CN105765077A

CN105765077A - 测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症风险的检测方法以及测定用试剂盒

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Publication number: CN105765077A
Application number: CN201480050278.8A
Authority: CN
Inventors: 松田文彦; 寺尾知可史; 赤水尚史; 吉村弘; 宫内昭
Original assignee: Kuma Hospital Shinkokai Medical Corp; Rouichi Ito; Kyoto University; Toyo Kohan Co Ltd; Wakayama Medical University
Current assignee: Kuma Hospital Shinkokai Medical Corp; Rouichi Ito; Kyoto University; Toyo Kohan Co Ltd; Wakayama Medical University
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2034-09-11
Also published as: US20160222453A1; EP3045541A4; EP3045541A1; JPWO2015037681A1; CN105765077B; JP6516128B2; WO2015037681A1; US20190316199A1

Abstract

本发明提供了测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检验方法和测定用试剂盒。更具体地，本发明提供了测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检测方法，包括：检测对于抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症敏感的多态性、测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险，以及测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症风险的试剂盒，这种试剂盒包含能够检测对于抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症敏感的多态性的多核苷酸。

Description

测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症风险的检测方法以及测定用试剂盒

技术领域

本发明涉及测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检验方法和测定用试剂盒。更具体地，本发明涉及测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检测方法，包括：检验对于抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症敏感的多态性、测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险，以及测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症风险的试剂盒，这种试剂盒包含能够检测对于抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症敏感的多态性的多核苷酸。

背景技术

甲状腺机能亢进是从甲状腺中大量分泌甲状腺激素所引起的疾病，并且大部分这种疾病由格雷夫斯氏病(Graves'disease)所引起。格雷夫斯氏病是由促甲状腺激素受体的自体抗体(TSH受体抗体∶TRAb)无限制地刺激甲状腺所引起的自身免疫疾病，并且特征为多在女性中出现。

目前，甲状腺机能亢进的治疗方法主要分为三种方法∶药物疗法、放射性同位素治疗和手术治疗。通常，治疗从使用抗甲状腺药物的药物疗法开始。抗甲状腺药物是抑制甲状腺激素合成的药物，并且从给药开始，甲状腺激素的血液浓度通常在几个月内恢复正常。然而，在格雷夫斯氏病的情况下，例如，即使甲状腺激素的血液浓度变得正常，只要作为原因的TRAb是阳性，还需要继续使用抗甲状腺药物。因此，在很多情况下，需要长期治疗。

作为抗甲状腺药物的一种严重的副作用，粒细胞缺乏症是已知的副作用。粒细胞缺乏症是指与粒细胞明显减少(不超过500/μL，或不超过100、200)相关的病症，在针对外来抗原(例如，细菌、病毒等等)产生免疫反应的白细胞中粒细胞显示出非特异性的杀菌作用。大约70％的粒细胞缺乏症患者被认为由于药物(例如，抗甲状腺药物，例如，甲巯咪唑，等等)而形成粒细胞缺乏症。

抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的发病频率大约为在300个人中一个，不是很高。然而，一旦感染上这种疾病，血液中的粒细胞的数目显著降低，随后形成易感染状态，在这种状态下，由于严重的感染，可能出现致命性的病变。事实上，目前，每年已经报道了一些致命的病例。为此，当给予患者抗甲状腺药物时，考虑到由此产生的严重的副作用，即使粒细胞缺乏症的发病频率很低，在给予药物的时候，医生应该周期性和详细地监测患者的白细胞数目和粒细胞数目。这对医生和患者造成过度的负担，尤其需要长期治疗的时候。

而且，通常，粒细胞缺乏症的自察症状几乎不会在粒细胞开始减少的时点出现。为此，在很多情况下，当诊断出疾病时，感染已经发展了，在这样的情况下，停止给予抗甲状腺药物，暂停甲状腺机能亢进的治疗，并且进行合适的感染治疗。因此，患者遇到双重困难。

根据上述理由，需要能够预测抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的发病风险的检测方法，并且已经表明老年人、女性、患有肾脏机能减退的人等等可能是高风险人群。如上所述，由于抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的发病频率低，并且病例积累非常难，所以，还没有获得建立可能性的充分可靠的结果。

作为人的主要组织相容性复合体(MHC)的人类白细胞抗原(HLA)，是大约3.6Mb的庞大的复合基因域，并且存在于人的染色体6的短臂的6p21.3域。该域包含与免疫反应有关的许多蛋白的遗传信息。

从染色体的端粒端至着丝粒端，HLA域主要分为：(1)调控HLA-A、B、C抗原系统等等的I类域，(2)调控补体成分等等的III类域，和(3)调控HLA-DP、DQ、DR抗原系统等等的II类域。

在功能性的基因之中，HLA基因显现出最高的多态性，例如，可以通过比较患者人群和健康对照人群之间的HLA等位基因频率来检验疾病敏感性基因在HLA域中的存在。利用关联分析，当在特定HLA等位基因与疾病之间出现显著关联时，HLA等位基因本身可以测定疾病易患性，或与HLA等位基因连锁不平衡时，HLA域中的不同基因可以测定疾病易患性。

到目前为止，通过病例对照研究已经阐明，在特定疾病的患者人群中，特定HLA等位基因显著地提高或降低，并且存在许多涉及免疫相关的疾病的报道。

对于抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症，也进行了基于比较HLA等位基因的基因分析，并且已经报道了日本人中HLA-DRB1*08:03:02与抗甲状腺药物甲巯咪唑诱导的粒细胞缺乏症有关(非专利文献1)。然而，研究所使用的患者样本的数量只有24个，并且靶基因限于HLAII类基因。为此，还不清楚HLA-DRB1*08:03:02是否是甲巯咪唑诱导的粒细胞缺乏症的疾病敏感性基因，需要重新验证结果。事实上，还没有进行临床应用。

近年来，全基因组关联分析(GWAS)已经积极地用作分析疾病的形成基因的方法。GWAS是鉴定与特定疾病相关的基因的方法，这种方法综合分析感染疾病的患者在全部基因组中所具有的SNP，使用人类基因组中所存在的单核苷酸多态性(SNP)作为指标。

然而，直到目前为止，对于药物诱导的粒细胞缺乏症没有进行GWAS，并且没有形成能够测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的有用的临床检验方法。

[文献列表]

[非专利文献]

非专利文献1∶TamaiH等人，AnnInternMed.,124(5):490-494(1996)

本发明概述

本发明要解决的问题

本发明的一个目标是提供简便并且高度精确地测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检验方法和测定用试剂盒。

解决问题的方法

考虑到上述目标，本发明人与日本的代表性的甲状腺专科医院的两个研究室合作，收集了115个抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症患者的样本，这些样本具有严格和详细的临床上的信息，并且通过使用人类SNP阵列(array)，GWAS的病例对照研究，调查了与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症相关的遗传因子。

具体地说，使用存在于基因组中的2,635,435个位点上的SNP作为标志物，将115个患者样本分型。作为对照组，使用从基于社区的基因组处收集的普通日本人的DNA样本(1,798个样本)的分型信息，并且进行病例对照研究，包括比较每个SNP的基因分型频率。

结果，在人染色体6的短臂6p21.3上的人类HLA域中，鉴定了与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症非常强烈关联的191个SNP。它们主要分为总共4个域，包括I类域中的2个域((HLA-A域的上游侧和HLA-B域周围)、II类域中的2个域(HLA-DR域周围的2个域)。这些当中，HLA-DR域周围获得最强的关联(最强烈关联的多态性∶rs6457580)，然后是HLA-B域周围(最强烈关联的多态性∶rs41560220)。在各个域中，显示出显著差异的许多SNP是强烈连锁不平衡的。由于在4个域之中没有发现相互的连锁不平衡，所以，它们是独立的域。

由于上面获得的多态性标志物都存在于HLA基因域中，所以，抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症可能与HLA基因本身相关。为此，靶向限制于表现出非常强烈关联的HLA-DR域和HLA-B域周围，并且使用患者样本，进行HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DPB1和HLA-DQB1基因的基因分型。结果，HLA-B*39:01和HLA-B*38:02以及HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03和HLA-DRB1*08:02的HLA等位基因与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症有关。另外，HLA-B*39:01和HLA-B*38:02是与rs41560220连锁不平衡的，HLA-DRB1*08:03和HLA-DRB1*08:02是与rs6457580连锁不平衡的。

在HLA-B和HLA-DRB1基因这两者中，由于多个等位基因与粒细胞缺乏症相关联，所以，认为在这些敏感性HLA等位基因中可能存在重要的氨基酸残基。由此，使用HLA氨基酸序列的对比，实施了创建多因素逻辑回归分析(multiplelogisticregressionanalysis)。结果，HLA-B蛋白的116位的苯丙氨酸残基(B-Phe116)和HLA-DRB1蛋白的74位的亮氨酸残基(DRB1-Leu74)强烈地与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症相关。另外发现，HLA-B蛋白的158位丙氨酸残基的不存在与B-Phe116的存在是连锁不平衡的(r²＝0.92)。

基于这些发现，本发明人进行了进一步的研究，并且测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险可以通过检验这些多态性来进行测定，从而完成本发明。

相应地，本发明涉及下列内容。

[1]检测抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检测方法，包括

(1)使用来源于检测对象的样本，检验HLA域存在的多态性的步骤，多态性选自下列中的至少之一：

A)SEQIDNO∶1中所示的核苷酸序列的第501个核苷酸的多态性(G>T*)，

B)SEQIDNO∶2中所示的核苷酸序列的第201个核苷酸的多态性(C>T*)，

C)SEQIDNO∶3中所示的核苷酸序列的第501个核苷酸的多态性(C>T*)，

D)SEQIDNO∶4中所示的核苷酸序列的第501个核苷酸的多态性(T*>G)，

E)SEQIDNO∶5中所示的核苷酸序列的第501个核苷酸的多态性(C>T*)，

其中，括号表示参考等位基因>变体等位基因，*是危险等位基因，G、A、T和C分别是鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，和

F)与上述A)-E)的任一项的多态性连锁不平衡的多态性，所述连锁不平衡表示连锁不平衡系数D'不小于0.8，和

(2)基于(1)的检测结果来测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的步骤；

[2]上述[1]的检测方法，包括下列步骤：检验上述A)的多态性，或在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与所述多态性连锁不平衡时的多态性，和/或，B)的多态性，或在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与所述多态性连锁不平衡时的多态性；

[3]上述[2]的检测方法，其中，在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性是在编码HLA-DRB1*08:03或HLA-DRB1*08:02的74位的氨基酸的位置的多态性，在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性是在编码HLA-B*39:01或HLA-B*38:02的116位或158位的氨基酸的位置的多态性；

[4]上述[1]-[3]的任一项的检测方法，其中，来源于检测对象的样本包含基因组DNA；

[5]上述[1]-[4]的任一项的检测方法，其中，检测对象是东亚人(easternAsian)；

[6]用于检测抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的试剂盒，其包括：能够检测存在于HLA域的多态性中的危险等位基因的多核苷酸，多态性选自下列中的至少之一：

F)与上述A)-E)的任一项的多态性连锁不平衡的多态性，所述连锁不平衡表示连锁不平衡系数D'不小于0.8；

[7]上述[6]的试剂盒，其包括能够检测下列多态性的危险等位基因的多核苷酸：上述A)的多态性，或连锁不平衡系数D'不小于0.8时的与所述多态性连锁不平衡时的多态性，和/或，B)的多态性，或在连锁不平衡系数D'不小于0.8时的与所述多态性连锁不平衡时的多态性；

[8]上述[7]的试剂盒，其中，在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性是在编码HLA-DRB1*08:03或HLA-DRB1*08:02的74位的氨基酸的位置的多态性，在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性是在编码HLA-B*39:01或HLA-B*38:02的116位或158位的氨基酸的位置的多态性；

[9]上述[6]-[8]的试剂盒，进一步包括能够检测非危险等位基因的多核苷酸；

[10]上述[6]-[9]的任一项的试剂盒，其中，能够检测危险等位基因的上述多核苷酸是能够与包含所述等位基因的10-200个连续核苷酸序列或其互补链序列的片段在严格条件下杂交的探针，和/或，能够扩增所述片段的引物；

[11]上述[6]-[10]的任一项的试剂盒，其用于测定东亚人的抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险；

[12]测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的试验方法，包括

(1)使用来源于检测对象的样本和检验下列(a)和/或(b)的步骤∶

(a)在HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是否是Leu

(b)在HLA-B蛋白的116位的氨基酸是否是Phe，或在HLA-B蛋白的158位的氨基酸是否是Ala，和

(2)基于(1)的试验结果来测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的步骤；

[13]测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的试剂盒，其包括：能够鉴定下列(a)和/或(b)的物质∶

(a)在HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是Leu

(b)在HLA-B蛋白的116位的氨基酸是Phe，或在HLA-B蛋白的158位的氨基酸是Ala。

本发明的效果

按照本发明，可以简便地和高度精确地测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险。为此，在确定具有抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的高风险的患者中，在治疗甲状腺机能亢进的过程中，通过选择不同于药物疗法的治疗方法，可以避免出现非常严重的副作用，并且在确定具有低风险的患者中，可以避免入侵性检验，例如，过度采血，等等。结果，可以安全、可靠和精确治疗甲状腺机能亢进。

附图的简要说明

图1是Manhattan图，表示抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症与染色体上存在的SNP中的SNP的关联性。在纵轴上显示了通过GWAS获得的各个SNP的P值(-log₁₀(P))，在横轴上显示了染色体上的位置。

图2是图1中的HLA域的结果的放大图。

图3是在人染色体6的短臂上的6p21.3域的连锁不平衡(LD)图。

图4是在人染色体6的短臂上的6p21.3域的连锁不平衡(LD)图。

图5是在人染色体6的短臂上的6p21.3域的连锁不平衡(LD)图。

图6显示了相对于4个SNP标志物(rs6457580、rs41560220、rs1736959和rs3135387)的危险等位基因数目的粒细胞缺乏症的比值比(oddsratio)。

图7显示了粒细胞缺乏症与HLA-DRB1和HLA-B蛋白的74位和116位的氨基酸的关联性。

实施方案的说明

在一个实施方案中，本发明提供了测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检测方法，包括

(1)使用来源于检测对象的样本，检验HLA域存在的多态性的步骤，其中，多态性选自下列中的至少之一：

(2)基于(1)的检测结果来测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的步骤(在下文中，还记为本发明的检测方法)。

在本说明书中，对于“抗甲状腺药物”没有特别限制，只要它可以用于治疗甲状腺机能亢进并且可以抑制甲状腺刺激激素的合成即可。优选，它是指硫代酰胺(thionamide)药物，例如，卡比马唑(carbimazole)、甲巯咪唑(methimazole)、丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil)等等，更优选甲巯咪唑或丙基硫氧嘧啶，最优选甲巯咪唑。本文使用的“甲状腺机能亢进”是指从甲状腺中大量分泌甲状腺激素的疾病，其实例包括但不局限于：格雷夫斯氏病、由于有毒物质和辐射所产生的炎症，等等。

在本发明的检测方法中，作为测定靶向的“检测对象”是指甲状腺机能亢进患者，优选格雷夫斯氏病患者，并且是正在或预定服用抗甲状腺药物来治疗或预防疾病的人。同时，对于检测对象的人种没有特别限制，优选东亚人，更优选日本人。

在本发明的检测方法中，优选，作为测定靶向的“来源于检测对象的样本”是包含检测对象的基因组DNA的生物样本。当所检测的多态性存在于位于mRNA中的域(其不同于非转录域例如启动子等、通过RNA剪接除去的域例如内含子等)时，可以使用包含mRNA和总RNA的生物样本来代替基因组DNA。

例如，样本可以是检测对象的生物学组织，具体地说，例如，可以直接使用排泄物，例如，粪便、尿、痰液、唾液等等，体液，例如，血液，等等，口腔粘膜、皮肤的细胞，等等，体毛等等。或者，可以使用通过本领域普通技术人员熟知的方法从检测对象的生物学组织中分离出的基因组DNA。例如，通过苯酚提取方法等等，可以从收集到的人的血液、唾液、皮肤等等中分离出的基因组DNA。在这种状况下，可以使用商购的基因组DNA提取试剂盒和装置。

在本说明书中，“抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险”是指通过给予抗甲状腺药物而形成或加重粒细胞缺乏症的风险，“抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的高风险”是指未来形成或加重粒细胞缺乏症的可能性提高。为此，例如，可以进行本发明的检测方法，在给予抗甲状腺药物之前，测定形成粒细胞缺乏症的风险，或在给予抗甲状腺药物期间，测定加重粒细胞缺乏症的风险。

在本说明书中，“HLA域”是指存在于人染色体6的短臂的6p21.3域上从端粒端上的HCP5P15基因至着丝粒端上的KIFC1基因的大约3.6Mb的全部基因组DNA域，不是指仅基因片段。

在本说明书中，“多态性”是指基因组DNA上的一个或多个核苷酸出现变化(替换、缺失、插入、转移、反转，等等)，其实例包括：用另一个核苷酸替换一个核苷酸(SNP)；一个至几十个核苷酸的缺失或插入(DIP)；在以两个至几十个核苷酸作为一个单元的序列反复存在的部位，其重复次数不同的情况(包含2-4个核苷酸作为重复单元的微卫星多态性，包含几个至几十个核苷酸作为重复单元的可变串联重复序列(VNTR))，等等，优选SNP或DIP。

在本说明书中，例如SNP等多态性中的“参考等位基因”，表示与人类基因组标准序列(称为RefSeq)相同的核苷酸或核苷酸序列，“变体等位基因”表示以多态性形式出现但与RefSeq不同的等位基因。

在本说明书中，例如SNP等多态性的“危险等位基因”是指提高抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的等位基因，“非危险等位基因”是危险等位基因的等位基因。

在本说明书中，通过NCBI[http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/]提供的SNP数据库dbSNP[http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/]中的参考SNPIDNo.来表示单核苷酸多态性(SNP)，核苷酸的位置基于NCBI，GenomeReferenceConsortiumHumanBuild37(GRCh37)。

在本发明中，上述A)的多态性是SEQIDNO∶1所示的核苷酸序列中的第501个核苷酸的多态性，并且是NCBI提供的SNP数据库dbSNP中的IDNo.∶rs6457580表示的SNP。该多态性是基因组序列NC_000006.11中的32393141的核苷酸是G>T(参考等位基因>变体等位基因，下文相同)的SNP。SEQIDNO∶1中所示的核苷酸序列表示在上述SNP的前和后各自500个bp的人染色体6的基因组DNA序列。

通过GWAS(使用人类SNP阵列)的病例对照研究的结果是，与对照组相比，病例组中的T等位基因的等位基因频率显著地提高。本文使用的“显著的”是指卡方检验(chi-squaredtest)或Fisher'精确概率检验中的p值小于5.0×10^-8。为此，T等位基因是抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的危险等位基因。

在本发明中，上述B)的多态性是SEQIDNO∶2所示的核苷酸序列中的第201个核苷酸的多态性，并且是NCBI提供的SNP数据库dbSNP中的IDNo.∶rs41560220表示的SNP。该多态性是基因组序列NC_000006.11中的31323875的核苷酸是C>T(参考等位基因>变体等位基因，下文相同)的SNP。SEQIDNO∶2中所示的核苷酸序列表示在上述SNP的前和后各200个bp的人染色体6的基因组DNA序列。

通过GWAS(使用人类SNP阵列)的病例对照研究的结果是，与对照组相比，病例组中的T等位基因的等位基因频率显著地提高。为此，T等位基因是抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的危险等位基因。

在本发明中，上述C)的多态性是SEQIDNO∶3所示的核苷酸序列中的第501个核苷酸的多态性，并且是NCBI提供的SNP数据库dbSNP中的IDNo.∶rs1736959表示的SNP。该多态性是基因组序列NC_000006.11中的29782470核苷酸是C>T(参考等位基因>变体等位基因，下文相同)的SNP。.SEQIDNO∶3中所示的核苷酸序列表示在上述SNP的前和后各500个bp的人染色体6的基因组DNA序列。

在本发明中，上述D)的多态性是SEQIDNO∶4所示的核苷酸序列中的第501个核苷酸的多态性，并且是NCBI提供的SNP数据库dbSNP中的IDNo.∶rs3135387表示的SNP。该多态性是基因组序列NC_000006.11中的32415109的核苷酸是T>G(参考等位基因>变体等位基因，下文相同)的SNP。SEQIDNO∶4中所示的核苷酸序列表示在上述SNP的前和后各500个bp的人染色体6的基因组DNA序列。.

在本发明中，上述E)的多态性是SEQIDNO∶5所示的核苷酸序列中的第501个核苷酸的多态性，并且是NCBI提供的SNP数据库dbSNP中的IDNo.∶rs17576984表示的SNP。多态性是其中基因组序列NC_000006.11中的32212985核苷酸是C>T(参考等位基因>变体等位基因，下文相同)的SNP。SEQIDNO∶5中所示的核苷酸序列表示在上述SNP的前和后各500个bp的人染色体6的基因组DNA序列。

在本发明中，上述F)的多态性是与上述A)-E)的任一项的多态性连锁不平衡的多态性，其中，所述连锁不平衡表示连锁不平衡系数D'不小于0.8。本文使用的“连锁不平衡系数D'”是通过下列公式获得的：

D’＝(P_ABP_ab-P_AbP_aB)/Min[(P_AB+P_aB)(P_aB+P_ab),(P_AB+P_Ab)(P_Ab+P_ab)]

其中，在两个多态性中，第一个多态性的各等位基因是(A,a)，第二个多态性的各等位基因是(B,b)，4个单元型(AB、Ab、aB、ab)的各自频率分别是P_AB、P_Ab、P_aB、P_ab，Min[(P_AB+P_aB)(P_aB+P_ab)、(P_AB+P_Ab)(P_Ab+P_ab)]是指采用(P_AB+P_aB)(P_aB+P_ab)和(P_AB+P_Ab)(P_Ab+P_ab)中的较小的值。

作为表示连锁不平衡状态的指标，有时使用连锁不平衡系数r²。通过下列公式获得“连锁不平衡系数r²”：

r²＝(P_ABP_ab-P_AbP_aB)²/(P_AB+P_aB)(P_aB+P_ab)(P_AB+P_Ab)(P_Ab+P_ab)

其中，在两个多态性中，第一个多态性的各等位基因是(A,a)，第二个多态性的各等位基因是(B,b)，4个单元型(AB、Ab、aB、ab)的各自频率分别是P_AB、P_Ab、P_aB、P_ab。

与上述A)-E)的任一项的多态性连锁不平衡的上述F)的多态性，可以通过本来已知的方法来鉴定，并且还可以使用HapMap数据库(http∶//www.hapmap.org/index.html.ja)等等来鉴定。也可以通过定序器来分析多个样本DNA的序列，并且探究连锁不平衡状态下的SNP。例如，使用Haploview软件，并且按照本来已知的方法，通过形成LD封闭，可以容易地鉴定上述F)的多态性(图3-5)。

上述F)的多态性的例子包括：与上述A)-E)的任一项的多态性连锁不平衡的多态性，其中，连锁不平衡表示连锁不平衡系数D'至少为0.8，优选至少0.9，更优选至少0.95，进一步优选至少0.99，最优选1(完全连锁)，或连锁不平衡系数r²至少为0.6，优选至少0.8，更优选至少0.9，进一步优选至少0.95，最优选1(完全连锁)。

上述F)的多态性当中，在连锁不平衡系数D'为1(完全连锁)时，与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性包括，例如，rs28362683、rs10947262、rs4959028、rs6930615、rs732162、rs9501626、rs3135392、rs8084、rs2239806、rs7192、rs3129888、rs7195、rs1051336、rs1041885、rs2213586、rs2213585、rs9268832、rs6903608、rs9268877、rs9268880、rs9268979、rs9269110、rs1964995、rs4713555、rs7744001，等等。

上述F)的多态性当中，在连锁不平衡系数D'为1(完全连锁)时，与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性包括，例如，rs2596487，等等。

上述F)的多态性当中，在连锁不平衡系数D'为1(完全连锁)时，与上述C)的多态性连锁不平衡的多态性包括，例如，rs1633041、rs1737041、rs1002046、rs1610644、rs1633011、rs1630969、rs1632988、rs1632987、rs1736971、rs1736969、rs1610663、rs1610699、rs11753629、rs1736957、rs1620173、rs1619379、rs2735028、rs1049033，等等。

上述F)的多态性当中，在连锁不平衡系数D'为1(完全连锁)时，与上述D)的多态性连锁不平衡的多态性包括，例如，rs2395148、rs12524661，等等。

本发明的检测方法包括检测至少一个多态性的步骤，所述多态性选自上述A)-F)(在下文中，也记为本发明的多态性)。在一个实施方案中，检验本发明的多态性的步骤包括：检测本发明的多态性的危险等位基因存在或不存在的步骤。在本发明的另一个实施方案中，检验本发明的多态性的步骤包括：检测本发明的多态性的危险等位基因存在或不存在的步骤，以及检测非危险等位基因存在或不存在的步骤。

本发明的多态性是否包含危险等位基因和/或非危险等位基因，可以通过相关领域已知的任何多态性的分析方法来进行。例如，可以提到的方法包括按照Wallace等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，278-282(1983))的方法进行杂交，通过使用从检测对象的细胞等等中提取的基因组DNA作为样本，以及包含大约15-大约500个核苷酸(包含上述任一项的多态性位点的核苷酸)的连续核苷酸序列的核酸作为探针，同时，精确地控制严格性，仅检测完全与探针互补的序列的方法，以及包括使用混合探针的方法，其中，上述核酸以及其中多态性位点的核苷酸被其他核苷酸替换的核酸中的一者被标记，另一者没有被标记，从变性温度开始，通过逐渐地降低反应温度来杂交，先杂交与一个探针完全互补的序列，防止与不匹配的探针交叉反应的方法，等等。所使用的标记物的例子包括放射性同位素(例如，³²P等等)、酶(例如，β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化酶、苹果酸脱氢酶等等)、荧光物质(例如，荧光胺、异硫氰酸荧光素、Cy3、Cy5等等)、荧光物质(例如，发光氨、发光氨衍生物、莹光素、光泽精等等)，等等。

优选，可以通过各种方法进行多态性的检测，例如，WO03/023063所描述的方法，例如，RFLP方法、PCR-SSCP方法、ASO杂交、直接序列方法、ARMS方法、变性梯度凝胶电泳、RNaseA裂解方法、化学裂解方法、DOL方法、TaqManPCR方法、侵入物方法、MALDI-TOF/MS方法、TDI方法、分子信标方法、动态等位基因-特异性杂交方法、锁式(padlock)探针方法、UCAN方法、使用DNA碎片或DNA微阵列的核酸杂交方法、ECA方法等等(WO03/023063，17页5行-28页20行)。.作为代表性的方法，下面详细说明TaqManPCR方法和侵入物方法。

(1)TaqManPCR方法

TaqManPCR方法使用荧光标记的等位基因特异的寡核苷酸(TaqMan探针)和利用TagDNA聚合酶的PCR。作为TaqMan探针，使用由大约15-大约30个核苷酸(包含上述任一项的多态性位点的核苷酸)的连续核苷酸序列组成的寡核苷酸。在该探针中，用荧光染料(例如FAM、VIC等等)标记5'-端，用淬灭剂(例如，TAMRA等等(消光物质))标记3'-端，在这种状态下，没有检测到荧光，这是由于淬灭剂吸收了荧光能量。为两个等位基因准备好探针，为了一次性检测，优选，用相互不同荧光波长的荧光染料标记(例如，一个等位基因用FAM标记，另一个用VIC标记)。为了防止来自TaqMan探针的PCR延长反应，将3'-端磷酸化。当使用引物(设计成能够扩增含有与TaqMan探针杂交的域的基因组DNA的部分序列)和TagDNA聚合酶进行PCR时，TaqMan探针与模板DNA杂交，同时，出现来自PCR引物的延长反应。但当延长反应进行时，由于TagDNA聚合酶的5'核酸酶活性，杂交的TaqMan探针断裂，释放出荧光染料，没有受到淬灭剂的影响，检测到荧光。由于模板的扩增，荧光强度按指数规律提高。

例如，在检测上述1)的多态性的过程中，当含有多态性位点的核苷酸的等位基因特异的寡核苷酸(大约15-大约30个核苷酸长度；对于G等位基因，5'端用FAM标记，对于T等位基因，5'端用VIC标记，各自的3'-端用TAMRA标记)用作TaqMan探针，检测对象的基因型是GG或TT时，分别观察到具有强烈FAM或VIC的荧光强度，很难观测到另一个荧光。另一方面，当检测对象的基因型是GT时，检测到FAM和VIC两者的荧光。

(2)侵入物方法

与TaqManPCR方法不同，在侵入物方法中，等位基因特异的寡核苷酸(等位基因探针)本身没有被标记，并且在多态性位点的核苷酸的5'-端上具有与模板DNA无互补性的序列(瓣，flap)，在3'-端上具有模板特异性互补序列。在侵入物方法中，使用进一步具有与模板的3'-端特异性互补的序列的寡核苷酸(入侵探针；在探针的5'-端的多态性位点所对应的核苷酸可以是任何核苷酸)，以及FRET(荧光共振能量转移)探针，其中，5'-端具有可能具有发夹结构的序列，当形成发夹结构时，从与5'-端核苷酸配成一对的核苷酸起连续至3'-端的序列是与等位基因探针的瓣互补的序列。FRET探针的5'-端是荧光标记的(例如，FAM、VIC等等)，淬灭剂(例如，TAMRA等等)与其附近结合，在这种状态(发夹结构)下，没有检测到荧光。

当模板基因组DNA与等位基因探针和入侵探针反应时，这三者互补结合，入侵探针的3'-端侵入到多态性位点中。当使用能够识别多态性位点的结构的酶(断裂酶)使等位基因探针的单链部分(即，多态性位点的核苷酸起的5'-端的瓣域)断裂时，所述瓣与FRET探针互补结合，并且瓣的多态性位点入侵到FRET探针的发夹结构中。由于断裂酶识别并且断裂这种结构，所以，标记FRET探针端部的荧光染料释放出来，免于受到淬灭剂的影响，从而检测到荧光。多态性位点的核苷酸与模板不匹配的等位基因探针，没有被断裂酶断裂，由于没有断裂的等位基因探针也可以与FRET探针杂交，所以，同样检测到荧光。然而，由于反应效率不同，与没有匹配的等位基因探针相比较，多态性位点的核苷酸与模板匹配的等位基因探针显著地显现出高荧光强度。

通常，在三种探针和断裂酶反应之前，优选，使用能够使含有等位基因探针和入侵探针杂交的部分的域扩增的引物，通过PCR扩增模板DNA。

基于上述本发明的多态性的检验结果，本发明的检测方法包括测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的步骤。为此，在一个实施方案中，本发明的测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的步骤包括：与不具有危险等位基因的检测对象相比较，当检测对象具有本发明的多态性的危险等位基因时，判定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险高的步骤。

按照本发明的检测方法，例如，当检测对象中的本发明的多态性的基因型对于危险等位基因是纯合子时，与非危险等位基因和危险等位基因的杂合子以及非危险等位基因的纯合子相比较，认为形成或加重抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的频率高。

由此，在另一个实施方案中，本发明的测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的步骤包括：按照检测对象的本发明的多态性的基因型对于危险等位基因是纯合子、对于危险等位基因和非危险等位基因是杂合子以及对于非危险等位基因是纯合子的次序，在检测对象中判定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险高的步骤。

在本发明的检测方法中，当检验的多态性的数量高时，测定精确性也得到提高。为此，优选，检验至少两个选自本发明的多态性的多态性，测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险。例如，检验上述A)和B)的两个多态性，并且当多态性A)和B)的两个基因型对于非危险等位基因都是纯合子时，可以测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险非常低。反之，当多态性A)和B)的基因型对于危险等位基因都是纯合子时，可以测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险非常高。

更具体地是，例如，如下列实施例4所述，当检验D’＝1的与上述B)的多态性完全连锁中的多态性(rs2596487)时，即上述F)的多态性和上述E)的多态性(rs17576984)，可以按照rs2596487/rs17576984评分为2/2、2/1、1/2、1/1、2/0、0/2、1/0、0/1、0/0的基因型的次序，判定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险高，其中，危险等位基因的纯合子是2分，危险等位基因和非危险等位基因的杂合子是1分，非危险等位基因的纯合子是0分。

在本发明的检测方法中，优选，检验上述A)的多态性或B)的多态性，最优选，检测上述A)和B)的两个多态性。在检测本发明的多态性的步骤中，可以仅检测上述F)的至少两个多态性。当检测至少两个多态性时，优选，它们不完全连锁，最优选不是连锁不平衡状态。

在本发明的检测方法的一个优选实施方案中，检验连锁不平衡系数D'至少为0.8时的与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性，和/或，检测连锁不平衡系数D'至少为0.8时的与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性。在连锁不平衡系数D'至少为0.8时，与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性的例子包括与上述A)的多态性完全连锁的多态性，并且尤其优选检测编码HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*08:02的74位氨基酸(即，Leu)的位置的多态性。另一方面，在连锁不平衡系数D'至少为0.8时，与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性的例子包括与上述B)的多态性完全连锁的多态性，等等，并且尤其优选检测编码HLA-B*39:01、HLA-B*38:02的116位氨基酸(即，Phe)或158位氨基酸(即，不是Ala)的位置的多态性。

本发明人进一步发现，HLA-B*39:01、HLA-DRB1*14:03和HLA-DRB1*08:02与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症强烈相关。此外，HLA-B*38:02和HLA-DRB1*08:03也与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症有关。也就是说，当检测对象具有一个或多个选自HLA-B*39:01、HLA-DRB1*14:03、HLA-DRB1*08:02、HLA-B*38:02和HLA-DRB1*08:03的等位基因时，优选，HLA-B*39:01和/或HLA-DRB1*14:03和/或HLA-DRB1*08:02的等位基因，可以判定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险高。为此，例如，与本发明的检测方法组合，可以检测是否检测对象具有一个或多个选自HLA-B*39:01、HLA-DRB1*14:03、HLA-DRB1*08:02、HLA-B*38:02和HLA-DRB1*08:03的等位基因，优选HLA-B*39:01和/或HLA-DRB1*14:03和/或HLA-DRB1*08:02，由此测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险。

对检验是否检测对象具有HLA-B*39:01、HLA-B*38:02、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03或HLA-DRB1*08:02的方法没有特别限制，只要它可以将HLA-B*39:01、HLA-B*38:02、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03或HLA-DRB1*08:02等位基因与其它HLA等位基因区分开即可，例如，可以使用上述多态性检测方法。

在HLA等位基因的分析过程中，可以分析相应的基因序列全体，或可以仅分析一部分基因序列。作为分析HLA等位基因所使用的样本，优选，可以使用与上述“来源于检测对象的样本”相似的样本。

HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03和HLA-DRB1*08:02是伴有HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是Leu的氨基酸替换的多态性，这一点它们是共通的。另一方面，HLA-B*39:01和HLA-B*38:02是伴有HLA-B蛋白的116位的氨基酸是Phe的氨基酸替换的多态性，这一点它们是共通的。本发明人发现，HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是Leu的等位基因(DRB1-Leu74)和HLA-B蛋白的116位的氨基酸是Phe的等位基因(B-Phe116)是抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的危险等位基因。进一步地，B-Phe116与HLA-B蛋白的158位氨基酸不是Ala的多态性是连锁不平衡(r²＝0.92)的关系。

为此，本发明还提供了测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检测方法，包括：

(1)使用来源于检测对象的样本，检验下列(a)和/或(b)的步骤∶

(a)HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是否是Leu

(b)HLA-B蛋白的116位的氨基酸是否是Phe，或HLA-B蛋白的158位的氨基酸是否是Ala，和

(2)基于(1)的检验结果，测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的步骤(在下文中，有时还称为本发明的检测方法(2))。

在本发明的检测方法(2)中，针对的检测对象是指甲状腺机能亢进患者，优选格雷夫斯氏病患者，并且是正在或预定服用抗甲状腺药物来治疗或预防疾病的人。对检测对象的人种没有特别限制，例如，可以是蒙古人、高加索人和黑人(Negroid)中的任何人。

作为检测对象的(a)HLA-DRB1蛋白的74位氨基酸是Leu的等位基因，例子包括上述HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03和HLA-DRB1*08:02，以及其他例如HLA-DRB1*08:09等等。作为检测对象的(b)HLA-B蛋白的116位氨基酸是Phe(158位的氨基酸不是Ala)的等位基因的例子包括上述HLA-B*39:01和HLA-B*38:02，以及其他例如HLA-B*37:01、HLA-B*39:04、HLA-B*67:01等等。由于这些危险等位基因的频率不但在蒙古人中而且在高加索人和黑人中处于不能忽视的水平，所以，不用考虑人种，可以广泛地使用本发明的检测方法(2)。

作为本发明的检测方法(2)的检测对象的“来源于检测对象的样本”，除了含有上述“本发明的检测方法”所描述的检测对象的基因组DNA、mRNA、总RNA的生物样本之外，还可以使用从检测对象处收集的含有HLA-DRB1和/或HLA-B蛋白的样本。也就是说，(a)HLA-DRB1蛋白的74位氨基酸是否是Leu，和/或，(b)HLA-B蛋白的116位氨基酸是否是Phe，或HLA-B蛋白的158位氨基酸是否是Ala，可以使用与部分肽(含有HLA-DRB1蛋白的74位的Leu)特异性结合的抗体或适体来检验，和/或，使用与部分肽(含有HLA-B蛋白的116位的Phe或含有158位的Ala)特异性结合的抗体或适体来检验，利用免疫方法或与其类似的方法，通过检测HLA-DRB1或HLA-B蛋白与抗体或适体的复合体来检验。

作为检验的结果，当(a)HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是Leu和/或(b)HLA-B蛋白的116位的氨基酸是Phe或158位的氨基酸不是Ala时，可以判定检测对象具有抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险高。

在一个实施方案中，本发明提供了测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的试剂盒，其包括能够检测在存在于HLA域中的多态性中的危险等位基因的多核苷酸：

所述多态性选自下列中的至少之一：

A)SEQIDNO∶1所示的核苷酸序列中的第501个核苷酸的多态性(G>T*)，

B)SEQIDNO∶2所示的核苷酸序列中的第201个核苷酸的多态性(C>T*)，

C)SEQIDNO∶3所示的核苷酸序列中的第501个核苷酸的多态性(C>T*)，

D)SEQIDNO∶4所示的核苷酸序列中的第501个核苷酸的多态性(T*>G)，

E)SEQIDNO∶5所示的核苷酸序列中的第501个核苷酸的多态性(C>T*)，

F)与上述A)-E)的任一项的多态性连锁不平衡的多态性，所述连锁不平衡表示连锁不平衡系数D'不小于0.8(即，本发明的多态性)(在下文中，还记为本发明的测定用试剂盒)。

能够检测本发明的多态性的危险等位基因的多核苷酸，可用于测定检测对象的抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险。为此，本发明的测定用试剂盒含有能够检测本发明的多态性的危险等位基因的多核苷酸。例如，这种多核苷酸能够在上述A)的多态性中检测SEQIDNO∶1中所示的核苷酸序列中第501个核苷酸是T(在互补链序列中的A)的序列的存在，在上述B)的多态性中检测SEQIDNO∶2中所示的核苷酸序列中第201个核苷酸是T(互补链序列中的A)的序列的存在。

优选，本发明的测定用试剂盒包括能够检测上述A)和/或B)的多态性的危险等位基因的多核苷酸。

在本发明的测定用试剂盒的一个优选实施方案中，所述试剂盒包括在连锁不平衡系数D'至少为0.8的与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性中，和/或，在连锁不平衡系数D'至少为0.8与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性中，能够检测危险等位基因的多核苷酸。在连锁不平衡系数D'至少为0.8时，与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性的例子包括与上述A)的多态性完全连锁的多态性，等等，尤其优选包括能够检测在编码HLA-DRB1*08:03和HLA-DRB1*08:02的74位的氨基酸(即，Leu)的位置的多态性的多核苷酸。在连锁不平衡系数D'至少为0.8时，与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性的例子包括与上述B)的多态性完全连锁的多态性，等等，尤其优选包括能够检测在编码HLA-B*39:01和HLA-B*38:02的116位的氨基酸(即，Phe)或HLA-B*39:01和HLA-B*38:02的158位的氨基酸(即，不是Ala)的位置的多态性的多核苷酸。

优选，本发明的测定用试剂盒包括能够检测本发明的多态性的非危险等位基因的多核苷酸。例如，这种多核苷酸能够在上述A)的多态性中检测SEQIDNO∶1中所示的核苷酸序列中第501个核苷酸是G(在互补链序列中的C)的序列的存在，在上述B)的多态性中检测SEQIDNO∶2中所示的核苷酸序列中第201个核苷酸是C(互补链序列中的G)的序列的存在。在下文中，在本发明的多态性中，能够检测危险等位基因的多核苷酸和能够检测非危险等位基因的多核苷酸还共同记作“能够检测本发明的多态性的多核苷酸”。

具体地说，能够检测本发明的多态性的多核苷酸在已知的多态性分析方法中，例如，上述多态性检测方法，例如，RFLP方法、PCR-SSCP方法、ASO杂交、直接序列方法、ARMS方法、变性梯度凝胶电泳、RNaseA断裂方法、化学断裂方法、DOL方法、TaqManPCR方法、侵入物方法、MALDI-TOF/MS方法、TDI方法、分子信标方法、动态等位基因-特异性杂交方法、锁式(padlock)探针方法、UCAN方法、使用DNA碎片或DNA微阵列的核酸杂交方法、ECA方法，等等，用作引物或探针。

当能够检测本发明的多态性的多核苷酸是引物时，所述引物可以是任何引物，只要将它设计成为能够特异性地扩增含有本发明的多态性位点的核苷酸的基因组DNA(或mRNA)的域即可。当能够检测本发明的多态性的多核苷酸是探针时，所述探针可以是任何探针，只要将它设计成为能够在严格条件下与含有本发明的多态性位点的核苷酸的基因组DNA(或mRNA)的域杂交即可。

在本说明书中，“严格条件”是指在这种条件下，具有至少大约90％的核苷酸序列同一性的多核苷酸可以彼此杂交，优选至少大约95％，特别优选至少大约96、97、98、99％，最优选100％。在杂交反应和洗涤期间，可以通过恰当地改变盐浓度、温度等等来控制严格性，本领域普通技术人员可以容易地设定优选的条件。

对于能够检测本发明的多态性的多核苷酸的长度没有特别限制，只要它可以检测含有10-200个连续核苷酸序列(含有多态性位点)的HLA域中的DNA片段即可。按照多核苷酸的用途，本领域普通技术人员可以恰当地选择长度。

当本发明的多核苷酸用作引物时，例如，它具有10-200个bp的核苷酸长度，优选15-100个bp，更优选15-35个bp。引物可以扩增的DNA的长度是，例如，15-1000个bp，优选20-500个bp，更优选20-200个bp。

当本发明的多核苷酸用作探针时，例如，它具有10-200个bp的核苷酸长度，优选15-100个bp，更优选15-35个bp。

当能够检测本发明的多态性的多核苷酸用作引物时，引物可以含有适合于检测多态性的附加序列(与基因组DNA(或mRNA)不互补的序列)，例如，连接序列。

可以用合适的标记物标记引物，例如，放射性同位素(例如，¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C等等)、酶(例如，β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化酶、苹果酸脱氢酶等等)、荧光物质(例如，荧光胺、异硫氰酸荧光素、Cy3、Cy5等等)、发光物质(例如，发光氨、发光氨衍生物、莹光素、光泽精等等)，等等。

当能够检测本发明的多态性的多核苷酸用作探针时，探针可以含有适合于检测多态性的附加序列(与基因组DNA(或mRNA)不互补的序列)。例如，入侵探针方法所使用的探针可以在多态性位点的核苷酸的5'-端含有被称为瓣(flap)的附加序列。

可以用合适的标记物标记探针，例如，放射性同位素(例如，¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C等等)、酶(例如，β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化酶、苹果酸脱氢酶等等)、荧光物质(例如，荧光胺、异硫氰酸荧光素、Cy3、Cy5等等)、发光物质(例如，发光氨、发光氨衍生物、莹光素、光泽精等等)，等等。或者，可以在荧光物质(例如，FAM、VIC等等)附近，进一步结合能够吸附荧光物质发射的荧光能量的淬灭剂(消光物质)。在这种实施方案中，在检测反应期间将荧光物质和淬灭剂分离，并检测荧光。

将上述探针和/或引物在水或合适的缓冲剂(例如，TEbuffer等等)中分别溶解(或当合适的时候，以混合态存在)至合适的浓度(例如，1-50μM的2-20×浓度，等等)，并且在大约-20℃下保存。

本发明的测定用试剂盒含有至少一种能够检测本发明的多态性的多核苷酸(至少能够检测危险等位基因)。由于所检测的多态性的数量越多越能够使测定精确性提高，所以，优选，含有两种或更多种能够检测本发明的多态性的多核苷酸(至少能够检测危险等位基因)。

能够检测本发明的多态性的多核苷酸可以是DNA或RNA，可以是单链或双链。在双链情况下，可以是双链DNA、双链RNA或DNA/RNA混杂型。为此，当本文描述具有某些核苷酸序列的核酸时，如果没有特别限定，应该理解，术语核酸是指涵盖所有具有该核苷酸序列的单链核酸、具有与该核苷酸序列互补序列的单链核酸以及混杂型双链核酸。

可以合成上述多核苷酸，例如，按照常规方法，基于SEQIDNO∶1-5所示的各核苷酸序列的信息，使用DNA/RNA自动合成仪来合成。

作为本发明的测定用试剂盒的对象的“检测对象”，是指人，是甲状腺机能亢进患者，优选格雷夫斯氏病患者，并且是正在或预定服用抗甲状腺药物来治疗或预防疾病的人。同时，对检测对象的人种没有特别限制，优选东亚人，更优选日本人。

按照多态性检测方法，本发明的测定用试剂盒可以进一步含有进行该方法所必需的其它组成部分。例如，当试剂盒是通过TaqManPCR方法检测多态性时，所述试剂盒可以进一步包括(但不局限于)：10xPCR反应缓冲液、10xMgCl₂水溶液、10xdNTPs水溶液、TagDNA聚合酶(5U/μL)、抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症风险的判定标准表、解释试剂盒操作方法的手册，等等。

本发明还提供了测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的试剂盒，其包括能够鉴定下列(a)和/或(b)的物质：

(a)HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是Leu

(b)HLA-B蛋白的116位的氨基酸是Phe，或HLA-B蛋白的158位的氨基酸是Ala(本发明的测定用试剂盒(2))。

能够鉴定HLA-DRB1蛋白的74位氨基酸是Leu、HLA-B蛋白的116位氨基酸是Phe或158位氨基酸是Ala的物质的例子包括：能够检测含有在HLA-DRB1基因或mRNA中的编码HLA-DRB1蛋白的74位氨基酸的密码子的部分核苷酸序列的多核苷酸、能够检测含有在HLA-B基因或mRNA中的编码HLA-B蛋白的116位或158位的氨基酸的密码子的部分核苷酸序列的多核苷酸，等等。可以利用与上述“本发明的测定用试剂盒”详细描述的方法相似的方法，设计和制备这些多核苷酸。

能够鉴定HLA-DRB1蛋白的74位氨基酸是Leu、HLA-B蛋白的116位氨基酸是Phe或158位氨基酸是Ala的其它物质的例子包括：与含有HLA-DRB1蛋白的74位Leu的部分肽特异性结合的抗体或适体、与含有HLA-B蛋白的116位Phe的部分肽或含有158位Ala的部分肽特异性结合的抗体或适体。可以通过众所周知的方法，获得这种抗体或适体。

作为本发明的测定用试剂盒(2)的靶向的“检测对象”，是指甲状腺机能亢进患者，优选格雷夫斯氏病患者，并且是正在或预定服用抗甲状腺药物来治疗或预防疾病的人。对检测对象的人种没有特别限制，可以是蒙古人、高加索人和黑人中的任何人。

按照多态性检测方法，本发明的测定用试剂盒(2)可以进一步含有进行该方法所必需的其它组成部分。例如，当试剂盒通过TaqManPCR方法检测多态性时，本发明的测定用试剂盒，它可以含有与上述“本发明的测定用试剂盒”相似的组成部分。另一方面，当试剂盒通过抗体或适体来检测多态性时，作为进一步的组成部分，所述试剂盒可以含有免疫测定方法通常所使用的试剂、容器等等，例如，反应缓冲液、二抗、标记物、微板等等。

在下文中，利用实施例更详细地解释本发明，但不能认为这些实施例具有限制性。

实施例

[实施例1]

探究与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症相关的SNP

(1)检测对象

从隈医院(Kobe，Japan)收集63个病例的诊断患有抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症(不超过500/μL)的患者的DNA样本，从伊藤医院(Tokyo，Japan)收集52个病例(总计115个病例)。115个病例当中，113个病例诊断患有格雷夫斯氏病，剩余2个病例诊断患有无痛性甲状腺炎和甲状腺机能亢进，用抗甲状腺药物治疗他们。治疗所使用的抗甲状腺药物是甲巯咪唑(95个病例)和丙基硫氧嘧啶(在下文中，也记作PTU，20个病例)。通过每个机构中的甲状腺医生，收集患者的临床信息，例如，年龄、性别、粒细胞数量等等。

作为对照组，使用了滋贺县长滨市基因组群组研究收集的1,937个病例的DNA样本(在下文中，也记作长滨群组)。本试验所使用的患者的特征示于下列表1中。

表1

从京都大学获得89个格雷夫斯氏病患者的DNA样本。该研究经过每个研究机构的伦理学会批准，而且从所有检测对象得到了知情同意。

(2)全基因组关联分析(GWAS)

在2个组中，进行GWAS。第一组，从隈医院获得的63个病例的DNA样本用作病例组，并使用IlluminainfiniumHumanOmni2.5-8v1.0DNA分析试剂盒(Illumina,Inc)进行基因分型。作为对照组，使用IlluminainfiniumHumanOmni2.5-4v1.0DNA分析试剂盒(Illumina,Inc)，将从长滨群组获得的1,562个病例的DNA样本进行基因分型。

在第二组中，从Ito医院获得的52个病例的DNA样本用作病例组，从长滨群组获得的375个病例的DNA样本用作对照组，并都使用IlluminainfiniumHumanOmni2.5-8v1.0DNA分析试剂盒(Illumina,Inc)，将两者进行基因分型。

使用SNP阵列进行基因分型之后，将成功率(callsuccessrate)小于95％的DNA样本(12个病例)、与其它样本具有高血缘关系(PI_HAT≥0.35，利用PLINK软件)的DNA样本(122个病例)和通过主要组成部分的分析偏离亚洲人群的DNA样本(5个病例)排除。结果，质量控制之后，第一组中的DNA样本由病例组(63个病例)和对照组(1,445个病例)组成，第二组中的DNA样本由病例组(52个病例)和对照组(353个病例)组成。

作为SNP标志物，着眼于两个阵列共通的2,635,435个SNP，选择了成功率至少为95％、次要等位基因频率至少为0.01(在病例组或对照组中)以及Hardy-Weinberg平衡检验p值>1.0x10^-7的SNP标志物。结果，合计1,223,017个SNP(第一组)和1,246,969个SNP(第二组)用于分析。

就格雷夫斯氏病患者的DNA样本而言，使用3730xlDNA分析仪(LifeTechnologies)，通过毛细管测序，用于对与粒细胞缺乏症相关的SNP进行基因分型。

(3)统计分析

使用PLINK软件或R软件，通过卡方(chi-squared)检验或Fisher's精确概率检验(Fisher's精确检验)，进行2组GWAS以及综合测定的统计分析。使用Breslow-Day检验，进行检验之间的非均性检验。当2x2列联表(contingencyrable)中的预期数值不超过5时，使用Fisher's精确概率检验。为了考察在HLA域中SNP的独立性，进行多因素逻辑回归分析。在多因素检验中，在Bonferroni's校正之后，GWAS显著性水平调整到5.0x10^-8。利用通常已知的方法(Andersson等人，Europeanjournalofepidemiology2005；20∶575-9)，测定相关的SNP之间的相互作用。Haploview版本4.1软件用于分析SNP之间的LD值，并绘制连锁不平衡图。

(4)结果

对第一组(病例组∶63个病例，以及对照组∶1,445个病例)和第二组(病例组∶52个病例，以及对照组∶353个病例)进行病例对照研究，在人的染色体6的短臂6p21.3上的人类HLA域中，鉴定了191个显示出与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症非常强烈地相关的SNP(图1)。没有的集团的结构化。将鉴定的191个SNP通过两组的综合分析所获得的p值，比值比(OR)，95％置信区间(CI)一起示于下列表2-6中。

表2

表3

[表4]

[表5]

[表6]

与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症非常强烈相关的191个SNP主要分为总共4个域，2个域在I类域中(HLA-A域的上游侧，以及HLA-B域周围)，2个域在II类域中(2个域在HLA-DR域周围)(图2)。在HLA-DR域周围(最强烈相关的多态性∶rs6457580，p＝2.0x10^-30，OR:5.12(95％CI:3.77-6.95))获得最强相关，之后是在HLA-B域周围(最强烈相关的多态性∶rs41560220，p＝2.1x10^-26，OR:5.44(95％CI:3.85-7.68))、HLA-A域上游(最强烈相关的多态性∶rs1736959，p＝1.7x10^-12，OR:2.79(95％CI∶2.07-3.74))、HLA-DR域周围(最强烈相关的多态性∶rs3135387，p＝1.2x10^-10，OR∶0.37(95％CI:0.27-0.51)获得最强烈相关，然后是强烈相关的多态性∶rs17576984，p＝1.15x10^-27，OR∶4.17(95％CI:3.17-5.49))(表7)。

[表7]

1)A1和A2表示NCBIGRCh37的参考等位基因和变体等位基因，*表示危险等位基因。

在各个域中表现出显著差异的许多SNP显现了强烈的连锁不平衡关系(图3-5)。4个域没有显现出互相的连锁不平衡，可知它们是独立的。同时，rs17576984和rs3135387在同一个域存在，但显示连锁不平衡系数D'＝0.44，是独立的。

为了进一步证实针对抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的SNP标志物是否彼此独立，使用rs6457580、rs41560220、rs1736959和rs3135387进行多因素逻辑回归分析(表8)。

[表8]

对数回归分析

l)A1和A2表示NCBIGRCh37的参考等位基因和变体等位基因，*表示危险等位基因。

作为多因素逻辑回归分析的结果，所有4个标志物独立地显示了与粒细胞缺乏症显著相关。

接下来检测当患者具有多个危险等位基因时，抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险是否提高。对于上述4个SNP，使用不具有任何危险等位基因的对象用作参考。结果观察到，根据患者具有的危险等位基因的数量，抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险快速提高。具有所有4个危险等位基因的患者的比值比达到953.2(95％CI∶101.1-8988.6)(图6)。

此外，为了避免粒细胞缺乏症，还测定了在抗甲状腺药物治疗之前基因检查的有用性。为此目的，在患者和对照组中，基于4个SNP标志物的危险等位基因的分布，计算形成并发症的类型条件风险。当抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的发病率是0.35％(参考)时，估计38.3％的具有4个危险等位基因的患者形成粒细胞缺乏症(表9)。具有3个危险等位基因的患者的粒细胞缺乏症的发病率推定为3.8％。

[表9]

该研究所使用的115个病例的患者当中，113个病例患有格雷夫斯氏病。由此，考察了是否由于格雷夫斯氏病本身所导致的粒细胞缺乏症与上述SNP的相关性。具体地说，将来源于89个格雷夫斯氏病患者的DNA直接测序，对4个SNP标志物(rs6457580、rs41560220、rs1736959和rs3135387)进行基因分型，并与对照组的频率相比较。结果，这些标志物都没有显示出与格雷夫斯氏病相关。

[实施例2]

探究与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症相关的HLA等位基因

(1)HLA基因分型

由于上面获得的SNP标志物都存在于HLA域中，所以，抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症可能与HLA基因本身有关。由此，使用患者样本，靶向显示非常强烈相关的HLA-DR域和HLA-B域周围，进行HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DPB1和HLA-DQB1基因的基因分型。

具体地说，使用WAKFlow系统(WakunagaPharmaceuticalCo.,Ltd，Osaka，Japan)，通过高分辨(4-digit)基因分型，测定实施例1描述的抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症患者的115个病例的HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DPB1和HLA-DQB1基因的基因型。从非营利组织机构HLA研究所(Kyoto，Japan)获得1,000个普通日本人的HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DPB1和HLA-DQB1等位基因频率信息。在HLA基因分型过程中，在病例组或对照组中，使用具有超过1％的等位基因频率的HLA等位基因用于关联分析。

在统计分析中，通过卡方(chi-squared)检验或Fisher's精确概率检验，在病例组和对照组之间比较HLA等位基因频率。为了证实HLA等位基因的独立性，进行多因素逻辑回归分析。在多因素检验中，在Bonferroni's校正之后，显著性水平调整到6.9x10^-4。

(2)结果

在多因素检验中，在Bonferroni's校正之后，HLA-B*39:01、HLA-B*38:02、HLA-C*07:02、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03、HLA-DRB1*08:02、HLA-DRB1*09:01和HLA-DQB1*06:01显示了与抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的显著相关性(表10)。

[表10]

粒细胞缺乏症和HLA等位基因的相关性

1)N.S.表示在使用HLA等位基因的多因素逻辑回归分析中不显著。

上述8个HLA等位基因当中，HLA-B*39:01与HLA-C*07:02连锁不平衡(LD)(D'＝0.97)，HLA-DRB1*08:03与HLA-DQB1*06:01处于LD状态(D'＝0.96)。多因素逻辑回归分析表明，HLA-B*39:01、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03和HLA-DRB1*08:02与粒细胞缺乏症显著且独立地相关，与HLA-B*38:02弱相关(p＝0.0033)。

通过线性回归分析，检测了粒细胞缺乏症的临床进展是否受到与粒细胞缺乏症显著相关的上述SNP标志物以及在患者中鉴定的HLA等位基因的影响。上述SNP标志物或HLA等位基因显示与诊断时的年龄、开始给予抗甲状腺药物至诊断患有粒细胞缺乏症的期间中的任一项都不相关。另外，这些SNP标志物或HLA等位基因的等位基因频率在用甲巯咪唑治疗的95个患者和用PTU治疗的20个患者之间没有不同(p≥0.011)。

[实施例3]

探究与敏感的HLA等位基因相关的氨基酸

(1)HLA氨基酸的逻辑回归分析

在IMGT数据库(http∶//www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)中，检索与基因分型得到的或从HLA研究所获得的任何一个HLA等位基因所对应的氨基酸序列，并将各个HLA基因对比。在278个位点中，总共鉴定了462个氨基酸变体。使用UCSFchimera软件，进行HLA-DRB1和HLA-B蛋白的三维结构分析。

(2)建立多因素逻辑回归分析

在HLA-B和HLA-DRB1基因这两者中，由于多个等位基因显示了与粒细胞缺乏症相关，所以，推测在敏感性HLA等位基因中存在重要的氨基酸残基。为此，使用HLA氨基酸序列的对比，实施了创建多因素逻辑回归分析。

(3)统计分析

计算了Akaike信息准则(AIC)用于氨基酸分析。就氨基酸的变异而言，当包括突变的逻辑回归模型显示出最小的AIC时，与含有其它氨基酸突变相比较，显示大于7的AIC(ΔAIC>7)，相对于其他变异有显著性。置换检验进行1,000次，测定由于氨基酸突变造成的AIC的提高是否是偶然地提高，以及由于显著的氨基酸突变造成的AIC的提高是否与由于显著的SNP标志物所造成的提高同等。

(4)结果

与其它氨基酸突变相比较，HLA-DRB1蛋白的74位亮氨酸残基(DRB1-Leu74)显示了ΔAIC21.0的最强的相关(p＝7.9x10^-26，置换p＝0.001，图7A)。DRB1-Leu74的调节(conditioning)之后，116位苯丙氨酸(B-Phe116)显示出ΔAIC14.1的第二强相关性(p<8.2x10^-12，置换p＝0.001，图7B)。同时发现，在HLA-B的158位丙氨酸残基的不存在与B-Phe116的存在处于连锁不平衡(r^2＝0.92)。在DRB1-Leu74和B-Phe116的调节之后，其它氨基酸没有显示出显著的关联(p>0.00024，图7C)。重要的是，HLA-B*39:01和HLA-B*38:02具有B-Phe116，HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03和HLA-DRB1*08:02具有DRB1-Leu74(表11)。与B-Phe116和DRB1-Leu74相比较，HLA-B中的rs41560220与HLA-DRB1中的rs6457580和rs3135387分别显示出同等的AIC提高。

[表11]

[实施例4]

每个单元型相对于本发明的SNP标志物和其模拟物的比值比

使用115个抗甲状腺药物所引起的粒细胞缺乏症患者和1937个健康人样本，通过每个SNP的相关性研究，分析本发明的作为SNP标志物的rs2596487(它与rs41560220完全连锁，D'＝1)和rs17576984的对于每个单元型的比值比(OR)。当两个SNP具有危险等位基因时，应用多因素逻辑回归分析的OR。基于1937个健康人样本结果的SNP的等位基因频率，假定维持Hardy-Weinberg平衡，计算普通健康个体人群中的每个单元型频率的比例。此外，分析了利用健康个体的单元型频率和由上述OR分析该单元型参与发病的比例。结果示于下列表12中。在表12中，危险等位基因的纯合子表示2分，危险等位基因和非危险等位基因的杂合子表示1分，非危险等位基因的纯合子表示0分。此外，针对任何SNP，将不具有危险等位基因的情况用作对照物。

[表12]

如表12所示，当检测rs2596487和rs17576984这两个SNP时，按照rs2596487/rs17576984的评分0/0、0/1、1/0、0/2、2/0、1/1、1/2、2/1、2/2基因型的次序，显示出比值比提高，以纯合子的形式具有两个SNP的危险等位基因的患者同型的比值比达到398.0。根据抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症患者具有的SNP的基因型比例以及该基因型参与发病的比例，可以预测当患者具有什么样的基因型时通过中止给予抗甲状腺药物在多大程度上可以避免粒细胞缺乏症的发病(表13)。具体地说，如表13所示，例如，当具有geno01之后的基因型(即，geno01、10、02、20、11、12、21、22)的患者停止给予抗甲状腺药物时，35％的患者停止给予抗甲状腺药物，而形成粒细胞缺乏症的患者的数量减少81％。当具有geno10之后的基因型(即，geno10、02、20、11、12、21、22)的患者停止给予抗甲状腺药物时，10％的患者停止给予抗甲状腺药物，而形成粒细胞缺乏症的患者的数量减少50％。当患者具有什么样的基因型时应该中止给予抗甲状腺药物，考虑各种因素例如，疾病的严重程度和其并发症(尤其是肾脏机能减退)、患者的年龄(老年人)、性别等等，由医生裁量决定。

[表13]

工业实用性

按照本发明，可以合适和高度精确地测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险。为此，在测定具有抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的高风险的患者中，在治疗甲状腺机能亢进过程中，通过选择除了药物疗法以外的治疗方法，可以避免非常严重的副作用，在测定具有低风险的患者中，可以避免入侵性检验，例如，过度采血，等等。结果，甲状腺机能亢进的安全、可靠和精确的治疗变成可能。

本申请基于在日本申请的专利申请No.2013-188806(申请日∶2013年9月11日)，本文结合其全部内容。

Claims

1.测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的检测方法，包括：

(1)使用来源于检测对象的样本，检测HLA域存在的多态性的步骤，多态性选自下列中的至少之一：

(2)基于(1)的试验结果来测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的步骤。

2.按照权利要求1的检测方法，包括下列步骤：检验上述A)的多态性，或在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与所述多态性连锁不平衡时的多态性，和/或，B)的多态性，或在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与所述多态性连锁不平衡时的多态性。

3.按照权利要求2的检测方法，其中，在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性是在编码HLA-DRB1*08:03或HLA-DRB1*08:02的74位的氨基酸的位置的多态性，在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性是在编码HLA-B*39:01或HLA-B*38:02的116位或158位的氨基酸的位置的多态性。

4.按照权利要求1至3中任一项的检测方法，其中，来源于检测对象的样本包括基因组DNA。

5.按照权利要求1至4中任一项的检测方法，其中，检测对象是东亚人。

6.用于测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的试剂盒，其包括能够检测存在于HLA域中的多态性中的危险等位基因的多核苷酸：

所述多态性选自下列中的至少之一：

F)与上述A)-E)的任一项的多态性连锁不平衡的多态性，所述连锁不平衡表示连锁不平衡系数D'不小于0.8。

7.按照权利要求6的试剂盒，其包括能够检测下列多态性的危险等位基因的多核苷酸：上述A)的多态性，或连锁不平衡系数D'不小于0.8时的与所述多态性连锁不平衡时的多态性，和/或，B)的多态性，或在连锁不平衡系数D'不小于0.8时的与所述多态性连锁不平衡时的多态性。

8.按照权利要求7的试剂盒，其中，在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与上述A)的多态性连锁不平衡的多态性是在编码HLA-DRB1*08:03或HLA-DRB1*08:02的74位的氨基酸的位置的多态性，在连锁不平衡系数D'不小于0.8时，与上述B)的多态性连锁不平衡的多态性是在编码HLA-B*39:01或HLA-B*38:02的116位或158位的氨基酸的位置的多态性。

9.按照权利要求6至8的任一项的试剂盒，进一步包括能够检测非危险等位基因的多核苷酸。

10.按照权利要求6至9的任一项的试剂盒，其中，能够检测危险等位基因的上述多核苷酸是能够与包含所述等位基因的10-200个连续核苷酸序列或其互补链序列的片段在严格条件下杂交的探针，和/或，能够扩增所述片段的引物。

11.按照权利要求6至10的任一项的试剂盒，它用于测定东亚人的抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险。

12.用于测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的试验方法，包括：

(1)使用来源于检测对象的样本和检验下列(a)和/或(b)的步骤∶

(a)在HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是否是Leu

13.用于测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症的风险的试剂盒，其包括：能够鉴定下列(a)和/或(b)的物质∶

(a)在HLA-DRB1蛋白的74位的氨基酸是Leu