y un soporte, que es de papel y está
recubierto con el adhesivo. Además, para proteger de la
contaminación o de una eventual pérdida el adhesivo y los pedazos de
epidermis arrancados por el adhesivo, se emplea una lámina
protectora recubierta que no puede interaccionar con el adhesivo.
Cuando el soporte es de papel, como en la figura 1, es necesario
recubrir ambas caras del soporte con el fin de prevenir la
liberación de materiales inhibidores desde el papel durante la
extracción del DNA. El efecto recubridor se describirá seguidamente
(ejemplo VII).
En la figura 2 se representan imágenes de las
huellas de la palma de la mano y del pulgar de un adulto obtenidas
con la lámina adhesiva (tamaño A5) del ejemplo I. Después de recibir
la huella de la palma se impregna la lámina adhesiva con una
solución de violeta cristal del 1% (Sigma, EE.UU.) durante 10
segundos y después se lava con agua destilada para visualizar la
huella de la palma teñida de azul. A continuación se seca el
adhesivo en el aire y se cubre con una lámina de plástico
transparente. La imagen teñida de azul se introduce en un ordenador
a 300 dpi mediante un escáner (modelo GT-5000,
Epson, Japón). A partir de este archivo se imprime la huella de la
palma de la mano con la misma resolución que se presenta en la
figura 2.
Dado que la huella de la palma de la mano del
ejemplo II se ha grabado en un archivo que puede leerse con
ordenador, podrá ampliarse la imagen de la huella de la palma
presentada en la pantalla del ordenador para ver las huellas
dactilares gracias a un programa informático, por ejemplo el
Photoshop, versión 5.0 (Adobe, EE.UU.). Si fuera necesario, para
ampliar solamente las porciones de las huellas dactilares puede
emplearse una cámara digital (Ricoh RDC-4300)
equipada con una lente ampliadora o con lente de aproximación y los
archivos digitales así obtenidos pueden introducirse directamente en
el ordenador. En la figura 3 se presentan imágenes de huellas
dactilares ampliadas.
Se extrae el DNA con una lámina adhesiva en la
que ha quedado grabada la huella de la palma de la mano y se
amplifica por PCR empleando un sistema perfilador fabricado por
Perkin-Elmer. Se analizan los perfiles de DNA del
producto de la PCR empleando un secuenciador automático de
nucleótidos ABI310 (Perkin-Elmer, EE.UU.).
De la lámina adhesiva del ejemplo II se corta una
pieza de tamaño 1,5 cm x 0,5 cm y se sumerge en un tampón de
extracción que se ha preparado mezclando 5 \mul de una suspensión
de resinas mixtas de intercambio iónico Chelex-100
al 5% (Rio-Rad). Se incuba la solución a 56ºC
durante 30 min, se calienta a 100ºC durante 10 min y se centrifuga a
13.000 rpm durante 10 min. Se traslada el líquido sobrenadante a
tubos nuevos y se somete a una precipitación en alcohol,
obteniéndose el DNA prácticamente libre de materiales inhibidores.
El DNA obtenido forma un perdigón seco que se disuelve en 20 \mul
de tampón TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM de
EDTA).
En la figura 4 se representan los resultados de
una PCR múltiplex de 9 regiones STR y una parte de un gen de
amelogenina empleando el kit Profiler-Plus (Perkin
Elmer). En la reacción PCR múltiplex se emplea una mezcla que consta
de 20 \mul de la solución de DNA, 20 \mul de un tampón, 10 \mu
de un par de cebadores y 1 \mul de una
Taq-polimerasa (Ampli-Taq Gold,
Perkin-Elmer), los tres últimos se incluyen en el
kit Profiler-Plus. Se ajusta la máquina de ciclos
térmicos (gradiente T, Biometra, Alemania) a los valores siguientes:
95ºC durante 11 min (predesnaturalización); 29 ciclos térmicos a 95ª
durante 1 min (desnaturalización), 59ºC durante 1 min (fusión) y
72ºC durante 1 min (alargamiento); y finalmente 60ºC durante 45 min
(post-alargamiento).
Después de la amplificación se añaden 3 \mul de
la muestra a 15 \mul de una solución de peso molecular estándar
preparada por mezcla de 1 \mul de un marcador de peso molecular,
marcado con Rox, un colorante fluorescente de color diferente,
suministrado con el kit, con 24 \mul de formamida (Sigma, EE.UU.).
Se calienta la mezcla a 95ºC durante 3 min, se coloca sobre hielo
durante 3 min y se somete a electroforesis en un secuenciador
automático de nucleótidos (ABI310).
En la figura 4, el símbolo (-) significa que se
ha omitido el correspondiente componente o proceso de tratamiento en
el procedimiento de extracción del DNA. El panel más bajo resulta de
la muestra que se somete a todos los tratamientos con la resina de
intercambio iónico Chelex, la proteasa y la ebullición.
El electroferograma de la figura 4 se obtiene de
tal manera que, después de haber medido los tiempos en los que los
fragmentos de DNA marcados con fluorescencia han pasado por un punto
de referencia, irradiado con un rayo láser, se puedan calcular a
partir de ellos las distancias con respecto al punto de partida. El
punto más a la izquierda del electroferograma es el punto de
referencia. Dado que los fragmentos más pesados de DNA se mueven con
mayor lentitud, están posicionados en puntos más alejados del punto
de referencia. El kit Profiler-Plus lleva tres
marcados fluorescentes de colores distintos. Se incluyen tres STR,
en los que los intervalos de tamaños de fragmentos de los alelos no
se solapan entre sí, en un grupo que se marca con un colorante
fluorescente de un color. De este modo, los nueve alelos de los STR
aparecen en tres colores dentro del electroferograma. Representando
la intensidad de la fluorescencia, la altura de los picos es
proporcional a la cantidad de DNA que se ha utilizado. Los picos que
se imprimen en gris pálido en la posición extrema izquierda indican
la amelogenina y los picos detectados corresponden solamente a
alelos del cromosoma X, porque la muestra de DNA que se ha utilizado
procede de una mujer.
Los resultados del ejemplo IV indican que se
pueden lograr buenos perfiles de DNA mediante los tratamientos con
Chelex y proteasas y un proceso de ebullición. Sin embargo, en la
práctica se detecta a menudo un exceso de materiales inhibidores de
la reacción en función de las características personales, tales como
tipos de piel y estados de la epidermis en el momento de la toma de
las muestras, de modo que no se pueden leer picos precisos y claros
con los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores.
En la figura 5 se representa la diferencia en el
perfil de DNA antes y después de la eliminación de los materiales
inhibidores de la reacción. Se disuelve el perdigón de DNA obtenido
después de la precipitación alcohólica del ejemplo IV en 100 \mul
de tampón TE y después se somete a cromatografía de columna con un
volumen de 1 ml de relleno Sephadex G-50. Se pasa la
solución de DNA a través del tubo Sephadex secado previamente con
vacío, obteniéndose un perdigón que se disuelve seguidamente en 20
\mul de agua desionizada. La reacción PCR se lleva a cabo
empleando el kit Profiler-Plus del modo descrito en
el ejemplo IV.
En caso de obtenerse de la sangre, el DNA puede
cuantificarse por absorción UV o mediante un colorante fluorescente
del tipo Hoechst 33258, debido a su presencia abundante. En cambio,
cuando se dispone de una cantidad del orden de trazas de DNA,
obtenida de la epidermis, no puede realizarse una cuantificación
directa. La estimación indirecta de la cantidad de DNA extraído en
el ejemplo IV se realiza comparando su grado amplificado con el
aislado a partir de la sangre. A tal respecto, el DNA obtenido a
partir de 100 \mul de sangre, se hace reaccionar con el colorante
Hoechst 33258 y después se cuantifica midiendo su absorbancia a 260
nm. Se diluye la solución de DNA en series de 0,125 ng/\mul. Como
molde para la PCR se emplea el DNA de la sangre diluido en serie o
el DNA epidérmico extraído de un recorte de lámina adhesiva de 1,5
cm x 0,5 cm, dicha reacción PCR se lleva a cabo en las mismas
condiciones mediante un kit Profiler-Plus
(Perkin-Elmer).
La obtención de un producto PCR es similar a un
cultivo bacteriano, ya que forma una curva sigmoidal. Para poder
realizar una comparación cuantitativa, la producción debe alcanzar
la fase exponencial. A tal fin se lleva a cabo la PCR en 29 ciclos,
en este ejemplo. Para simplificar, en la figura 6 solamente se
presenta la región FGA de los nueve STR del kit
Profiler-Plus. Los picos amplificados empleando el
DNA extraído de un recorte (1,5 cm x 0,5 cm) de lámina adhesiva
presentan alturas similares a las de los picos amplificados
empleando 0,5 ng de DNA de sangre, que se observa que son más altos
que los obtenidos a partir de 0,1 ng o de 0,25 ng de DNA de sangre.
Este resultado indica que puede obtenerse por lo menos 1 ng de DNA a
partir de la epidermis tomando en consideración la presencia de
materiales inhibidores de reacción en los extractos de la lámina
adhesiva.
La fabricación del papel se realiza mediante
diversos tratamientos químicos y los adhesivos tienen composiciones
complejas. Estos materiales que constituyen la lámina adhesiva de la
presente invención se eluyen junto con el DNA en el curso de la
extracción del DNA, afectando negativamente la reacción PCR del DNA.
Para eliminar fundamentalmente la elución de estos potentes
inhibidores de la reacción se recubre el papel de la presente
invención por ambas caras con una película impermeable.
En la figura 7 se representa el efecto de un
tratamiento con recubrimiento de este tipo. Se imprime la palma
sobre tres papeles diferentes: una hoja normal de papel sin
tratamiento alguno; una lámina adhesiva de base papel, del que
solamente se recubre una cara con una película y sobre ella se
aplica el adhesivo; y una lámina adhesiva de base papel, del que
ambas caras se recubren con una película y después se aplica el
adhesivo sobre ambas caras. En los tres casos se realiza la misma
comparación que en el ejemplo IV. En los electroferogramas del papel
normal y de la lámina recubierta por una sola cara casi no se
observan picos, salvo los pequeños picos distribuidos regularmente
(marcadores de pesos moleculares). Este resultado indica que el
adhesivo aplicado sobre la lámina adhesiva es indispensable para
obtener una cantidad suficientemente grande de muestra epidérmica,
mientras que la reacción PCR requiere necesariamente la eliminación
de diversos compuestos liberados por el papel.
Los padres reales (biológicos) y sus hijos
estamparon sus palmas sobre láminas adhesivas de la presente
invención, a partir de las cuales se construyeron los perfiles de
DNA empleando un kit Profiler-Plus, producto
comercial suministrado por la empresa
Perkin-Elmer.
En la figura 8 se presentan perfiles de DNA junto
con un perfil de DNA de un marcador estándar. Se observa que los
tres perfiles de DNA son diferentes entre sí, pero los picos de los
alelos de cada región STR, que se hallan en el perfil de DNA del
hijo, se encuentran también en las posiciones correspondientes de
los perfiles de DNA de cada uno de los padres, lo cual demuestra la
herencia de Mendel. En la gráfica superior se representan los alelos
de amelogenina en una forma escalonada estándar en las tres regiones
STR.
Este resultado pone de manifiesto que, al igual
que el DNA obtenido de la sangre, el DNA extraído de la epidermis
con la lámina adhesiva puede utilizarse para la identificación de la
filiación, incluidas las pruebas de paternidad.
En este ejemplo se somete a secuenciación de
nucleótidos un fragmento del gen ACE (enzima convertidora de
angiotensinógeno) que solamente tiene una copia en todo el genoma.
A tal fin se emplean como cebadores para la amplificación del gen
ACE dos oligonucleótidos sintéticos, representados por la SEQ ID NO:
1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. Para molde de la PCR se
emplean 20 \mul del DNA extraído con la lámina adhesiva del modo
descrito en el ejemplo IV, mientras que para control (referencia) se
toman 10 ng del DNA aislado de la sangre. La PCR consiste en 30
ciclos térmicos, en cada uno de ellos se realiza un calentamiento a
94ºC durante 1 min, a 58ºC durante 1 min y a 72ºC durante 1 min, por
este orden.
Se someten los productos de la PCR a la
secuenciación de nucleótidos por un método de secuenciación de ciclo
terminador empleando un kit Big-Dye Terminator
Sequencing (Perkin-Elmer). A 10 \mul de molde de
DNA amplificado se le añaden 4 \mul de Big-Dye
Terminator Reaction Mix y 40 \mul de un cebador (0,8 pmoles),
suministrados ambos en el kit, a la solución reaccionante resultante
se le añade agua desionizada hasta llegar a un volumen final de 20
\mul. Se somete esta mezcla a 25 ciclos térmicos en los que se
realiza un calentamiento a 96ºC durante 10 segundos, a 50ºC durante
5 segundos y a 60ºC durante 4 min, por este orden. Tal como se
recomienda en las instrucciones de uso del kit, el DNA amplificado
mediante la PCR se añade en una cantidad de 30 ng. Se realiza la
electroforesis en el secuenciador automático de nucleótidos ABI310
del modo indicado en el ejemplo IV.
En las figuras 9a y 9b se indican las secuencias
de nucleótidos de un gen ACE parcial derivado del DNA de la sangre y
del DNA epidérmico como moldes, respectivamente. En las figuras se
pone de manifiesto que la secuencia de nucleótidos del gen ACE
extraído con la lámina adhesiva es idéntico al obtenido del DNA de
la sangre.
En la figura 9c se representa una secuencia de
nucleótidos de la región F13A01-STR, obtenida
empleando el DNA epidérmico obtenido con la lámina adhesiva. Como
cebadores de la amplificación de la región
F13A01-STR del gen se emplean oligonucleótidos
sintéticos, descritos con la SEQ ID NO: 3 y NO: 4. En la figura 9c
pueden leerse claramente secuencias de nucleótidos en la región de
la base 180. Sin embargo se observan dos picos solapados en torno a
la región de la base 180. Este solapamiento se atribuye al hecho de
que el DNA genómico aislado a partir de la muestra forma un
heterocigoto en F13A01-STR.
Tal como se ha descrito anteriormente, el método
de aislamiento del DNA empleando una lámina adhesiva proporcionado
por la presente invención es muy conveniente para la toma de
muestras de DNA y permite superar los problemas causados por los
métodos convencionales de toma de muestra de sangre. En particular,
cuando se imprimen huellas de las palmas de la mano sobre las
láminas adhesivas, las huellas de las palmas o las huellas
dactilares pueden utilizarse como medida de identificación directa,
prescindiendo de los procedimientos laboriosos de fotografiar y
anotar que se han venido utilizando hasta el presente cuando las
muestras de DNA se toman con fines de identificación genética a
partir de la sangre o de células epiteliales de la boca.
Dado que la lámina adhesiva de la presente no se
halla en estado líquido, resulta muy fácil almacenarla,
transportarla y manejarla como muestra. Además puede enviarse por
correo. Por lo tanto, la lámina adhesiva de la presente invención
permite simplificar la exploración médica de genes relacionados con
enfermedades sin necesidad de que la persona a estudiar tenga que ir
al hospital.
Las células epidérmicas tomadas con la lámina
adhesiva se hallan en estado seco, de modo que el DNA puede
conservarse de modo estable. La lámina adhesiva es, pues, un medio
eficiente y efectivo de almacenaje del DNA para la posible
referencia en caso de incidentes, por ejemplo accidentes de
aviación, secuestros, procesos judiciales para la identificación de
la filiación, etc., además de permitir el establecimiento de bancos
de almacenaje de DNA.
<110> I.D. Gene Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un método para obtener muestras de
DNA de la piel humana con una lámina adhesiva
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
9FPO-09-04
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR 1998-39409
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-09-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR 1999-40052
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-09-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KOPATIN 1.5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' para la amplificación del
gen ACE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcctttct cccatttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' para la amplificación del
gen ACE
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipatttcagagc tggaataaaa tt
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 24
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 5' para la amplificación de
la secuencia F13A01
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipSTR
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggttgcac tcgagccttt gcaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 3' para la amplificación de
la secuencia F13A01
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipSTR
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcctgaatc atcccagagc caca
\hfill24
Claims (19)
1. Un método para la obtención de DNA humano para
análisis genético, que consiste en la etapa de extraer DNA de una
región de epidermis con una lámina adhesiva, en el que laepidermis
se toma de una persona a estudiar mediante una lámina adhesiva.
2. El método indicado en la reivindicación 1, en
el que la epidermis es la epidermis de la palma de la mano, de los
dedos, de la planta del pie o de los dedos del pie.
3. El método indicado en la reivindicación 1, en
el que la lámina adhesiva consta de un soporte, sobre una de cuyas
caras se ha aplicado un adhesivo, dicho soporte está hecho de resina
sintética, de fibras, de metal o de papel, ambas caras de dicho
soporte están recubiertas con una película insoluble.
4. El método indicado en la reivindicación 1, en
el que la etapa de extraer el DNA de una región de la epidermis con
la lámina adhesiva se lleva a cabo empleando una solución de
hidróxido sódico.
5. El método indicado en la reivindicación 1, en
el que la etapa de extraer el DNA de una región de la epidermis con
la lámina adhesiva se lleva a cabo sumergiendo una parte o la
totalidad de la lámina adhesiva en un tampón de extracción,
calentando el tampón a 80ºC o más, precipitando el DNA con alcohol y
realizando una cromatografía de tamizado molecular.
6. El método indicado en la reivindicación 5, en
el que el tampón de extracción contiene de una resina mixta de
intercambio iónico y una proteasa.
7. El método de análisis genético empleando DNA
humano que consiste en las etapas siguientes:
a) visualización de la huella epidérmica en forma
de imagen; en la que los pedazos epidérmicos se han arrancado de la
piel de una persona a estudiar mediante una lámina adhesiva;
b) grabación de la imagen en un medio óptico o
electrónico;
c) extracción del DNA de los pedazos epidérmicos
arrancados con la lámina adhesiva; y
d) medición de las propiedades físicas y químicas
del DNA.
8. El método indicado en la reivindicación 7, en
el que la etapa a) se lleva a cabo por tintura de la cinta adhesiva
con violeta cristal.
9. El método indicado en la reivindicación 7, en
el que la etapa b) se lleva a cabo empleando una cámara analógica,
una cámara digital y/o un escáner.
10. El método indicado en la reivindicación 7, en
el que las propiedades físicas y químicas del DNA son la longitud de
la secuencia de DNA amplificada mediante una reacción en cadena de
polimerasa, el comportamiento de hibridación, la movilidad
electroforética y las secuencias de nucleótidos.
11. El método indicado en la figura 10, en el que
la secuencia de DNA amplificada mediante una reacción en cadena de
polimerasa contiene uno o varios lugares STR (short tandem
repeat).
12. El método indicado en la figura 7, en el que
en la etapa d) se emplea tintura de plata, autorradiografía o
marcado fluorescente.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se emplean láminas combinadas
que contienen una lámina adhesiva y una lámina protectora para
proteger la superficie adhesiva de la lámina adhesiva.
14. El método indicado en la reivindicación 13,
en el que la lámina adhesiva contiene un soporte, sobre una de cuyas
caras se aplica un adhesivo.
15. El método indicado en la reivindicación 14,
en el que el soporte es de papel, de una resina sintética, de fibras
o de metal.
16. El método indicado en la reivindicación 14,
en el que por lo menos una de las caras de soporte está recubierta
con una película insoluble.
17. Un kit para arrancar pedazos de epidermis o
para extraer DNA que consta de una solución de violeta cristal y por
lo menos un conjunto de láminas combinadas que contienen una lámina
adhesiva y una lámina protectora para proteger la superficie
adhesiva de la lámina adhesiva.
18. El kit indicado en la reivindicación 17, que
contiene también por lo menos un compuesto elegido entre el grupo
formado por las resinas mixtas de intercambio iónico; las proteasas
y los tampones de las mismas; una solución de acetato sódico,
acetato potásico o cloruro sódico; el tampón TE o el tampón Tris; y
el manual de instrucciones.
19. El kit indicado en la reivindicación 18, que
contiene también por lo menos una columna para la cromatografía de
tamizado molecular y/o por lo menos un filtro.
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