CN101765665B - 用于基因绘图和单元型分型的原位方法 - Google Patents

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Abstract

本发明致力于用于提供受试者的确定性单元型的原位方法。通过本文所述方法生成的单元型信息比通过现有技术提供的、只给出推断单元型的单元型信息更精确。因而，在一个方面，本发明提供了用于获得多倍体受试者的遗传信息的原位方法，该方法包括下列步骤：自所述受试者获得生物学样品，所述样品含有(i)至少一种父本衍生DNA分子和/或(ii)至少一种母本衍生DNA分子；对任一种或多种所述父本或母本衍生DNA分子分析核苷酸序列信息，其中所述分析步骤确定任两种DNA标志物是以顺式存在于一条染色体上还是以反式存在于两条姐妹染色体间。原位方法(诸如FISH)的使用容许在DNA标志物上提供状态特异性信息，无需借助将姐妹染色体物理分开的方法。申请人提出，所述方法消除了关于单元型内两个或更多个基因座的状态的不正确的或误导性的推论的问题，而且容许揭示单元型内的两种或更多种参与基因，不因继承模式差异而变复杂。

Description

用于基因绘图和单元型分型的原位方法
发明领域
本发明广泛涉及遗传学领域。更具体的说，本发明涉及使用原位方法绘制基因组图的方法和测定受试者单元型的方法。
发明背景
基因组图描绘每条染色体上基因或其它标志物的次序及它们之间的间距。以数个不同分辨率水平或尺度构建了人类基因组图。最粗的分辨率是遗传连锁图，其通过DNA标志物(基因和其它可鉴定DNA序列)的继承样式描绘它们的相对染色体位置。遗传连锁图显示沿着染色体的特定DNA的相对位置。个体间不同的且在实验室中可检测的任何继承的身体或分子特征是潜在遗传标志物。标志物可以是表达的DNA区(基因)或没有已知编码功能但其继承样式可跟踪的DNA区段。DNA序列差异是尤其有用的标志物，因为它们是丰富的且易于精确表征。
要在绘图中有用，标志物必须是多态性的；也就是说，在个体间必须存在可变形式，使得它们在家族研究中的不同成员间是可检测的。多态性指DNA序列中平均每300-500bp发生一次的变异。外显子序列内的变异能导致看得见的变化，诸如眼睛颜色、血型、和疾病易感性的差异。大多数变异发生在内含子内，而且对生物体的外观或功能影响很小或没有影响，但是它们在DNA水平检测得到且能用作标志物。这些类型的标志物的例子包括(1)限制性片段长度多态性(RFLP)，其反映能被DNA限制酶切割的DNA位点的序列变异，和(2)串联重复序列的可变数目，串联重复序列指短的、重复的序列，其重复单元的数目有变化，因此长度也有变化(一项易于测量的特征)。通过观察两种标志物是如何频繁地一起继承，构建了人类遗传连锁图。
在同一染色体上位置彼此靠近的两种标志物会趋于一起自双亲传递至孩子。在精子和卵细胞的正常生成期间，DNA链偶尔断裂并在同一染色体上的不同位置中或在同一染色体的另一拷贝(即同源染色体)上重新连接。此过程(减数分裂重组)能导致最初在同一染色体上的两种标志物分开。彼此越靠近的标志物连锁越紧密，越不可能在它们之间发生重组事件并将它们分开。如此，重组频率提供了对两种标志物之间距离的评估。
遗传图的价值在于通过跟踪在患病个体中存在的(但在未患病个体中缺失的)DNA标志物的继承，能在图上定位遗传病，即使可能尚未了解该疾病的分子基础或尚未鉴定负责该疾病的基因。遗传图已经用于寻找数种重要疾病基因的精确染色体位置，包括囊性纤维化病、镰状细胞病、泰-萨克斯病、脆性X综合征、和强直性肌营养不良。
当前用于鉴定基因组内影响基因功能的基因的办法具有两项共同特征：首先，采用非编码序列变体标志物来揭示含有候选基因的染色体区；其次，基因组范围的分析寻找序列变体标志物与感兴趣表型之间的关联。通过基因组范围的关联分析(也称作连锁不平衡绘图)进行的基因发现是美国专利No.5,851,762的主题。
虽然基因组信息在连锁研究中是有用的，但是认为关于单倍组(haplome)的信息对于在限定疾病相关基因功能中鉴定感兴趣基因组区域的标志物是更加有用的。单倍组序列的使用减少了连锁研究中的错误，因为不需要考虑基因第二拷贝(像在同源染色体上提供的)对所考虑性状的影响。
在2003年，美国卫生研究院(National Institutes of Health)资助的国际联盟启动了一项为期3年、花费100,000,000美元的项目来创建人类基因组单元型图(称作“HapMap”)以推动复杂疾病中通过基于单元型的标志物等位基因-疾病基因关联进行的基因发现。此连锁不平衡等位基因关联绘图(“关联绘图”)策略涉及无关的患者个体，而且是家族不可得时家族(家谱)连锁分析的传统办法的最新替代方法。
被HapMap作为基础的假设是来自二倍体DNA基因分型的单元型推论充分分辨以进行关联绘图，保证继续作为基因组范围的基因发现的策略。
另一项假设是来自4个群体(西非尼日利亚、日本、中国、美国)的几百个体的SNP(单核苷酸多态性)分析会足以鉴定多余的SNP，由此鉴定足以表征所有(包括混合的)群体中单元型块的单元型标记单SNP或最小SNP集合。HapMap联盟还提出只有常见单元型(＞5-10％)会是常见的多基因疾病中和药物反应性中重要的，而且这些常见单元型会是200名左右个体的研究中可鉴定的。
另一项假设是单倍组组织成离散的“块”，每个块可用独特的SNP“标签”来鉴定。遗传学领域当前公认，通过HapMap项目揭示的最小基本SNP的使用会在任何群体中鉴定足够的常见单元型，用于检测在疾病基因搜索和药物-情感药物基因组学中共享的过量单元型。
如此，本领域现状是HapMap会是确定性的(definitive)，而且能够为连锁研究提供绰绰有余的信息。然而，对HapMap项目更深入的检查提示，该项目最多只会实现有限的信息，而且在其多基因疾病发现的应用中可能有基础性的缺陷。例如，SNP鉴定只会检测一部分的现存单元型，或许甚至不是所有常见发生的单元型。不常见的单元型(在HapMap中可能检测不到)可能也促成个体间的基因功能差异。
单倍组的假定块结构也可导致错误。预期重组和其它重排能影响混合群体中的单元型块结构，这可能不能通过对“核心”群体的有限分析来揭示。
预期推断(inferred)单元型的分辨能力在如下情况中会受到挑战，即单一染色体区域中存在两种或更多种具有不同的继承模式(隐性、显性、共显性)、功能不同(疾病倾向性的、疾病保护性的)、在疾病进展的不同阶段起作用的基因。在两条染色体都促成风险时(像复合杂合隐性疾病中)和在反式及顺式共显性相互作用与共显性继承基因(诸如HLA复合物的那些)一起发生的情况中，分辨能力会是最受考验的。本领域尚未认识到这些怀疑的重要性。
关于单元型分型关联绘图效用的一项关键测试是鉴定早已通过家谱连锁分析鉴定出的感兴趣基因区域的能力。在一项重要的测试案例中，关联绘图未能鉴定通过单元型共享连锁分析鉴定出的、鼻咽癌中遗传风险(RR：下界20-上界无穷)的6p21.3(HLA)区。这指出了本领域的另一个问题：基于非编码的策略的分辨能力不足以检测甚至最强的、与任何常见人类癌症的遗传关联。
已知或怀疑许多疾病是多基因的。确实，认为大多数疾病是多基因的，而单基因疾病是例外。由于来自母本和父本基因型的基因的继承样式，涉及多基因疾病的基因的鉴定在现有技术的方法中是复杂的。如此，虽然现有技术的绘图和基因发现方法在鉴定具有简单继承模式且简单涉及疾病的基因中是有用的，但是仍然清楚需要更加有力的方法来拆解复杂疾病中涉及的基因。
有利的是提供替代方法来调查细胞的单倍体状态。在给定方法因经济、易于使用、准确度、设备可得性原因或任何其它原因而不合适的情况中，可利用替代方法。
因而，本发明的一个方面是克服或至少减轻现有技术的问题。具体而言，本发明的目标是使用单倍体信息为更精确地基因绘图提供替代方法。
仅仅出于为本发明提供背景的目的，在本说明书中包括关于文件、动作、材料、装置、制品等等的讨论。没有提示或表示任何或所有这些事物构成现有技术基础的一部分或是本发明相关领域的公知常识，就因为它在本申请每一项权利要求的优先权日之前就存在了。
发明概述
本发明致力于用于提供受试者的确定性单元型等的原位方法。通过本文所述方法生成的单元型信息比通过现有技术方法提供的、只提供推断单元型的单元型信息更精确。因而，在一个方面，本发明提供了用于获得多倍体受试者的遗传信息的原位方法，该方法包括下列步骤：自所述受试者获得生物学样品，所述样品含有(i)至少一种父本衍生DNA分子和/或(ii)至少一种母本衍生DNA分子；对任一种或多种所述父本或母本衍生DNA分子分析核苷酸序列信息，其中所述分析步骤确定任两种DNA标志物是以顺式存在于一条染色体上还是以反式存在于两条姐妹染色体间。
申请人提出本文所述原位方法的使用消除了关于单元型内两个或更多个基因座的状态的不正确的或误导性的推论的问题，而且容许揭示单元型内的两种或更多种参与基因，不因继承模式差异而变复杂。通过以原位方法选择性分析母本衍生DNA和父本衍生DNA，本方法中提供了严格顺式状态关联的保证。原位方法的使用容许在病理学总论或研究实验室的背景中进行方便的分析。
在所述方法的一种形式中，所述序列信息涉及等位基因。在所述方法的另一种形式中，所述等位基因是编码序列等位基因。
申请人认识到在限定单元型时与最大似然算法的使用组合的二倍体材料的无差别使用中内在的问题的重要性。预期现有技术方法中的错误在调查具有多基因基础的性状时变得特别成问题。
对二倍体基因组或其部分的原位分析可以在二倍体细胞上实施，诸如体细胞。由于在临床中获得这些性细胞的问题，要避免天然单倍体材料(诸如精子细胞或卵子)的使用。在单元型分型中避免配子具有另一项优点，即认为减数分裂过程期间有时有重组事件，使得原来以顺式连锁的基因座变成以反式连锁。如此，分析配子的单元型会给出与自二倍体细胞获得的单倍体元件不同的(即不正确)的单元型信息。
在另一个方面，本发明提供了本文所述原位方法用于确定受试者的确定性单元型的用途。
在另一个方面，本发明提供了用于鉴定涉及多基因疾病或性状的基因的方法，该方法包括本文所述方法的使用。通过本文所述原位方法提供的确定性单元型的提供消除了使关于多基因系统中单基因参与的阐述变得混淆的不确定性。
发明详述
在一个方面，本发明提供了用于获得多倍体受试者的遗传信息的原位方法，该方法包括下列步骤：自所述受试者获得生物学样品，所述样品含有(i)至少一种父本衍生DNA分子和/或(ii)至少一种母本衍生DNA分子；对任一种或多种所述父本或母本衍生DNA分子分析核苷酸序列信息，其中所述分析步骤确定任两种DNA标志物是以顺式存在于一条染色体上还是以反式存在于两条姐妹染色体间。
申请人提出，上文所述原位方法的使用消除了关于单元型内两个或更多个基因座的状态的不正确的或误导性的推论的问题，而且容许揭示单元型内的两种或更多种参与基因，不因继承模式差异而变复杂。此外，所述方法适于掺入病理学总论或研究实验室。
本发明至少部分依据相对于现有技术单元型分型方法的改善及本文所述确定性单元型分型方法。为了更好地理解区别，考虑单元型当前在本领域中理解的概念及用于测定受试者的单元型的方法是有指导性的。
术语“单元型”是短语“单倍体基因型”的缩略语，而且当前公认为意指存在于单一母本或父本染色体上的一套核苷酸序列多态性或等位基因，通常作为一个单位来继承。在二倍体生物体(诸如人类)的情况中，单元型会含有一个基因座的成对等位基因的一个成员。
在现有技术方法中，单元型的测定以方便临床获得的二倍体材料的使用开始。申请人提出，无差别地使用二倍体材料的单元型分型公认形式是不当的。一种替代方法是使用天然单倍体材料(来自例如精子或卵子)，然而这一般是不方便的，而且对于女性是极度侵入性的。此外，来自配子的序列信息会因减数分裂期间的交叉事件而混淆，使得SNP间的顺式状态关联不能保证是真实的。
由于利用二倍体DNA的现有技术办法不容许将以顺式相连锁的基因座直接确定为单元型，单元型的发生概率是通过最大似然和基于相似算法的估值而推断的。如此，总是有如下的可能性，即两处多态性以反式状态存在，且因此不作为单一孟德尔单位来继承。因此，将现有技术方法更正确地描述成提供“推断单元型”。通过将孟德尔遗传的基本单位考虑成以亲本重组位点为界的染色体区段，本方法更紧密地涉及单元型的严格限定。
至今，本领域技术人员尚未质疑因未能考虑无差别使用二倍体起始材料的潜在不利结果而引入的错误的影响。因此，尚未认识到测定群体中的性状关联中的或受试者单元型分型中的问题。相反，申请人认识到在限定单元型时与使用最大似然算法组合地无差别使用二倍体材料的内在问题的重要性。在调查具有多基因基础的性状时，现有技术的方法中的错误变得特别成问题。
如此，在一个实施方案中，本发明致力于以确定性单元型的形式提供遗传信息的方法。如本文中所使用的，术语“确定性单元型”意图指在归结单元型时只考虑严格顺式状态关联。本文所述方法不涉及任何估计或推论，两处多态性是否存在于同一DNA分子上。这不同于上文所述现有技术的“推断单元型”，它是通过对二倍体材料询问序列信息(像在HapMap项目中实施的)获得的，完全不关注状态。
且不说推论的问题，在未能特异性扩增较大等位基因的情况中，无差别地使用二倍体细胞引入了因短等位基因优势而引起的进一步复杂化(“等位基因失落”)(allele dropout)。如此，较大等位基因的存在被完全忽略，而产生错误的单元型信息。
通过对父本衍生DNA和/或母本衍生DNA选择性分析序列信息，在本方法中提供了测定单元型时对严格顺式状态关联的保证。
所述原位方法可以在受试者的基因组或其部分上实施。如本文中所使用的，术语“基因组”指受试者的全体遗传材料，而且包括受试者的全套DNA序列。提到基因组“其部分”指来自受试者基因组的一部分核酸(诸如DNA)。
可以自含有核酸的任何细胞或生物学样品获得基因组或其部分。在自二倍体细胞获得基因组的情况中，可以通过添加本领域技术人员公知的诱导剂(诸如秋水仙酰胺)将细胞诱导入分裂中期。离散的染色体在分裂中期出现，而且能够剥离成单倍组元件组分，如下所述。
所述方法通常在体细胞的常染色体上实施。术语“常染色体”指正常体细胞或生殖细胞内除性染色体以外的任何染色体。例如，在人类中，染色体1-22是常染色体。
如上所述，由于在临床中获得这些性细胞的问题，要避免天然单倍体材料(诸如精子细胞或卵子)的使用。在单元型分型中避免配子具有另一项优点，即认为减数分裂过程期间有时有重组事件，使得原来以顺式连锁的基因座变成以反式连锁。如此，分析配子的单元型会给出与自二倍体细胞获得的单元型信息不同的(即不正确)的单元型信息。
如本文中所使用的，术语“原位方法”意图包括不需要自母本衍生DNA物理分离父本衍生DNA或自父本衍生DNA物理分离母本衍生DNA的任何方法。原位方法能够在存在母本衍生DNA的情况中选择性分析父本衍生DNA，反之亦然，从而能测定任两种标志物的状态。在实践中，在本发明的背景中使用的方法可以是任何方法，由此能对DNA分子探查预定的标志物，使得能显示探针与任何给定姐妹染色体对之一或二者结合的发生。这样，所述方法能够证明两种DNA标志物以顺式(在一条染色体上)或以反式(在两条姐妹染色体间拆分)存在，其中所述两条姐妹染色体先前没有物理分离。
原位方法的一项优点是它更易于掺入标准病理学或研究实验室中。例如，需要物理分离父本与母本衍生染色体的方法需要使用昂贵的设备，诸如显微操作器和激光弹射显微镜。相反，原位方法能使用标准设备和技术来执行，诸如荧光显微镜。
技术人员会理解，能够提供状态特异性核苷酸序列信息的原位方法能以多种方式来执行。因而，本发明不限于任何特定技术，而且以下方法只作为例示考虑。
在本发明的一种形式中，所述方法是使用荧光原位杂交(FISH)技术来执行的。FISH指使用经过标记的核酸序列探针来显现有丝分裂染色体制备物上的或分裂间期细胞中的特定DNA或RNA序列。用于标记核酸探针(DNA或RNA)的一种方法是酶促的，经由随机引发或缺刻翻译掺入偶联有荧光分子或免疫原性半抗原的核苷酸类似物。直接化学标记也能提供在本发明背景中有用的探针。最近，已经开发了肽核酸(PNA)分子，而且它们也能充当有用的探针。
杂交靶物可以是RNA或变性的单链DNA。一旦给予探针足够时间来退火至其互补靶序列，就洗掉过量的探针分子，并用荧光显微镜显现杂交样式。值得注意的是，半抗原标记的探针要求用荧光偶联抗体来检测。已经开发了信号放大技术(诸如酪酰胺(tyramides)或滚环扩增的使用)来提高先前用传统办法检测不到的、自小DNA靶物衍生的信号强度。
用于FISH技术的探针可以是寡核苷酸、质粒、PNA、粘粒、YAC、BAC或文库探针。在一个实施方案中，探针是PNA。用于PNA-FISH的方法披露于Strauss 2002(″PNA-FISH″in FISH Technology.Rautenstrauss/Liehr Eds.Springer Verlag.Heidelberg)。
从技术上说，理想的探针(尤其是用于分裂间期FISH的)应当给出强烈的、特异性的信号，背景很少或没有背景，而且应当具有大于约90％的高杂交效率。优选的是，使用针对SNP检测的探针。
用于执行FISH技术的标准方法是本领域已知的。一种基本的FISH方法可包括以下步骤：
载玻片制备
1)用70％乙醇清洁载玻片(以清除任何油脂或灰尘)；
2)放置几滴沉淀物并让载玻片风干；
3)将载玻片在90℃温箱中放置1.5小时以成熟，或37℃过夜。
载玻片处理
1)在温箱中1.5小时后，让载玻片冷却，然后添加150-200μl 0.005％胃蛋白酶/0.001M HCl，并将它们于37℃放置15分钟；
2)在装有PBS 1x的科普林缸中放置5分钟；
3)在后固定清洗液中放置5分钟；
4)在低聚甲醛/PBS清洗液中放置5分钟；
5)在PBS 1x中放置5分钟；
6)在乙醇系列每一项中放置5分钟：70％，90％，100％(可以将载玻片留在100％乙醇中，直至准备好要杂交)；
7)与探针杂交前，取出载玻片并让其完全风干。
通过缺刻翻译进行的探针直接标记
10ul DNA
3ul缓冲液10X
0.6ul dAGC(用于dUTP/CY-3，红色)或1.8ul dAGT(用于FluorX-dCTP，绿色)
0.3ul dUTP/CY-3或0.9ul FluorX-dCTP
3ul β-巯基乙醇
0.3ul DNA聚合酶
6ul DNA酶(1∶700ul H2O)
H2O至达到30ul终体积
1)用酶和DNA制备标记混合物后，将其在16℃水浴中放置2小时；
2)2小时后，为了沉淀探针，取适宜数量的经过标记的探针并将其放置在新的eppendorf中(比如30ul)；
3)向经过标记的探针添加：
3μl鲑鱼精DNA(SSD)
10μl Cot-1DNA(10μl Cot每30μl经过标记的DNA，对于粘粒，添加15μl)
1/10体积NaAC
3倍体积冷的EtOH 100％
沉淀
1)为了沉淀，将eppendorf于-80℃放置15分钟，或于-20℃放置至少30分钟；
2)于+4℃离心20分钟；
3)取走上清液并让沉淀物干燥；
4)将沉淀物重悬于杂交混合液中；
5)于室温在热混合仪中放置10分钟以混合；
6)将探针放置在干燥后的载玻片上；
7)放置盖玻片并用橡胶泥密封；
8)将载玻片放置在Hybrite(Vysis)中并开始循环。
Hybrite温度：解链：69℃2分钟
(人类载玻片)杂交：37℃过夜
共杂交
将两种探针用不同荧光染料标记并杂交到同一载玻片上：CY3-dUTP(红色)和FluorX-dCTP(绿色)。它们能容易地使用，因为它们都是直接标记的探针。
分别标记每种探针，然后将它们混合到一起并沉淀。
例子：30ul经过标记的探针A加30ul经过标记的探针B加3ul SSD加(10ul加10ul)20ul Cot-1DNA加8.3ul NaAc加270ul EtOH。
杂交后清洗
·于57℃在0.1x SSC中清洗3次，每次5分钟
·在DAPI(60ml 2x SSC、120ul DAPI)中5分钟
·在盖玻片上添加几滴不变色DABCO并确保在载玻片与盖玻片之间没有气泡
分析
用LEICA DMRXA荧光显微镜分析。可以使用应用光谱成像(ASI)照相机获取图像，并用FISH view 2.0版软件分析。
技术人员会能够为任何具体应用修改上述方案。
在本发明的背景中，可以使用针对染色体上两种标志物(例如两处SNP)的FISH探针来染色来自受试者常染色体细胞的分裂中期涂片。可能发现记录到如下的一种表型，其中两种标志物存在于单一染色体上(顺式)，或存在于两条姐妹染色体间(反式)。使用荧光显微镜检术，鉴定两条相关姐妹染色体。如果两种探针结合单一染色体，那么标志物以顺式存在。如果它们结合不同染色体(一个父本、一个母本)，那么标志物以反式存在。自此例会注意到，不必知道哪种标志物在哪条染色体上。仅仅需要判定它们是存在于单一染色体上(不管该染色体是父本衍生的还是母本衍生的)还是分布在两条姐妹染色体间(即一个父本、一个母本)。
FISH方法还可在用于高通量加工的微阵列平台的背景中使用。DNA微阵列容许同时分析数以千计样品。
另一种适合于执行本方法的原位技术是引发原位标记。此技术是FISH的替代方法，而且基本上是单轮PCR反应，需要单一特异性引物和经过标记的dUTP/dNTP溶液。典型的是，PRINS技术使用一种特异性引物、含Dig-11-dUTP的dNTP和DNA聚合酶在染色体制备物上实施引物延伸反应。PRINS反应试剂盒可得自Boehringer Mannheim。下文描述了一种例示性方案。
反应混合物
10x标记缓冲液-3.0μl
10x反应溶液-3.0μl
引物-60-200pmol
Taq DNA聚合酶-3.0μl(3u)
ddH2O-至30μl
将反应混合物应用至载玻片制品并盖上盖玻片，用橡胶泥密封。橡胶泥干燥后，将载玻片放置在PCR块(a Hybaid Omni Gene in-situ Block)上。
引物延伸
通过一轮93℃5分钟(以使染色体DNA变性)继以61℃30分钟(用于引物退火和延伸)，发生引物延伸。
信号检测
小心清除橡胶泥和盖玻片，并通过用50mM NaCl、50mM EDTA于60℃温和淹没载玻片3分钟来终止延伸反应。信号检测遵循Hirai，H.and LoVerde，P.T.(1995)“FISH techniques for constructing physical maps on SchistosomeChromosomes”.Parasitology Today 11(8)，310-314的技术。简言之：
1)在50ml BN缓冲液(0.1M碳酸氢钠、0.1％Nonidet P-40)中浸泡10分钟；
2)在50ml封闭缓冲液(含5％脱脂奶的BN缓冲液)中浸泡10分钟；
3)在50ml抗洋地黄毒苷-荧光素偶联物(Boehringer Mannheim)(800ng，在封闭缓冲液中)中浸泡并在黑暗中于37℃温育30分钟；
4)在摇床上于室温用过量的BN缓冲液清洗以清除未结合的偶联物；
5)在20μl含有碘化丙啶(30ng/ml)和DAPI(30ng/ml)的不变色溶液中封固以复染染色体；
6)盖上盖玻片，清除过量的封固剂并观察。
要理解，如本文中所使用的，术语“核苷酸序列信息”意图包括涉及染色体上两种或更多种标志物的信息。标志物可以是单个核苷酸(例如SNP)、或多个连续核苷酸、或多个不连续核苷酸。
提到“获得序列信息”意图包括熟练技术人员知道的、用于测定核酸分子的核苷酸序列的任何原位方法。如本文中所使用的，术语“核酸”涵盖双链核酸分子的任一条链或两条链，而且包括完整核酸分子的任何片段或部分。包括DNA和RNA二者。例如，可以通过信息寡核苷酸探针的结合(或结合的缺失)来获得序列信息。获得序列信息通常涉及SNP的鉴定，而且技术人员会能够设计能够检测任何SNP的探针。典型的是，探针的长度会是25个核苷酸左右，其中多态性位点设计成与探针的中央杂交。
可以自实际上任何组织来源(除了纯红血球)获得DNA。例如，方便的组织样品包括全血、精液、唾液、泪液、尿液、粪便材料、汗液、口腔、皮肤和毛发。
在本发明的背景中可使用涉及DNA扩增(诸如PCR)的方法。例如，可以使用对母本衍生DNA或父本衍生DNA特异性的引物来选择性扩增姐妹染色体对任一或二者的区域。然后对PCR产物测序，用以提供该区域上的信息，了解该信息可归于母本还是父本染色体。
可以通过熟练技术人员知道的任何合适方法来制备供分析用的DNA，包括使用适宜引物进行的PCR。在希望分析整个基因组的情况中，可以使用全基因组扩增(WGA)的方法。例如，可以处理分裂后期细胞，从而能够显性两个单倍组，其后可执行WGA。用于实施此方法的商业性试剂盒是易于获得的，包括由Sigma-Aldrich Corp.(St Louis，MO，USA)制造的完全WGA试剂盒。此试剂盒基于基因组变成一系列模板的随机断裂。所得较短DNA链生成具有限定3’和5’末端的DNA片段的文库。在初始阶段使用线性等温扩增来复制该文库，接着是有限轮数的几何(PCR)扩增。
许多策略可用于进行对DNA的PCR扩增。这些包括由Klein et al(PNAS96(8)：4494-4499，Apr.13，1999)记载的方法，其提供(1)完全的、无偏的、全基因组扩增，和(2)能够扩增数十至数百基因座的前景。
mRNA样品也常常进行扩增。在此情况中，扩增之前通常有逆转录。对所有表达的mRNA的扩增可以如WO 96/14839和WO 97/01603所述来实施。如果作为样品来源的受试者在所表达的mRNA内发生的多态性位点处是杂合的，那么对来自二倍体样品的RNA样品的扩增能生成两种靶分子。
一种鉴定核苷酸多态性的便利方法是通过使用微阵列技术。本发明的这种形式的一个例示性实施方案见于由销售的技术。此技术依赖于光刻工艺，即用光敏感的化学化合物包被5″x 5″石英晶片以防止晶片与所创建DNA探针第一核苷酸之间的偶联。使用光刻掩模来阻断或传递光到晶片表面的特定位置。然后用含有腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、或鸟嘌呤任一的溶液淹没表面，而且只在玻璃上已经经由光照脱保护的那些区域发生偶联。所偶联的核苷酸还携带光敏感的保护基团，所以能重复该循环。许多公司提供了固定化探针的其它方法，包括Oxford Gene Technology(Oxford，U.K.)、Agilent Technologies(Palo Alto，CA，U.S.A.)和Nimblegen Systems Inc.(Madison，WI，U.S.A)。
可以将设计用来提供受试者两个单元型的信息的探针掺合到单一微阵列芯片上。负责提供父本衍生的单元型信息的探针可以用一种类型的荧光标签标记，而负责提供母本衍生的单元型信息的探针可以用不同标签标记。
在本发明的一种形式中，所述两处或多处多态性是编码序列等位基因的一部分。通过证明过度等位基因共享，本方法可用于显示基因与性状之间的关联。在本发明的语境中，术语“等位基因”用于指与编码区有关联的遗传变异，而且包括给定基因的可变形式。如本文中所使用的，术语“等位基因共享”指一组个体中存在(或共享)的基因的等位基因的概念。使用技术人员可得的多种统计软件包之任一，能找到等位基因共享的存在和程度。编码序列等位基因的使用不同于非编码序列变体(例如SNP和STR)用于间接指示编码单元型的HapMap使用。这种通过HapMap进行的间接办法具有状态、连锁不平衡、单元型块长度、和群体单元型多样性的SNP代表性的内在不确定性。
本方法还揭示了至今未知水平的关于等位基因的复杂性。如本文其它地方所述，鉴于重组事件能分配下述区域，使得任何两个区域可以以顺式或以反式存在，任何两个染色体区域的状态都是重要的。如此，申请人预测反式等位基因的存在，由此一条染色体上存在的等位基因实际上是杂合等位基因，其中一个区域来自父亲，而另一个区域来自母亲。本领域尚未认识到此类反式等位基因的存在，而且此类反式等位基因可提供关于等位基因生成的洞察或导致新等位基因的发现或预测新等位基因的方法。
状态的重要性还延伸至基因调控区(即5′上游和3′下游序列)。可预测重组事件会导致来自一亲本的5′调控区与来自另一亲本的3′调控区并置。此调控区重新分配的实际结果可以是在那些区控制下的基因的表达受到显著影响。
在另一个方面，本发明提供了对父本衍生DNA和母本衍生DNA的选择性分析，以确定受试者的确定性单元型。
在另一个方面，本发明提供了用于鉴定涉及多基因疾病或性状的基因的方法，该方法包括本文所述方法的使用。假设用现有方法基于推论进行单元型分型，完全调查任何给定基因在多基因疾病或性状中的作用是非常困难的，如果不是不可能的话。如本文所述提供确定性单元型消除了使关于多基因系统中单基因参与的阐述变得混淆的不确定性。
对熟练技术人员显而易见的是，本发明会具有许多用途。在一个实施方案中，本发明提供了本文所述方法用于鉴定涉及单基因疾病或表型的基因的用途。又一个实施方案提供了本文所述方法用于鉴定涉及多基因疾病或表型的基因的用途。提供确定性单元型还会容许在组织移植中更接近地匹配供体与受体。
本发明能应用于任何受试者。受试者可以是人、马、牛、山羊、绵羊、犬、猫、或猪。技术人员会理解，生物体(诸如植物)也会是合适的。一些生物体是多倍体(例如一些植物和甲壳类)，而且鉴于所涉及的、使之混淆的问题，即每个细胞存在三条或更多条同源染色体，本发明具有甚至更大的优点。
在又一个方面，本发明提供了本文所述方法在鉴定涉及药物反应的基因中的用途。药物基因组学指个体的遗传继承如何影响身体对药物的响应的研究。药物基因组学的基础在于可以为个体特制药物，使得药物适应个体自身遗传组成。环境、饮食、年龄、生活方式、和健康状态都能影响个人对药物的响应，但是理解个体的遗传组成被认为是创建具有更大功效和安全性的个人化药物的关键。
使用本发明，能基于与基因和疾病有关联的蛋白质、酶、和RNA分子创建药物。这会推动药物发现并容许研究人员制定更加靶向特定疾病的疗法。此准确度不仅会使治疗效果最大化，而且还会降低对附近健康细胞的损害。
替代匹配患者与正确药物的标准尝试错误方法，临床医师会能够分析患者的遗传谱型并自治疗开始就开出最好的可得的药物疗法。这不仅会排除为患者鉴定正确药物中的猜测，而且会加快恢复时间并提高安全性，因为不利反应的可能性可被消除。药物基因组学有潜力显著降低作为不利药物反应在美国每年发生的估计100,000例死亡和2,000,000例住院。
实施本发明的一项结果可以是确定适宜药物剂量的更精确方法。剂量基于体重和年龄的当前方法会被基于患者遗传学的剂量所取代。例如，精确的遗传谱型能提供关于身体如何好地代谢药物及因此代谢药物所需要的时间的指标。这会使治疗的价值最大化，并降低过剂量的可能性。
实施本发明的另一项结果可以是筛选疾病的改良方法。知道个体的遗传谱型就能够鉴定一种或多种疾病易感性。关于易感性的知识能容许个人尽早采取适当的生活方式和环境改变以避免或减轻遗传病的严重性。类似的，关于特定疾病易感性的预先知识会容许仔细监测个体，而且能在最适当的阶段引入治疗以使疗法最佳化。
实施本发明的又一项结果可以是改良疫苗。由遗传材料(DNA或RNA)制成的疫苗保证了现有疫苗的好处且没有所有风险。遗传疫苗会激活免疫系统但不会有能力引起感染。它们会是便宜的、稳定的、易于贮藏的、且能够改造成同时携带多株病原体。
本发明还可用于改善药物发现和批准过程。使用基因组靶物，制药公司会能够更容易地发现潜在疗法。可以恢复先前失败的药物候选，因为它们匹配它们所服务的生态位群体。药物批准过程应当得到推动，因为试验靶向特定遗传群体组，提供更大程度的成功。通过只靶向那些能够响应药物的个人，会降低临床试验的花费和风险。
如此，本发明提供的精确遗传信息可导致不利药物反应的数目减少、失败药物试验的数目减少、实现药物管理机构批准花费的时间缩短、患者服药的时间缩短、为了鉴定有效疗法患者必须服用的药物的数目减少、疾病对身体的影响减轻(经由早期检测)、及可能的药物靶物的范围扩大。这些优点可导致卫生保健的花费净减少。
如上所述，本发明的方法在鉴定一种或多种使得个体对疾病易感的基因中也是有用的。多基因疾病尤其如此，诸如糖尿病。例如，已经发现一种重大糖尿病易感性基因能使得具有缺陷拷贝的人发生2型糖尿病的可能性高3倍。已知钙蛋白酶-10(一种蛋白酶)的基因中的SNP与2型糖尿病有关联。在对该病易感的墨西哥裔美国人中证明了该关联。对来自此群体的DNA样品测序并对序列实施统计分析，发现这些墨西哥裔美国人具有胰岛素耐受且显示降低的钙蛋白酶-10基因表达水平。本发明会容许更简单地检测基因/疾病关联，而且会促进其它遗传上复杂的病症(诸如哮喘、精神分裂症和阿尔茨海默氏病)的遗传基础的鉴定。
在另一个方面，本发明提供了所述方法用于为药物或基因疗法鉴定基因靶(或蛋白质靶)的用途。通过实践本发明获得的、关于疾病遗传基础的知识会为药物设计和基因疗法提供有效的靶物。例如，若一种或多种基因被鉴定为与疾病有关联，则可以抑制或增强该基因的活性以提供治疗性结果。或者，该基因的蛋白质产物可形成针对能结合该蛋白质并调控该蛋白质的活性的实体的筛选测定法的基础。此外，若能够生成蛋白质的三维结构，则可发起理性药物设计。
在另一个方面，本发明提供了本文所述方法用于鉴定具有疾病素因(predisposition)的个体的用途。一旦使用本方法将一种基因鉴定为与特定疾病有关联，那么技术人员会能够设计测定法来筛选该基因的缺陷形式。对有风险发生某些疾病的个人的鉴定会容许发起预防性措施，诸如药物疗法和生活方式改变。
在又一个方面，本发明提供了所述方法用于鉴定具有响应环境刺激的素因的个体的用途。此用途的一个例子可以是鉴定具有针对各种物质的变态反应的个人。在一些个体中，对变应原(例如花生或蜂毒中的)的响应可导致潜在致命的过敏性反应。对尤其敏感的个体的鉴定会容许发起脱敏规程。
最后，要理解，可以在不背离本文所述发明的精神的情况中进行各种其它改良和/或改变。
未来可以在澳大利亚或海外提交新的专利申请，其以本申请为基础或要求本申请的优先权。要理解，所附临时权利要求仅仅作为举例而提供，而非意图限制在任何此类未来申请中可能要求保护的范围。可以后来相对于临时权利要求添加或省略特征以便进一步限定或重新限定一项或多项发明。

Claims (6)

1.一种用于自生物学样品获得单核苷酸多态性遗传信息用于非疾病诊断目的的体外/原位方法，其中所述生物学样品含有自二倍体细胞获得的中期染色体，且其中该方法包括下列步骤：a)使多种等位基因特异性探针杂交至所述中期染色体，其中至少一种所述多种等位基因特异性探针包含单核苷酸多态性；b)鉴定任两种等位基因特异性探针是以顺式结合于一条染色体上还是以反式结合于两条姐妹染色体间，使得能够确定任两种等位基因特异性探针的状态；并c)自任两种等位基因特异性探针的状态获得遗传信息；由此获得的遗传信息是核苷酸序列信息。
2.依照权利要求1的方法，其中所述中期染色体是自体细胞获得的。
3.依照权利要求1的方法，其中至少一种所述多种等位基因特异性探针检测单核苷酸多态性的存在或缺失。
4.依照权利要求1-3任一项的方法，其中所述核苷酸序列信息提供等位基因信息。
5.依照权利要求4的方法，其中所述等位基因信息涉及编码区等位基因。
6.权利要求1的方法，该方法包括下列步骤：a)自二倍体细胞获得中期染色体；b)自所述中期染色体剥离单倍体元件；c)使多种等位基因特异性探针杂交至所述单倍体元件，其中至少一种所述多种等位基因特异性探针包含单核苷酸多态性；d)鉴定任两种等位基因特异性探针是以顺式结合于一个单倍体元件上还是以反式结合于自姐妹中期染色体获得的两个单倍体元件间，使得能够确定任两种等位基因特异性探针的状态；并e)自任两种等位基因特异性探针的状态获得遗传信息。
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