JP2013538589A - 自閉症を診断するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、自閉症を診断するためのＪＡＲＩＤ２遺伝子における多型の使用を特徴とする方法を提供する。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、以下の２０１０年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３９１，０３５号の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

連邦が支援する研究下でなされた発明に対する権利の宣言
この研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａ
ｌｔｈ）からの以下の補助金、すなわち補助金第ＭＨ０６０００７号により支援された。
政府は本発明に一定の権利を有している。

自閉症スペクトラム障害（ＭＩＭ ２０９８５０）は、自閉症、アスペルガー症候群、
及び特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を含む一群の神経発達障害である。これらの障害は、コミュニケーション及び社会的相互作用における機能障害、並びに常同行動の存在に特徴付けられる。自閉症の性比は男性対女性が４対１で、その疾患の罹患率は１００人当たり１人を超えると推定される。自閉症スペクトラム障害の病因は不明であるが、家系及び双子の研究は、一卵性及び二卵性双生児の高いリスク比、並びに５０から１００の兄弟姉妹相対危険度を示して、自閉症を発症する疾病素質が主として遺伝的に決定されることを示唆する。

自閉症は遺伝性の高い神経発達障害であるが、特異的感受性遺伝子を同定する試みは、今までのところ限られた成功を収めている。自閉症スペクトラム障害の高い遺伝率にもかかわらず、自閉症遺伝子を同定するのは困難である。自閉症症例の１０％までは、まれな配列及び遺伝子量変異体、例えば、ＮＲＸＮ１、ＮＬＧＮ３／４Ｘ、ＳＨＡＮＫ３、並びに１５ｑ１１−ｑ１３及び１６ｐ１１．２のコピー数変異体における変異による可能性がある。Ｒｅｔｔ症候群、脆弱Ｘ症候群、神経線維腫症１型、結節性硬化症、Ｐｏｔｏｃｋｉ−Ｌｕｐｓｋｉ症候群、及びスミス・レムリ・オピッツ症候群を含む、病因論が公知であるいくつかの疾患も、自閉症に関連している（Abrahams and Geschwind 2008; Zafeiriou et al. 2007）。しかしながら、自閉症スペクトラム障害の残りの９０％は、家族性が高い一方、遺伝的な病因は不明である。５０万又はそれ以上のマーカーを使用するゲノムワイド関連研究、特にメタ解析によって達成された非常に大きな試料サイズを用いたものは、他の複雑な遺伝形質に関する遺伝子マッピングにおいて大成功を示している。

早期診断及び早期介入により、自閉症の多くの症状を改善することができる。このような介入は、乳児及び幼児が言語及び社会的技能を発達させているときに最も効果的である。現在、自閉症の小児のほとんどは、約５歳になるまで確定診断を待っている。この時点で、介入が最も効果的である年齢をかなり過ぎている。遺伝子マーカー、及びこのようなマーカーを使用して乳児及び幼児が自閉症を有しているか又は発症する傾向を有しているかを同定する方法が、緊急に必要である。このようなマーカーは、疾患の根本的原因である分子機構を解明することにもなるだろう。

本発明は、自閉症及び自閉症スペクトラム障害に関連する遺伝子変異、並びに自閉症及び自閉症関連障害を有しているか又は発症する傾向を有している対象を診断するためにこのようなマーカーを使用する方法を提供する。

一態様において、本発明は、一般に対象における自閉症又は自閉症スペクトラム障害の遺伝的素因、又はその存在を確認する方法を特徴とし、その方法は対象に由来するＪＡＲＩＤ２核酸分子における遺伝子変異の非存在又は存在を識別することを含んでいる。

別の態様において、本発明は、一般に自閉症又は自閉症スペクトラム障害を改善する治療介入の必要がある対象を同定する方法を特徴とし、その方法は対象に由来するＪＡＲＩＤ２核酸分子における遺伝子変異の有無を識別することを含んでいる。

別の態様において、本発明は、一般に対象の自閉症関連多型を検出するためのキットを特徴とし、このキットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での使用に適切な少なくとも１セットのプライマーを含み、このプライマーセットはＪＡＲＩＤ２核酸分子を増幅する。

別の態様において、本発明は、対象の自閉症関連多型を検出するためのキットを特徴とし、このキットは、ＪＡＲＩＤ２核酸分子における多型と特異的に結合又はハイブリダイズすることができる少なくとも１つのポリヌクレオチド分子、及びこのキットを使用するための説明書を含んでいる。

別の態様において、本発明は、一般に対象の自閉症関連多型を検出するためのキットを特徴とし、このキットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での使用に適切な少なくとも１セットのプライマーを含み、このプライマーセットは、ｒｓ７７６６９７３、ｒｓ６９１５３４４、ｒｓ１２５３０２０２、ｒｓ２２９５９５４、ｒｓ９４６４７７９、ｒｓ１１９６２７７６、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ９３９６５７８、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ９３７０８０９、ｒｓ３７５９、ｒｓ９５７３８７、ｒｓ７０７８３３、ｒｓ１３１９３４５７、ｒｓ９０９６２６よりなる群から選択される多型部位を増幅する。

上記態様の何れか、又は本明細書に詳述される本発明のその他の態様の何れかの様々な実施態様において、対象は、自閉症と診断された家族を有すると同定される。別の実施態様において、対象は、統合失調症と診断された家族を有すると同定される。さらに別の実施態様において、遺伝子変異は、ＪＡＲＩＤ２の連鎖不平衡領域中にあるか、又は染色体６ｐ２３と関連している。さらなる実施態様において、遺伝子変異は、前記ＪＡＲＩＤ２核酸分子における一塩基多型（ＳＮＰ）である。別の実施態様において、ＳＮＰは、ｒｓ７７６６９７３、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ６９１５３４４、及びｒｓ１３１９３４５７よりなる群から選択される。さらなる実施態様において、多型部位ｒｓ７７６６９７３でのＣの同定は、自閉症のリスク上昇を示唆する。なおもさらなる実施態様において、遺伝子変異は、対象由来の生体試料において同定される。別の実施態様において、生体試料は、血液、尿、糞便、唾液、チークスワブ、羊水及び組織から選択される。別の実施態様において、生体試料は血液である。さらに別の実施態様において、試料は、月齢０〜６か月、月齢６〜１２か月、又は月齢１２〜３６か月の対象から単離される。さらなる実施態様において、対象は、コミュニケーション技能、社会的技能に遅延を有すると同定されるか、又はそうでなければ発達障害と同定される小児である。

上記態様の何れか、又は本明細書に詳述される本発明のその他の態様の何れかの様々な実施態様において、方法は、対象の遺伝子変異と対象の親類の対応する配列とを比較することをさらに含んでいる。別の実施態様において、遺伝子変異を、直接配列決定法、１本鎖多型アッセイ、変性高速液体クロマトグラフィー、核酸アレイハイブリダイゼーション、制限長多型アッセイ、リガーゼ連鎖反応、酵素的切断、サザンハイブリダイゼーション、質量分析法、及びポリメラーゼ連鎖反応よりなる群から選択される方法によって検出する。別の実施態様において、生体試料は、デオキシリボ核酸又はリボ核酸を含む。さらなる実施態様において、遺伝子変異を、１本鎖多型アッセイによって検出する。さらに別の実施態様において、遺伝子変異を、変性高速液体クロマトグラフィーを使用して検出する。さらなる実施態様において、試料の試験を、核酸の直接配列決定法によって実施する。
なおもさらなる実施態様において、多型は、ｒｓ７７６６９７３、ｒｓ６９１５３４４、ｒｓ１２５３０２０２、ｒｓ２２９５９５４、ｒｓ９４６４７７９、ｒｓ１１９６２７７６、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ９３９６５７８、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ９３７０８０９、ｒｓ３７５９、ｒｓ９５７３８７、ｒｓ７０７８３３、ｒｓ１３１９３４５７、ｒｓ９０９６２６よりなる群から選択される部位にある。

上記の態様の何れか、又は本明細書に詳述される本発明のその他の態様の何れかの様々な実施態様において、方法は、対象を発達遅延又は自閉症の行動異常特徴を有していると同定することをさらに含む。

定義
「自閉症」とは、社会的相互作用及びコミュニケーションの障害、並びに限られた反復行動を特徴とする発達障害を意味する。本明細書で使用する自閉症は、障害の自閉症スペクトラム（ＡＳＤ）に認められる障害を全て含み、したがってアスペルガー症候群及び特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を含む。

「ＪＡＲＩＤ２核酸分子」とは、Ｊａｒｉｄ２ポリペプチドの発現をコード若しくは調節するポリヌクレオチド、又はその断片を意味する。一実施態様において、ＪＡＲＩＤ２核酸分子は、ヒト遺伝子ＪＡＲＩＤ２であり、マウスｊｕｍｏｎｊｉ遺伝子のオルソログである。ＪＡＲＩＤ２は、ヒト染色体６：１５，３５４，５０６を含む若しくは本質的にこれからなるポリヌクレオチド、又は遺伝子地図の遺伝子座６ｐ２３に存在する自閉症関連遺伝子変異に対応する。別の実施態様において、Ｊａｒｉｄ２核酸分子は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７３．２で提供される配列を含む、又は本質的にこれからなる。典型的なＪＡＲＩＤ２核酸分子配列（つまりＮＭ＿００４９７３．２）は、以下の通りである。
1 gttttactaa agtgaatttt tttttgtttg cttcgttcgt ctttggctct ttttttttcc
61 ttcccaattt cggatttatt tcaaggcgaa tctggctttg ggggaagagg aagaaaagtc
121 ggattacaag atcaaccacc accaacaaca ataaaaacca ccaggatatt tttttgcaaa
181 tttctgacgg ctttaaattc atgaagcaat tgtccccttt tgcaatcagc atttggatct
241 cagaatgagc aaggaaagac ccaagaggaa tatcattcag aagaaatacg atgacagtga
301 tgggattccg tggtcagaag aacgggtggt acgtaaagtc ctttatttgt ctctgaagga
361 gttcaagaat tcccagaaga ggcagcatgc ggaaggcatt gctgggagcc tgaaaactgt
421 gaatgggctc cttggtaatg accagtctaa gggattagga ccagcatcag aacagtcaga
481 gaatgaaaag gacgatgcat cccaagtgtc ctccactagc aacgatgtta gttcttcaga
541 ttttgaagaa gggccgtcga ggaaaaggcc caggctgcaa gcacaaagga agtttgctca
601 gtctcagccg aatagtccca gcacaactcc agtaaagata gtggagccat tgctaccccc
661 tccagctact cagatatcag acctctctaa aaggaagcct aagacagaag attttcttac
721 ctttctctgc cttcgaggtt ctcctgcgct gcccaacagc atggtgtatt ttggaagctc
781 tcaggatgag gaggaagtcg aggaggaaga tgatgagaca gaagacgtca aaacagccac
841 caacaatgct tcatcttcat gccagtcgac ccccaggaaa ggaaaaaccc acaaacatgt
901 tcacaacggg catgttttca atggttccag caggtcaaca cgggagaagg aacctgttca
961 aaaacacaaa agcaaagagg ccactcccgc aaaggagaag cacagcgatc accgggctga
1021 cagccgccgg gagcaggctt cagctaacca ccccgcagcg gccccctcca cgggttcctc
1081 ggccaagggg cttgctgcca cccatcacca cccccctctg catcggtcgg ctcaggactt
1141 acggaaacag gtttctaagg taaacggagt cactcgaatg tcatctctgg gtgcaggtgt
1201 aaccagtgcc aaaaagatgc gcgaggtcag accttcacca tccaaaactg tgaagtacac
1261 tgccacggtg acgaaggggg ctgtcacata caccaaagcc aagagagaac tggtcaagga
1321 caccaaaccc aatcaccaca agcccagttc cgctgtcaac cacacaatct cagggaaaac
1381 tgaaagtagc aatgcaaaaa cccgcaaaca ggtgctatcc ctcggggggg cgtccaagtc
1441 cactgggccc gccgtcaatg gcctcaaggt cagtggcagg ttgaacccaa agtcatgcac
1501 taaggaggtg ggggggcggc agctgcggga gggcctgcag ctgcgggagg ggctgcggaa
1561 ctccaagagg agactggaag aggcacacca ggcggagaag ccgcagtcgc cccccaagaa
1621 gatgaaaggg gcggctggcc ccgccgaagg ccctggcaag aaggccccgg ccgagagagg
1681 tctgctgaac ggacacgtga agaaggaagt gccggagcgc agtctggaga ggaatcggcc
1741 gaagcgggcc acggccggga agagcacgcc aggcagacaa gcacatggca aggcggacag
1801 cgcctcctgt gaaaatcgtt ctacctcgca accggagtcc gtgcacaagc cgcaggactc
1861 gggcaaggcc gagaagggcg gcggcaaggc cgggtgggcg gccatggacg agatccccgt
1921 cctcaggccc tccgccaagg agttccacga tccgctcatc tacatcgagt cggtccgcgc
1981 tcaggtggag aagttcggga tgtgcagggt gatcccccct ccggactggc ggcccgagtg
2041 caagctcaac gatgagatgc ggtttgtcac gcagattcag cacatccaca agctgggccg
2101 gcgctggggc cccaacgtgc agcggctggc ctgcatcaag aagcacctca aatctcaggg
2161 catcaccatg gacgagctcc cgctcatagg gggctgtgag ctcgacctgg cctgcttttt
2221 ccggctgatt aatgagatgg gcggcatgca gcaagtgact gacctcaaaa aatggaacaa
2281 actagcagac atgctgcgca tccccagaac tgcccaggac cggctggcca agctgcagga
2341 ggcctactgc cagtacctac tctcctacga ctccctgtcc ccagaggagc accggcggct
2401 ggagaaggag gtgctgatgg agaaggagat cctggagaag cgcaaggggc cgctggaagg
2461 ccacacagag aacgaccacc acaagttcca ccctctgccc cgcttcgagc ccaagaatgg
2521 gctcatccac ggcgtggccc ccaggaacgg cttccgcagc aagctcaagg aggtgggcca
2581 ggcccagttg aagactggcc ggcggcgact cttcgctcag gaaaaagaag tggtcaagga
2641 agaggaggag gacaaaggcg tcctcaatga cttccacaag tgcatctata agggaaggtc
2701 tgtttctcta acaacttttt atcgaacagc gaggaatatc atgagcatgt gtttcagcaa
2761 ggagcctgcc ccagccgaaa tcgagcaaga gtactggagg ctagtggaag agaaggactg
2821 ccacgtggca gtgcactgcg gcaaggtgga caccaacact cacggcagtg gattcccagt
2881 aggaaaatca gaaccctttt cgaggcatgg atggaacctc accgtcctcc ccaataacac
2941 agggtccatc ctgcgtcacc tcggtgctgt gcctggagtg actattccct ggctaaatat
3001 tggcatggtc ttttctacct catgctggtc tcgagaccaa aatcaccttc catacattga
3061 ctacttacac actggtgctg actgcatttg gtattgcatt cctgctgagg aggagaacaa
3121 gctggaagat gtggtccaca ccctgctgca agccaatggc accccagggc tgcagatgct
3181 ggaaagcaac gtcatgatct ccccggaggt gctgtgcaaa gaggggatca aggtgcacag
3241 gaccgtgcag cagagtggcc agtttgtcgt ctgcttcccg ggatcctttg tgtccaaagt
3301 gtgctgtggg tacagcgtgt ctgaaaccgt gcactttgct accacccagt ggacaagtat
3361 gggctttgag accgccaagg aaatgaagcg tcgccatata gctaagccat tctccatgga
3421 gaagttactc taccagattg cacaagcaga agcaaaaaaa gaaaacggtc ccactctcag
3481 taccatctca gccctcctgg atgagctcag ggatacagag ctgcggcagc gcaggcagct
3541 gttcgaggct ggcctccact cctccgcacg ctatggcagc cacgatggca gcagcacggt
3601 ggcggacggg aagaaaaagc ctcgaaagtg gctgcagttg gagacgtcag agaggaggtg
3661 tcagatctgc cagcacctgt gctacctgtc catggtggta caagagaacg aaaacgtcgt
3721 gttctgtctg gagtgtgctc tgcgccacgt ggagaaacag aagtcctgcc gagggctgaa
3781 gttgatgtac cgctacgatg aggaacagat tatcagtctg gtcaatcaga tctgcggcaa
3841 agtgtctggt aaaaacggca gcattgagaa ctgtctcagt aaacccacac caaaaagagg
3901 tccccgcaag agagcgacag tggacgtgcc cccctcccgt ctgtcagcct ccagttcatc
3961 caaaagtgct tcgagctcat catgaagatg ccaacgcccg tggtcgattt atatatattt
4021 ttttgtaatt attatattct agtttggagt acttgctgta ggattcaagc tgtctttgca
4081 ctagctctaa agaagatttt cttctggttt tagagaacta attttgtttt agcattaaac
4141 tgttgaactt ttttttgtac ttagaaaacc tagatactgc agtcagattt tggaaactgc
4201 cgtatagtca ctgttttaaa aaccccggag gggctgtatt aatttgtatt gccccatggc
4261 tgacaaaagc cttttttttt ggttttgatt tttttttttt tgtaactgtt ggggggaaaa
4321 aggcttttta acccattttt gaagagggtg aagtttggag aacaaattta aaaaccatca
4381 gtcatgtgag cagatttttt agaagggata ggagacacac gcgcacacac acacacacac
4441 gaaacttgaa atggctttgc tttggctgtc gtcttctgcc gtgtgccaga tgagcttgtg
4501 atctgggaag ccggggcacc cccgttttgt ttctctgggc ggttgtggca gctgaaggcg
4561 gacgttgttt cctaaccata ggtggaacga ggagacggga gcgagtgggc tctccaccag
4621 cacatcacta tgcatctgtt ccaggaaaga agaaaagcga gcgaggaaga cggaaaagac
4681 tgcctgcctt ggaggggtca catgagggag acctgtgcct gatttcatta ggaaatccat
4741 tctgttattt tttggtgctg ttggctactt tatcaaaaaa cccttcaata gcatccttaa
4801 gatttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaggaaa aaaaagtgat ggaagccgta agtgcttctt
4861 tgtcatcgac gtgcaatctt tctaacattc catctccatc tcaccgcttc ttgtttgaca
4921 ccttcacaag tcagcattaa tctttctttt aaaacttgtt tcatttatga tcatgtagag
4981 agccactagg aggcctgcag ttatttttga atgtgaaaat gcatttgcgt tcatcttgtc
5041 tattttttct cttcatgttg taacaaaaag gaaaaaagaa aaaaaaatcc catccctttt
5101 gtacatatgc ctgtaaattg ttttaaatac ttgagccttt ttctcggtgg ggggtgggga
5161 ggggggtgag aagacaagat gaagaaaagc cttacatttc agtttcttca tcggttggat
5221 tggatgctta cagggttttt cttgtaacat ttataagtgc tgcttacatc actgaacaac
5281 aacaaaaaaa taataatgga gtagctgttg cccttctccg gttgtgtgta cagtatgtgt
5341 ggaataaaaa agggaaactg ttttcacaag ctgttctttg tttcataatt ggattcatca
5401 atcccgtagc tacccatatt gcactgagct tgccagtggt gactgccagg aacgtcctat
5461 gatccacttt gttggttgtt gttgcagaag actgaactgt tttggaatat ttaacaatta
5521 cagaaacagt caagtgtttt ccaatgtggt tgtccggttt ctatggcctt gctgtgtact
5581 ttccctcttt ttgacagtaa acttctgcct atggcttaca gtttgacatt taatttatta
5641 gcgctgctct gcacccctcc cttgggaggg agacttcatg tggtttattg cgagtttttt
5701 gtttactttt caggtttgta ctacaaggtt taataataaa aacaaagttt tttgga

「Ｊａｒｉｄ２核酸分子における遺伝子変異」とは、参照配列と比較した、Ｊａｒｉｄ２核酸分子の配列における何れかの変化を意味する。Ｊａｒｉｄ２参照配列は、本明細書に提供される野生型Ｊａｒｉｄ２核酸分子の何れかを含む。典型的な遺伝子変異は、以下の多型の何れか１つ又はそれ以上を含むが、これに限定されない：ｒｓ７７６６９７３、ｒｓ６９１５３４４、ｒｓ１２５３０２０２、ｒｓ２２９５９５４、ｒｓ９４６４７７９、ｒｓ１１９６２７７６、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ９３９６５７８、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ９３７０８０９、ｒｓ３７５９、ｒｓ９５７３８７、ｒｓ７０７８３３、ｒｓ１３１９３４５７、ｒｓ９０９６２６。

「ＪＡＲＩＤ２タンパク質」とは、神経発達及び／又は胚形成において機能するＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００４９６４．２に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド又はその断片を意味する。

「ｒｓ７７６６９７３」とは、多型が、角括弧で示した位置においてＣ又はＴのいずれかであり得る配列、ＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡ［Ｃ／Ｔ］ＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＣＴＴ に対応する６番染色体に位置す
る一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ６９１５３４４」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＣ又はＴのいずれかであり得る配列、ＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣ［Ｃ／Ｔ］ＴＣＴＧＡＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＴＣＡＴＡＧＴＴＡＴ に対応する６番染色体に位置
する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ１２５３０２０２」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＣ又はＴのいずれかであり得る配列、ＧＣＧＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＣＴＴ［Ｃ／Ｔ］ＡＡＴＡＡＴＧＡＧＧＣＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡ に対応する６番染色体に位
置する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ２２９５９５４」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＡ又はＧのいずれかであり得る配列、ＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＡＡＧＴＴＧＣＡ［Ａ／Ｇ］ＴＧＴＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡ に対応する６番染色体に位置
する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ９４６４７７９」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＣ又はＴのいずれかであり得る配列、ＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＣＴＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＧＴＴ［Ｃ／Ｔ］ＴＴＧＡＧＡＧＣＴＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴ に対応する６番染色体に位置
する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ１１９６２７７６」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＡ又はＣのいずれかであり得る配列、ＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＡＴＴＡＡＡ［Ａ／Ｃ］ＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴＣＡＴ に対応する６番染色体に位
置する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ６９２１５０２」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＡ又はＧのいずれかであり得る配列、ＡＡＣＣＴＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＣＣ［Ａ／Ｇ］ＴＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＡＣＣＴ に対応する６番染色体に位置
する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ９３９６５７８」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＧ又はＴのいずれかであり得る配列、ＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣ［Ｇ／Ｔ］ＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧ に対応する６番染色体に位置
する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ６４５９４０４」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＣ又はＴのいずれかであり得る配列、ＧＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＧＣＡ［Ｃ／Ｔ］ＡＴＡＣＣＡＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＴ に対応する６番染色体に位置
する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ９３７０８０９」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＣ又はＴのいずれかであり得る配列、ＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡＣＣＣＴ［Ｃ／Ｔ］ＴＴＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＴＴＧＧ に対応する６番染色体に位置
する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ３７５９」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＡ又はＣのいずれかであり得る配列、ＡＧＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＧＣＴＴＡＣＣＡＡＣＣＣＣＡ［Ａ／Ｃ］ＴＧＡＧＴＡＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＡＣ に対応する６番染色体に位置する一
塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ９５７３８７」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＡ又はＧのいずれかであり得る配列、ＡＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣ［Ａ／Ｇ］ＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＣＴＣ に対応する６番染色体に位置す
る一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ７０７８３３」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＣ又はＴのいずれかであり得る配列、ＡＡＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡ［Ｃ／Ｔ］ＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＧＴＡＡＣＡＧＴ に対応する６番染色体に位置す
る一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ１３１９３４５７」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＡ又はＣのいずれかであり得る配列、ＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＴＴＡＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＧＧ［Ａ／Ｃ］ＡＡＣＡＴＴＧＴＡＧＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴ に対応する６番染色体に位
置する一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「ｒｓ９０９６２６」とは、多型が、角括弧で示された位置においてＡ又はＧのいずれかであり得る配列、ＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣ［Ａ／Ｇ］ＣＴＣＣＣＣＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＴＧＧＧＧ に対応する６番染色体に位置す
る一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。

「遺伝的素因」とは、参照配列と比較して１つ又はそれ以上の遺伝子変異が存在することによる、特定の疾患に対する感受性の亢進を意味する。

「遺伝物質」とは、対象から得た生体試料由来の核酸分子を意味する。遺伝物質には、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれる。

「発達障害児」とは、自閉症スペクトラム障害の少なくとも１つの症状を提示する小児を意味する。

「親類」とは、対象と遺伝的関係を有している個人を意味する。典型的な親類は、対象の祖父母、曾祖父母、兄弟姉妹、いとこ、またいとこ、及び遠縁のいとこ、姪、甥、おば、おじ、両親を含むがこれに限定されない。

「生体試料」とは、対象に由来する組織、液体又は固形物質の何れかを意味する。試料は、侵襲的に又は非侵襲的に得ることができる。好ましい生体試料には、血液、糞便、尿、精液、マウススワブ、皮膚細胞、切り取った爪の切れ端、毛髪、羊水又は子宮頸部スメア試料が含まれる。

本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「有している（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれに帰属させた意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる。
また、「本質的にからなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に、米国特許法中に帰属される意味を有し、この用語はオープンエンドであり、記載されたもの以外の存在によって記載された用語の基本的又は新規な特徴が変化しない限り、記載されたもの以外の存在を許容するが、先行技術の実施態様は除くものである。

「検出する」は、検出される分析物の存在、非存在、又は量を特定することを指す。一実施態様において、「検出する」とは、対象に由来する遺伝物質における遺伝子変異の有無を識別することを指す。

「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子、又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００若しくは１０００個のヌクレオチド又はアミノ酸を含んでいてもよい。

「ハイブリダイズ」とは、様々なストリンジェンシーの条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、表１及び表２に記載の遺伝子）又はその部分の間で２本鎖分子を形成するための対を意味する。（例えば、Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399;Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507 を参照されたい）。

「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生命体の、天然に存在するゲノムにおいて、隣接している遺伝子を含まない核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター中に、自主複製プラスミド若しくはウイルス中に、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み入れられる組換えＤＮＡ、或いは、他の配列とは独立した別々の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるｃＤＮＡ又はゲノム若しくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。さらに、この用語には、ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子の他に、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。

「単離されたポリペプチド」とは、ポリペプチドに天然に付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、ポリペプチドが天然に関連しているタンパク質及び天然有機分子を少なくとも６０重量％含んでいないときに単離されている。調製物は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％が本発明のポリペプチドである。例えば、天然供給源からの抽出、このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、又はタンパク質の化学合成により、本発明の単離されたポリペプチドを得ることができる。
純度は、何れかの適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、又はＨＰＬＣ解析によって測定することができる。

「マーカー」とは、疾患若しくは障害に関連する配列、発現レベル、又は活性に変化を有する何れかのタンパク質若しくはポリヌクレオチドを意味する。

「遺伝子変異」とは、参照と比較した核酸配列における何れかの変化を意味する。望ましくは、核酸配列は、参照配列由来の少なくとも１つの塩基対変異を有する。遺伝子変異は、置換、挿入、欠失又はフレームシフト突然変異を含むがこれに限定されない。

本明細書で使用されるように、「薬剤を得ること（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ａｇｅｎｔ）」におけるような「得ること（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）」とは、合成すること、購入すること、又は別の方法で薬剤を取得することを含む。

「多型」とは、一般集団の対立遺伝子の１％又はそれ以上に存在する配列変化（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を意味する。疾患（例えば、自閉症又は自閉症スペクトラム障害）を有している患者及び一般集団の両方に存在する多型は、必ずしも良性ではない。多型は、対象が疾患を有する、又は対象が疾患を発症する危険を増大する可能性がある。多型がその疾患と統計的に有意な関連を示す場合、多型は対象を疾患にかかりやすくする。

「参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」とは、標準又は対照の条件を意味する。

「参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、配列比較のための基準と
して用いられる、定義された配列である。参照配列は、特定配列の一部又は全体、例えば、全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子の配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子の配列であってよい。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、そしてさらにより好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、又は約１００アミノ酸となるであろう。核酸に関しては、参照核酸配列の長さは、一般に少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは約１００ヌクレオチド、又は約３００ヌクレオチド又はそれらの周辺若しくはそれらの間の何れかの整数となるであろう。

本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする何れかの核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的に実質的な同一性を示すことになるであろう。内因性の配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは典型的に、２本鎖の核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする何れかの核酸分子が含まれる。このような核酸分子は内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的に実質的な同一性を示すであろう。内因性の配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは典型的に、２本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」とは、様々なストリンジェンシーの条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）又はその部分の間に２本鎖分子を形成するための対を意味する。（例えば、Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399;Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507 を参照されたい）。

「実質的に同一の（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」とは、参照
アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列の何れか１つ）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列の何れか１つ）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列と、アミノ酸のレベルで又は核酸が、少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、そしてさらに好ましくは９０％、９５％又はさらに９９％同一である。

配列同一性は、典型的には配列解析ソフトウェア（例えば、the Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705 のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／又は他の改変に対する相同性の度合を割り当てることにより、同一又は同様の配列を一致させる。同類置換には、典型的に以下のグループ内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の度合を確認するための例示的な手法において、密接に関連する配列を示すｅ^−３〜ｅ^−１００の確立スコア（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）を用いるＢＬ
ＡＳＴプログラムを使用できる。

「対象」とは、ヒト、又はウシ、ウマ、イヌ、羊若しくはネコなどの非ヒト哺乳動物を含むが、これに限定されない哺乳動物を意味する。

本明細書に示されている範囲は、範囲内の全ての数値の省略形であると理解される。例えば、１〜５０までの範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０よりなる群からの何れかの数、数の組合せ、又は下位範囲（ｓｕｂ−ｒａｎｇｅ）を含むと理解される。

特に明記されていないか、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるような、用語「又は（ｏｒ）」は包括的であると理解される。特に明記されていないか、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるような、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、単数又は複数であると理解される。

特に明記されていないか、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるような、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、当該技術分野での通常の許容の範囲内として、例えば、平均値の２標準偏差内として理解される。約は、明示した値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内として理解されてよい。文脈から明らかでない限り、本明細書に示された数値は全て、用語、約によって修飾される。

本明細書の可変性の定義の何れかにおける化学基の列挙の記述は、何れかの単一基又は列挙された基の組合せとしての、その可変性の定義を含む。本明細書の可変性又は態様に関する実施態様の記述は、何れかの単一の実施態様、又は他の何れかの実施態様若しくはその部分との組合せとしてのその実施態様を含む。

本明細書に示された何れかの組成物又は方法は、本明細書に示された他の組成物及び方法の何れか１つ又はそれ以上と組み合わせることができる。

図１は、ゲノムワイド関連の結果を示す。図１は、ＴＤＴ結果のグラフ式表現である。それぞれの染色体は、異なる色で表される。青線は、Ｐ＜１０^−４、結果を再現する試みがなされたときの有意性を示し、赤線は、Ｐ＜１０^−５を示す。データは、最終品質管理を通過しているものを含む。 図２は、ＪＡＲＩＤ２遺伝子に位置する４８ＳＮＰの関連試験の結果を示す。試験のＰ値の−ｌｏｇ_１０は、これらの位置によって順序づけられる異なるＳＮＰのために示される。黒の実線は、α_Ｎ＝５％閾値Ｐ値の対数変換を表し、赤線は、補正５％閾値（α_Ｃ＝０．０００２９６２）Ｐ値の対数変換を表す。 図３は、ＪＡＲＩＤ２遺伝子において公称レベルで関連しているＳＮＰの連鎖不平衡を示す。連鎖不平衡は、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗソフトウェア（Barrett et al. 2005）を使用してＤ’係数を使用して定義される。枠をつけられたＳＮＰは、公称レベルで関連しているマーカーを示す。赤色の矢印は、Ｗｅｉｓｓら（Weiss et al. 2009）由来のＳＮＰ ｒｓ７７６６９７３の位置を示す。

本発明は、自閉症の診断、治療及び予防に有用な組成物及び方法を特徴とする。

少なくとも部分的には、本発明は、ＪＡＲＩＤ２遺伝子における多型が自閉症と遺伝的に関連しているという発見に基づいている。特に、ｒｓ７７６６９７３ ＳＮＰの多型は
自閉症に関連している。従って、本発明は、自閉症スペクトラム障害を有しているか又は発症する傾向を有していると対象を同定するのに有用である診断用組成物、さらにはこれらの組成物を用いて対象の予後又は治療レジメンの選択を決定する方法も提供する。

自閉症及び自閉症スペクトラム障害
自閉症及び自閉症スペクトラム障害は、様々な行動異常、臨床的異常及び生化学的異常を特徴とする。自閉症及び自閉症スペクトラム障害は、遺伝学的根拠を有することが示されている。特に、兄弟又は姉妹が既に自閉症を有している場合、その同胞種は、自閉症又は自閉症スペクトラム障害を遺伝する確率が一般集団より７５倍高いということが家系研究により確認されている（Bolton et al. (1994) J. Child Psychol. Psychiat. 35:877-900）。一卵性双子の研究は、症状において、二卵性双生児のわずか１０％と比較して、
７５％の一致を提示している（Bailey et al. (1998) Brain 121:889-905; Folstein and Rutter (1977) J. Child Psychol. Psychiat. 18:297-321; Ritvo et al. (1985) Am. J. Psychiat. 142:74-77）。これらの大きな相違は、障害に関与する１５を超える遺伝子
を予測しているいくつかのモデルをもって、多重遺伝子座が自閉症に関与することを示唆している（Folstein and Rosen-Sheidley (2001) Nat. Rev. Genet. 2:943-955; Lamb et al. (2000) Hum. Mol. Genet. 9:861-868; Risch et al. (1999) Am. J. Hum. Genet. 65:493-507）。

自閉症及び自閉症スペクトラム障害の特徴的な挙動は、乳児期（１８〜２４か月）に明らかになることがあるが、通常幼児期（２４か月〜６歳）まで明らかにはならない。一般に、自閉症又は自閉症スペクトラム障害を有しているか、又は有している疑いのある小児は、社会的及びコミュニケーションにおける遅延又は混乱を提示する。研究の結果、自閉症又は自閉症関連障害（例えば、アスペルガーの広汎性発達障害）の早期診断は、著しく良好な転帰と関連することがあるということがわかった。小児が診断されるのが早ければ早いほど、それだけ早く小児は治療介入の恩恵を受けることができる。

診断アッセイ
本発明は、自閉症又は自閉症スペクトラム障害を有しているか、又は発症する遺伝的素因を有していると対象を同定するのに有用な組成物及び方法を特徴とする。一般に、方法は、対象から単離したＪＡＲＩＤ２核酸配列、又は遺伝子試料の遺伝子変異を検出することを含む。このような変異は、ＪＡＲＩＤ２ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を調節する（例えば、時間的、空間的又はレベルを）コード配列又は調節配列中にある可能性がある。加えて又は代わりに、遺伝子変異は、遺伝子地図遺伝子座が自閉症又は自閉症スペクトラム障害と統計的に有意な関連を示している、何れか１つ又はそれ以上の６ｐ２３（Ｊａｒｉｄ２）の遺伝子地図遺伝子座で検出される。

一実施態様において、ＪＡＲＩＤ２における遺伝子変異を検出する前に、対象は自閉症又は自閉症スペクトラム障害を発症する危険な状態にあると同定される。危険が増大している対象には、自閉症又は自閉症スペクトラム障害の兄弟姉妹又は他の親類を有する対象、統合失調症を有していると診断された親類を有する対象、又は発達遅延若しくは発達異常（例えば、スピーチ及びコミュニケーション遅延、社会的遅延）を提示する対象が含まれる。

ある特定の実施態様において、ｒｓ７７６６９７３ ＳＮＰにおける多型を対象試料中
で測定する。他の実施態様において、ＪＡＲＩＤ２遺伝子における多型を対象試料中で測定する。他の実施態様において、ｒｓ６９１５３４４、ｒｓ１２５３０２０２、ｒｓ２２９５９５４、ｒｓ９４６４７７９、ｒｓ１１９６２７７６、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ９３９６５７８、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ９３７０８０９、ｒｓ３７５９、ｒｓ９５７３８７、ｒｓ７０７８３３、ｒｓ１３１９３４５７及びｒｓ９０９６２６ ＳＮＰの少なく
とも１つにおける多型を、対象において測定する。多型を測定するために標準方法を用いることができる。

生体試料には、組織試料（例えば、細胞試料（例えば、チークスワブ）、生検試料）並びに血液、唾液、涙、尿、精液及び射出精液を含む体液が含まれるが、これに限定されない。生体試料は、対象から、又は両親、兄弟姉妹、祖父母、おじ、おば、姪、甥、いとこを含むが、これに限定されない、対象の親類から単離されてよい。一実施態様において、ｒｓ７７６６９７３ ＳＮＰにおける特定の多型の存在は、自閉症又は自閉症スペクトラ
ム障害或いはそれらの症状の存在、又は発症する傾向を示す。他の実施態様において、ｒｓ６９１５３４４、ｒｓ１２５３０２０２、ｒｓ２２９５９５４、ｒｓ９４６４７７９、ｒｓ１１９６２７７６、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ９３９６５７８、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ９３７０８０９、ｒｓ３７５９、ｒｓ９５７３８７、ｒｓ７０７８３３、ｒｓ１３１９３４５７及びｒｓ９０９６２６ ＳＮＰの少なくとも１つにおける多型は、対象にお
ける自閉症又は自閉症スペクトラム障害の存在、又は自閉症又は自閉症スペクトラム障害を発症する傾向を示す。

何れか適切な方法を用いて、ＪＡＲＩＤ２、又は６ｐ２３の遺伝子地図遺伝子座（Ｊａｒｉｄ２）における１つ又はそれ以上の多型を検出することができる。遺伝子多型を検出することができる方法の１つを用いて、又はそれらの方法の組み合わせを用いて、本発明を成功裏に実施することができる。これらの方法には、直接配列決定法に基づいた方法、ハイブリダイゼーションに基づいた方法、プライマー伸長に基づいた方法、ライゲーションに基づいた方法、多型を含む分子の立体配座に基づいた方法、及び侵襲的切断に基づいた方法が含まれるが、これに限定されない。様々な方法を、均一系反応及び固体支持体上の反応を含む様々な反応形態において実施できる。これに限定されないが、放射性検出、発光検出、蛍光検出、時間分解蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光偏光法、ゲル電気泳動法、及び質量分析法を含む、様々な検出方法を、特許請求される本発明の遺伝子多型の検出に用いることができる。

多型は、直接配列決定法で検出できる。この手法では、ゲノムの関心領域をポリメラーゼ連鎖反応で増幅する。増幅したＰＣＲ産物は直接配列決定して、対象から得た生体試料中に、どの多型の対立遺伝子が存在するかを確認する。

ハイブリダイゼーションに基づいた遺伝子型同定方法には、マイクロアレイでの遺伝子型同定が含まれる。この手法の下で、ゲノムの関心領域（自閉症スペクトラム障害に関連する多型の対立遺伝子を含む領域）をポリメラーゼ連鎖反応で増幅して、固体支持体上に固定した標的配列に対するハイブリダイゼーションによって反応産物を解析する。固体支持体は、市販のマイクロアレイ（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨｕＳＮＰ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｒｒａｙ）を含んでいてもよい。ＰＣＲ産物をマイクロアレイとハイブリダイズし、
染色し、そして可視化する。様々な対立遺伝子特異的プローブに対するハイブリダイゼーションを測定し、このハイブリダイゼーションを使用してどの対立遺伝子が対象に存在するかを確認する。固体支持体に対するハイブリダイゼーションに基づいた代替手法は、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションアッセイ（ＤＡＳＨ）である。この手法では、定常条件下での特異的ハイブリダイゼーションの測定の代わりに、対立遺伝子特異的プローブにアニールされた様々なＰＣＲ産物間の融解温度の相違を測定する。異なる対立遺伝子間の塩基対相違は、アニールされた産物中にミスマッチを生じる。ミスマッチは、ミスマッチのないＤＮＡ２本鎖と比較した融解温度の低下をもたらす。したがって、対象に存在する特異的対立遺伝子は、対象特異的ＰＣＲ産物の融点から確認することができる。

一方の端に蛍光分子を有し、もう一方の端にクエンチャー分子を有する核酸分子である分子標識を使用して、多型の対立遺伝子を検出することもできる。分子標識は、蛍光分子がクエンチャーに近接して位置するようなステム−ループ構造を形成する。ステム−ループ構造が開裂するとき、例えば、分子標識が相補的配列にハイブリダイズするときにのみ、蛍光が観察される。分子標識は、特異的対立遺伝子に対応する核酸分子とのみハイブリダイズする（及び、したがって蛍光を発する）ように設計することができる。関心のあるゲノム領域を、対象から増幅して、変性してもよい。次いで、変性したＰＣＲ産物を適切な分子標識と混合する。次いで、特異的標的対立遺伝子とハイブリダイズするこれらの分子標識から得た蛍光シグナルを測定することにより、対象によって担持される様々な対立遺伝子を確認する。

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を使用して、どの対立遺伝子が特定の試料に存在するかを確認することもできる。５’ヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを介して複製された鋳型ＤＮＡとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを置換して、切断する。特異的対立遺伝子のアッセイは、蛍光レポーター及びクエンチャーを含むオリゴヌクレオチドを使用して開発することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、特異的対立遺伝子とのみハイブリダイズするように設計されている。これらのオリゴヌクレオチドの存在下でのＰＣＲ増幅は、対象ＤＮＡにおける特異的対立遺伝子の存在下でのみ蛍光シグナルを発生する。対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを使用して多型を検出してもよい。この場合、所定の対立遺伝子に特異的な増幅プライマーを設計する。従って、ＰＣＲ産物の存在は、対象における特定の対立遺伝子を示す。

プライマー伸長に基づいた方法を使用して特定の対立遺伝子の存在を確認してもよい。
関心のある領域を、対象から得た試料から増幅する。核酸プローブは、特異的多形対立遺伝子にすぐ近接して（例えば、ＳＮＰに隣接して）ハイブリダイズするように設計されている。特異的対立遺伝子に対応する塩基をプライマーの中に組み入れることになる反応を拡張させるために、ＤＮＡポリメラーゼを使用する。蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）又は蛍光標識されたデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の存在下で反応を実施できる。ｄｄＮＴＰの存在下で、単一標識ヌクレオチドがプローブに組み入れられる。各ｄｄＮＴＰを異なる蛍光プローブで標識してもよく、これにより、試料中に存在する特異的対立遺伝子の確認が可能になる。ｄＮＴＰ存在下で、プライマー伸長産物を、それぞれが特定の対立遺伝子と対応する１セットの標識核酸とさらにハイブリダイズする。次いで、対象の中に存在する特異的対立遺伝子をハイブリダイゼーションに基づいて確認する。代わりに、質量分析法を使用して、様々なプライマー伸長産物の存在を検出することができる。この場合、異なる対立遺伝子に対応する様々な産物を分子量によって識別することができるｄｄＮＴＰの存在下で、伸長を実施する。さらに、プライマー伸長は、ハプテン標識ヌクレオチドの存在下で実施できる。次いで、各ハプテンに対する特異的抗体を用いて、プライマー伸長産物中に組み入れられたハプテンを検出する。

様々な対立遺伝子の存在は、リガーゼアッセイを用いて確認できる。ＤＮＡリガーゼは、最初のＤＮＡ分子に直接隣接しているＤＮＡ分子の５’末端に対するＤＮＡ分子の３’末端のライゲーションを触媒する。１セットのＤＮＡプローブは、試料に存在する特異的対立遺伝子に応じて、ＤＮＡ分子の様々な組合せが隣接するように設計することができる。例えば、５’ヌクレオチドでそれぞれ違っている４つの異なるプローブを生成することができる。特異的対立遺伝子中に存在する５’ヌクレオチドを含むプローブのみが、隣接する３’ヌクレオチドに連結することになる。次いで、どの対立遺伝子が試料に存在するかを確認するために、連結した産物を測定する。

インベーダーアッセイを用いて様々な対立遺伝子を検出することもできる。インベーダアッセイは、特異的核酸構造で切断するエンドヌクレアーゼである、フラップエンドヌクレアーゼの活性に依存している。２つのプローブが産生される。インベーダプローブと称する第１のプローブは、対象から得た標的ＤＮＡの３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドである。第２のプローブは、標的ＤＮＡの５’末端に相補的である対立遺伝子に特異的なプローブであるが、さらに、ＳＮＰ対立遺伝子の３’側を過ぎて伸長させる。対立遺伝子特異的プローブには、特異的ＳＮＰ対立遺伝子に相補的な塩基が含まれる。標的ＤＮＡが特定の対立遺伝子を含む場合、インベーダプローブ及び対立遺伝子特異的プローブは、両方が標的ＤＮＡに結合して、フラップエンドヌクレアーゼによって認識されて切断される構造を形成する。標的が特異的対立遺伝子を含まない場合、プローブは、適切な構造を形成せず、フラップエンドヌクレアーゼは産物を切断しない。フラップエンドヌクレアーゼ切断が検出可能なシグナルを発生するようにプローブを設計することができる。例えば、対立遺伝子特異的プローブは、一方の末端に蛍光プローブを有し、もう一方の末端にクエンチャーを有することができる。フラップエンドヌクレアーゼ切断は、クエンチャーから離れたところで蛍光性成分を遊離し、蛍光シグナルを生成する。

多型は、様々な多型を担持している分子の立体配座、重量、又はサイズの相違に依存する方法を用いることによって検出することもできる。このような手法の一例は、１本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）である。ゲル電気泳動法における１本鎖ＤＮＡの移動度は、ＤＮＡ配列における非常にわずかな変化に影響される。これらの小さな変化は、１本鎖ＤＮＡの相対的に不安定な性質のために顕著な移動度シフトを生じる。これらの立体配座変化をゲル電気泳動法又はクロマトグラフィーによって検出してもよい。好ましくは、変性高速液体クロマトグラフィーを用いて立体配座変化を検出することができる。

自閉症の臨床診断基準
自閉症を検出できる行動試験又はコミュニケーション試験は１つも存在しないが、自閉症の診断に現在使用されているいくつかのスクリーニング手法が開発されている。１９７０年代の初めに開発されたＣＡＲＳ評価システム（小児自閉症評定尺度：Childhood Autism Rating Scale）は、観察される行動に基づいている。１５項目の尺度を使用して、専門
家が、小児の人との関係、身体の使い方、変化への適応、聞くことに対する反応、及び言語コミュニケーションを評価する。幼児の自閉症のためのチェックリスト（Checklist for Autism in Toddlers：ＣＨＡＴ）は、月齢１８か月での自閉症のスクリーニングに用いられている。それは、１８か月という幼い小児の自閉症を検出することができるかどうかを確かめるために１９９０年代の初めに開発された。このスクリーニング手段は、両親が準備する１セクション、小児の家庭医又は小児科医が準備するもう１セクションの２つのセクションを有する短いアンケートを使用する。自閉症スクリーニングアンケート（Autism Screening Questionnaire）は、コミュニケーション技能及び社会生活機能の評価の助けとなる４歳以上の小児で使用されている４０項目のスクリーニングスケールである。２歳児における自閉症のためのスクリーニングテスト（Screening Test for Autism in Two-Year Olds）は、直接的観察を使用して２歳未満の小児の行動特徴を研究する。自閉症を示すと思われる３技能領域、---遊び、運動模倣及び共同注意---を同定する。アスペルガー障害の診断基準には、以下が含まれる。１）以下のうちの少なくとも２つによって明示されるような、社会的相互作用における質的障害：複数の非言語的行動、つまり社会的相互作用を調節するための、見つめ合い、表情、身体姿勢、及び身振りなどの使用における顕著な障害；発達レベルに適した仲間関係を発展させることの欠如；楽しみ、興味又は達成を他の人と共有しようと自発的に求めることの欠如（例えば、興味の対象を他の人に見せたり、持って来たり、指摘したりすることの欠如により）；又は、社会的若しくは情緒的相互性の欠如、及び２）以下の少なくとも１つによって明示されるような、限定された反復性紋切り型行動、興味、及び活動：強度又は焦点のいずれかが異常な、１つ又はそれ以上の紋切り型で限定されたパターンの興味に対する没頭を包含していること；特異的で機能しない日課又は儀式に対する明らかに柔軟性がない執着；紋切り型反復性運動衒奇症（例えば、手、指をひらひら動かしたり、ねじったりすることや複雑な全身の動作）；又は対象の部位への執拗な没頭。アスペルガー障害は、社会的、職業的、又は他の重要な機能領域において、臨床的に有意な障害を引き起こす。言語（例えば、２歳までに使用される単一語、３歳までに使用されるコミュニケーションフレーズ）において臨床的に有意な一般的遅延は全くない。認知発達において、又は年相応の自助技能、順応行動（社会的相互作用以外に）、及び小児期の環境についての好奇心の発達において、臨床的に有意な遅延は全くない。基準は、別の特異的広汎性発達障害又は統合失調症に合致しない。

自閉症の行動に基づいた診断は困難であるので、特に若い患者が、診断の助けとなる遺伝学的スクリーニングアッセイを受けることには価値がある。さらに、このようなアッセイを使用して、自閉症の小児を持つ可能性のある両親に助言をすることができる。しかしながら、対象の自閉症に対する感受性、又はアスペルガー障害若しくはＰＤＤ−ＮＯＳなどの自閉症に関連する疾患の指標となる、利用可能な遺伝子マーカーは、本発明における開示まで全く存在しなかった。

本発明の文脈において用いられるような、自閉症には、自閉症の何れの形態も含まれる。このような疾患は、現在、自閉症、又はアスペルガー症候群及び広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を含む自閉症スペクトラム障害を意味する。

自閉症性障害のための「ＤＳＭ−ＩＶ」基準は、米国精神医学協会の精神障害の診断・統計の手引き（American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,4.sup.th edition,Washington,D.C.,199 pp 70-71）に述べられているものである。診断は、１、２及び３の３つの可能性グループから６つ又はそれ以上の診断基準が、グループ１から少なくとも２つ、グループ２から少なくとも１つ、及びグループ３から少なくとも１つの基準を含んで、存在することに基づいている。３グループは、３コア症状に対応する：
グループ１−−社会的相互作用における質的障害。
グループ２−−コミュニケーションにおける質的障害。
グループ３−−行動、興味及び活動の限定された反復性及び紋切り型パターン。

グループ１における４つの診断基準は、次のとおりである：（ｉ）複数の非言語的行動（例えば、社会的相互作用を調節するための見つめ合い、表情、身体姿勢及び態度）における顕著な障害；（ｉｉ）発達レベルに適した仲間関係を発展させることの不全；（ｉｉｉ）楽しみ、興味、又は達成を他の人と共有しようと自発的に求めることの欠如（例えば、興味の対象を見せたり、持って来たり、指摘したりすることの欠如）；及び（ｉｖ）社会的又は情緒的相互性の欠如。

グループ２における４つの診断基準は、次のとおりである：（ｉ）音声言語発達の遅延、又は全欠如。（態度又は身振りなどのコミュニケーションの代替方法を介して補おうとしない）；（ｉｉ）適切な会話だが、他人と会話を始めたり維持したりする能力における顕著な障害；（ｃ）言語又は特有の言語の紋切り型及び反復性使用；及び（ｉｖ）発達レベルに適した様々な自発的ごっこ遊び又は社会的模倣遊びの欠如。

グループ３における４つの診断基準は、次のとおりである：（ｉ）強度又は焦点のいずれかが異常な、１つ又はそれ以上の紋切り型で限定された興味のパターンへの没頭を包含していること；（ｉｉ）特異的で機能しない日課又は儀式に対する柔軟性がない執着、紋切り型で反復性の運動衒奇症（例えば、手、指をひらひら動かしたり、ねじったりすることや複雑な全身の動作）；及び（ｉｖ）対象の部位への執拗な没頭。

ＤＳＭ−ＩＶ基準を使用する自閉症の診断、その後の、自閉症診断面接改訂版（Autism Diagnostic Interview-Revised：ＡＤＩ−Ｒ）による診断の確認は、好結果をもたらす
。ＡＤＩ−Ｒは、自閉症を確証する周知の評価方法である（例えば、Lord et al. (1994) J. Autism Dev. Disord. 2:659-85; Le Couteur et al. (1989) J. Autism Dev. Disord. 19:363-87 を参照されたい）。

したがって、自閉症の臨床診断基準を使用して、ＪＡＲＩＤ２核酸分子における遺伝子変異に関する遺伝子検査の恩恵を受け得る対象を選択することができる。必要に応じて、ＪＡＲＩＤ２核酸分子における遺伝子変異に関する遺伝子検査の結果を、単独で又は診断基準と組み合わせて使用して、自閉症又は自閉症スペクトラム障害を有しているか又は発症する傾向を有している対象を同定する。

診断キット
本発明は、自閉症又は自閉症スペクトラム障害或いはこのような障害を発症する傾向を診断するための、又は自閉症又は自閉症スペクトラム障害の治療のために治療介入が必要な対象を同定するためのキットを提供する。一実施態様において、キットには、自閉症関連の遺伝子多型を検出するのに有用な少なくとも１種の薬剤を含む組成物が含まれる。別の実施態様において、キットには、プローブを直接配列決定法又はプライマー伸長アッセイ用のプライマーとして使用できるように、自閉症関連遺伝子多型に隣接する部位に結合するプローブ核酸が含まれる。他の実施態様において、キットには、自閉症に関連する多型を検出するアッセイで使用できる分子標識が含まれる。さらなる実施態様において、キットには、自閉症に関連する多型を検出するために使用できるマイクロアレイが含まれる。さらにまた別の実施態様において、キットには、自閉症において発現が増加するポリペプチド又はポリヌクレオチドに結合する少なくとも１種の薬剤を含む組成物が含まれる。また別の実施態様において、本発明は、自閉症においてその発現が変化するような核酸分子を結合する薬剤を含むキットを提供する。ある実施態様において、キットは、結合剤を収容する滅菌容器を含むが、このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、又は、当該技術分野で公知の他の適切な容器形状であってよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔又は医薬品を保持するのに適している他の材料から作ることができる。

必要に応じて、キットは、自閉症を診断するキットを使用するための説明書と共に提供される。その説明書には、一般に、対象が自閉症を有しているか又は自閉症を発症する傾向を有していると診断するための組成物の使用についての情報が含まれる。他の実施態様において、説明書には、以下の少なくとも１つが含まれる：結合剤の説明、警告、効能、禁忌、動物実験データ、臨床研究データ、及び／又は参照文献。説明書は、容器上に直接（存在するとき）、又は容器に貼られたラベルとして、又は容器の中若しくは容器と共に提供される個別のシート、パンフレット、カード又はフォルダとして、印刷されていてもよい。

以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング及び治療の方法を如何に作成及び使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために記述されており、本発明者らが自己の発明とみなすものの範囲を限定することを意図していない。

実施例１：自閉症におけるゲノムワイド関連解析。
自閉症の高分解能遺伝子研究のために、広く研究された自閉症遺伝資源交換（Autism Genetic Resource Exchange：ＡＧＲＥ）及び米国国立精神衛生研究所（ＮＩＭＨ）のリポジトリからの多発性罹患者(多発)(multiple affected individuals(multiplex)）を含む
家系を選択した。自閉症スペクトラム障害における表現型の多様性は広範囲に及ぶが、第１次スクリーニングにおいて、少なくとも１人の発端者（proband）が自閉症の診断のた
めのＡＤＩＲ基準に合致している家系を選択し、同一核家族におけるさらなる同胞種を含めた。

２つの供給源由来の家系と試料とを遺伝子関連スクリーニング用に組み合わせた。自閉症遺伝資源交換（ＡＧＲＥ）試料には、５００，０００を超える一塩基多型（「ＳＮＰ」）を含む、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ） ５．０プラットフォームにおい
てＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで遺伝子型が同定された、ＡＧＲＥコレクション中の
７８０を超える自閉症多発家系由来の約３，０００個体が含まれていた。ＮＩＭＨ試料には、ＡＧＲＥ試料において遺伝子型が同定されたのと同一のＳＮＰマーカーを含むアフィメトリクス ５．０及び５００ＫプラットフォームにおいてJohns Hopkins Center for Complex Disease Genomicsで遺伝子型が同定された、３４１の多発性核家族（うち２５８
はＡＧＲＥ試料に無関係であった）由来の合計１，２３３個体が含まれていた。

技術的な遺伝子型同定人工物は偽陽性知見を生じる可能性があるので、混合の前に各データセットを注意深く別々に選別し、解析用に最も可能性の高い遺伝子型の品質を確保した。最高品質のデータのためのχ^２値の分布を調査し、強力なＳＮＰセットを同定するように設計された一連の品質管理（ＱＣ）フィルターを使用したが、このフィルターには各ＳＮＰのデータ完全性、ＳＮＰ当たり及び家系当たりのメンデルの法則のエラー（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｅｒｒｏｒ）、及び対立遺伝子頻度及び欠測データに応じた関連統計量の
インフレーションの慎重な評価が含まれていた。両センターで３２４個体の遺伝子型を同定したので、この取組みを検証するために一致チェックを実施した。１つの試料混乱を除外した後、ＪＨＵで５００Ｋにおいて分類した試料とＢｒｏａｄで５．０において分類した試料との間で９９、７％、及び両方の場所で５．０アレイにおいて実施した試料間で９９．９％の２センター間全遺伝子型一致を得た。１，０３１の核家族（両親がいるのは８５６）及び合計１，５５３の罹患子孫からなる総合データセットを、遺伝子解析のために用いた。これらのデータは、２００７年１０月に公開され、ＡＧＲＥ及びＮＩＭＨから直接入手可能である。

伝達不平衡試験（ＴＤＴ）には集団層別化による偏りがないので、全家系データセットの品質管理を通過する全ＳＮＰにわたるＴＤＴを、関連解析に使用した。関連解析を、ＰＬＩＮＫ（Purcellet al. 2007）において実施した。パーミュテーション（Ｐ＜２．５×１０^−７）と有効試験数の推定値（Ｐ＜３．４×１０^−７）との両方を使用してゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値を推定し、より保存的なものを使用した。Ｐ＜２．５×１０^−７でのゲノムワイドな有意性についての基準に合致したＳＮＰは、全く無かった。しかしながら、全統計インフレーション（）の欠如にもかかわらず、Ｐ＜１０^−５（観察６対予想１）及びＰ＜１０^−４（観察３０対予想１５）での過度の関連独立領域が観察されたが、このことは、自閉症における共通の変異体は存在するが、最初のスキャンは、それらを決定的に同定するのに十分な検出力を有していなかったということを示唆する（図１）。

胚形成、特に神経のチューブ形成において機能する核タンパクをコードするマウスｊｕｍｏｎｊｉ遺伝子のオーソログであるＪＡＲＩＤ２中の染色体６ｐ２３（ｒｓ７７６６９７３、Ｐ＝６．８×１０^−７）で、最も強い関連が見出された。スキャン中に、６３１カウントが伝達され、８１１カウントが伝達されず、ｒｓ７７６６９７３のマイナー対立遺伝子に対するオッズ比０．７８（Ｐ値６．８×１０^−７）を生じた。

「実施例２：自閉症家系における統合失調症関連遺伝子の解析
統合失調症及び自閉症は、共通の遺伝的背景を共有する公知の２つの精神疾患である（Crespi et al. 2009）ので、統合失調症と明白に結びつけられる５つの遺伝子（ＤＴＮＢＰ１、ＮＲＧ１、ＤＡＯＡ、ＤＩＳＣ１及びＪＡＲＩＤ２）を、自閉症の小児を有する８５６核家族を使用して行った家系に基づいた関連解析、及び従来のＧＷＡＳ研究から入手可能であった５遺伝子を網羅する４４１ＳＮＰを使用して、自閉症における役割に関して評価した。」

９０８家系は、Children's Hospital of Philadelphia（ＣＨＯＰ）でＩｌｌｕｍｉｎ
ａ５５０Ｋを用いて遺伝子型が同定されているＡＧＲＥコレクション（Geschwind et al, 2001）から入手可能だった。自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）に従って、この試料
には、１８１６人の創始者、自閉症診断を有する１５１９人の小児（１２１９人の男性及び３００人の女性；男性：女性 性比＝４．０６）が含まれる。自閉症の同種定義の使用（より広範囲の自閉症スペクトラム障害表現型定義と比較した）は、複雑な疾患研究における威力を向上させる１つの手段である。小児に関する除外基準には、他の広汎性発達障害に関する、精神障害の診断と統計の手引き（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders）第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）基準によって定義されているような、レット
症候群及び小児崩壊性障害の診断、公知の遺伝子条件の存在、重大な頭部損傷若しくは神経疾患の病歴、又は著しい感覚障害若しくは運動障害が含まれていた。

ＰＥＤＳＴＡＴＳ（Wigginton and Abecasis,2005）を使用して、ＳＮＰ当たり及び家系当たりのメンデルの法則の矛盾点、並びにＳＮＰ当たり及び個人当たりの欠損している遺伝子型頻度について遺伝子型データをチェックした。５％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するＳＮＰを除外して、直接検定（Wigginton et al. 2005）を使用して創始者におけるハーディーワインベルク平衡（ＨＷＥ）をチェックした。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ（Barret et al. 2005）は、連鎖不平衡係数Ｄ’及びｒ２を推定して、グラフ表示を提供するために使用した。

８５６家系から、１７１２人の創始者及び１４７９人の罹患した小児を含む、３１９０人が残った（男性１１８９人及び女性２８９人；男性：女性 性比＝４．１１）。５遺伝子を網羅するＩｌｌｕｍｉｎａ ５５０Ｋアレイにおいて利用可能な４８５ＳＮＰから４４１が、その中にＪＡＲＩＤ２遺伝子領域内に９１が配置されていたＱＣを通過した。

付加的な伝達モデル下でＵＮＰＨＡＳＥＤ（Dudbridge 2003、2008）バージョン３．０
．１２において実行されたように、家系不平衡試験（Pedigree Disequilibrium Test：ＰＤＴ）（Martin et al. 2000）方法を使用してＳＮＰ関連解析を行って、１，０００パーミュテーションに基づいてｐ値を推定した。

多重試験を説明するために、公称Ｐ値（５％）を試験数で割って、この数値を補正してある（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正）。この補正は試験の独立性を仮定する。連鎖不平衡におけるＳＮＰの場合には、独立性仮定が破られて、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正はあまりに保守的になり過ぎる。ＳＮＰに関する相関行列のスペクトル分解に基づいた独立試験の有効数を推定する方法が提案されている（ＭａｔＳｐＤ）（Li and Ji、2005）。この方法論は、全ＳＮＰの連鎖不平衡パターンを考慮に入れて、このセットをＳＮＰの「有効」最小数まで減少する。本データにおいて、４４１ＳＮＰセットを、０．０５公称Ｐ値を０．０００２３補正有意性閾値に変換した２１７．７５５３ＳＮＰまで減少した。次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ほど保守的でないＳｉｄａｋ補正（Sidak 1968、1971）をＵＮＰＨＡＳＥＤから得たＰ値に加えて、各マーカーに対する補正Ｐ値（Ｐ_{ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ}）を得た。

有意に関連するＳＮＰを有する遺伝子において、特定のＳＮＰでのリスク対立遺伝子が領域における関連シグナルを説明するかどうかを試験する条件付き解析を行った。領域における関連シグナルが、１つ又はそれ以上の単一ＳＮＰによって稼働する場合、これの／これらの影響に対する条件付けは、残りのＳＮＰの関連の証拠を全て除去すると予想された。この解析をＵＮＰＨＡＳＥＤにおいて「−条件」オプションを使用して行った。

ＪＡＲＩＤ２遺伝子に位置するＳＮＰの相関試験の結果を図２に、及びそれとは別に表１には、そのＭＡＦ及び関連するオッズ比（ＯＲ）の説明と共に示す。Ｐ値を多重試験用に調整したとき、２つのＳＮＰは有意なまま、つまりｒｓ６４５９４０４（ＯＲ＝１．２１、Ｐ_{ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ}＝０．００８）及びｒｓ６９２１５０２（ＯＲ＝０．８１、Ｐ_{ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ}＝０．０１３）であり、他の２つは境界線、つまり、ｒｓ６９１５３４４（ＯＲ＝１．２１、Ｐ_{ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ}＝０．０６９）及びｒｓ１３１９３４５７（ＯＲ＝１．４３、Ｐ_{ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ}＝０．０６７）で、全てＪＡＲＩＤ２の同一連鎖不平衡（ＬＤ）領域中であった（図５）。１４のＳＮＰが公称レベルで関連し、１つを除いて全てが、強いＬＤを有する同一５’領域、ｒｓ７７６６９７３を含む同一領域に属していた（図３）。ＪＡＲＩＤ２においてＰ＜０．０５を有するこれらのＳＮＰで、遺伝子において最も強く結合するマーカーであるｒｓ６４５９４０４に対する条件付け試験を行って、このＳＮＰがこの遺伝子において単独で関連シグナルを説明するかどうかテストした。ＳＮＰｒｓ６９２１５０２とは別の、有意に関連した（Ｐ_{ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ}＜０．０５）ｒｓ６４５９４０４を有するＳＮＰは、公称レベル（Ｐ＝１．００）ではもはや有意ではなかった。これは、これらが同一の情報をもたらすことを意味するこれらの強いＬＤ（Ｄ’とｒ２が１つに近い）によって説明される。ＳＮＰｒｓ１３１９３４５７は、ｒｓ１２５３０２０２、ｒｓ２２９５９５４、ｒｓ１１９６２７７６及びｒｓ９５７３８７として、０．０１〜０．０５の範囲に及ぶｐ値を有する、より劣っている範囲にさらに関連していた（Ｐ＝０．００２）。これらのＳＮＰをｒｓ６４５９４０４及びｒｓ１３１９３４５７に関して条件付きで試験したとき、ｒｓ９５７３８７以外は、公称上有意なままではなかった（Ｐ＝０．００９７）。これらの３マーカーは強いＬＤにあるが、本試料において統計的に識別することはできない。１つの説明は、原因変異体は、これらのマーカーを有する強いＬＤにおいて分類されない変異体であるということであろう。３つのＳＮＰのハプロタイプ解析によって、この観察されない有害変異体の関連の評価が可能になった。ＵＮＰＨＡＳＥＤを使用すると、３マーカーハプロタイプは、（一度に１ＳＮＰを考えるときより強い）Ｐ＝２．５×１０^−７を有する非常に強い関連を示した。これらの結果は、自閉症、及び特に前の実施例由来のｒｓ７７６６９５３を含む遺伝子の５’領域における強いＬＤ領域でＪＡＲＩＤ２の関連を再現する。

材料及び方法
以下の方法及び材料を使用して上記の結果を得た。

試料及び遺伝子型同定
第１次試料はＡＧＲＥ及びＮＩＭＨリポジトリ由来である。アフィメトリクス技術を用いた複製には、ＮＩＭＨ対照、自閉症コンソーシアム（Autism Consortium）のメンバー
が収集した家系、及びモントリオール（Montreal）が確認した家系が含まれていた。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ技術を用いた複製には、自閉症ゲノムプロジェクト（Autism Genome Project）、フィンランド人、及び自閉症コンソーシアム（Autism Consortium）の研究者が収集した家系のイラン人サブセットが含まれていた。各試料コレクション、遺伝子型同定、及び品質管理の方法の確認についての詳細は本明細書中に提供されている。

連鎖解析及び関連解析
ＭＥＲＬＩＮ／ＭＩＮＸ（ｒ^２＜０．１）（２３）のクラスターオプションを使用して剪定した常染色体ＳＮＰセット及び染色体Ｘセット（６７０ＳＮＰ）で連鎖解析を行って、１６，５８１の独立マーカーを得た。代替ＳＮＰを選択することにより、確認解析を非重複データセットで実施した。

ＰＬＩＮＫ（２４）において関連解析を実施した。基本的な相関試験は、伝達不平衡試験（ＴＤＴ）であった。また、対照とあまり一致しなかった症例を除いた後、多次元尺度構成法（λ＜１．１）に基づいた対立遺伝子の関連によって、特別の症例対対照の解析を実施した。ＴＤＴと症例‐対照試験の組合せを、式：Ｚｍｅｔａ＝（Σｅｘｐ−Σｏｂｓ）／√Σｖａｒによる予想対立遺伝子及び観察対立遺伝子カウントを使用して実施した。
統計量（Ｚ_{ＡＧＲＥ／ＮＩＭＨ}＋Ｚ_{ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ}）／√^２を使用して、ＡＧＲＥ／ＮＩＭＨ及び複製データのメタ解析を実施した。セットに基づいたＴＤＴを使用してＰＬＩＮＫにおいて遺伝子セット解析を実施した。補定（ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ）に基づいた関連を、参照パネル及び情報スコア＞０．８としてＨａｐＭａｐＣＥＵ親試料を使用してｐｒｏｘｙ−ｔｄｔコマンドでＰＬＩＮＫにおいて実施した。ＰＬＩＮＫ ｈａｐ−
ｔｄｔにおいて実行したように、５−ＳＮＰスライディングウィンドウを使用して連鎖領域におけるハプロタイプ解析を実施した。

第１次研究試料
この研究で使用した全試料は、個人、並びに米国及び関連国際地域のそれぞれの治験審査委員会によって承認された治験から得た。全成人研究参加者からインフォームドコンセントを得、年齢１８歳未満の小児に関しては、両親又は保護者の同意及び小児の同意の両方を得た。

自閉症遺伝資源交換（ＡＧＲＥ）は、遺伝子研究のために入手可能な、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有している多発家系由来のＤＮＡ及び表現型データのコレクションを管理する。自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）による自閉症の基準に合致している少なくとも１人の小児を有する家系を選択して、８０１家系由来の個人に対して遺伝子型を同定したが、第２の罹患児は、自閉症のＡＧＲＥ分類、広域スペクトラム（ＰＤＤ−ＮＯＳ及びアスペルガー症候群を含む広汎性発達障害のスペクトラムに沿った障害のパターン）又は自閉症であるとは言えない（Not Quite Autism）（ＮＱＡ：社会性、コミュニケーション、及び／又は行動ドメインのいくらか又は全てが自閉症診断基準に合致していることからわずか１項目離れていて「発病年齢」の基準に合致する個人、又は全ドメインが診断基準に合致するが、「発病年齢」の基準に合致しない個人）を有していた。調和させることができないＡＤＩ−Ｒ及びＡＤＯＳによる疾患状態の分類が広く異なる発端者を除外した。公知の染色体異常を有している家系（核型が入手可能であった）、及び遺伝子データに矛盾を有する（過度のメンデルの法則の分離欠陥を発生させる、又は全アレイデータとの性別及び試料同一性をチェックするために使用する２４ＳＮＰの試験パネルに遺伝子型同定不全を示す）家系も除外した。これらの試料の自己申告による人種／民族性は、白人６９％、スペイン系／ラテン系１２％、不明１０％、混血５％、アジア人及びアフリカ系アメリカ人それぞれ２．５％、ハワイ原住民／南太平洋の島民及びアメリカインディアン／アラスカ原住民１％未満である。

ＮＩＭＨ Ａｕｔｉｓｍ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅは、ＡＳＤを有している多発家系及び単発家系由来のＤＮＡコレクションを保存している。３４１核家族由来の個人の遺伝子型を同定した：これらのうち２５８人はＡＧＲＥデータセットから独立していて、ＡＤＩ−Ｒによる自閉症の基準に合致する少なくとも１人の小児を有し、そして第２の小児は上記のＡＧＲＥデータセットに関して記載されたものと同一の基準を使用して罹患しているとみなされた。公知の染色体異常及び過度の非メンデル遺伝を含む同様の除外基準を使用した。これらの試料の自己申告による人種／民族性は、白人８３％、スペイン系４％、不明２％、混血７％、アジア系３％、及びアフリカ系アメリカ人１％である。

第１次研究試料：第１次スクリーニング用混合データセット
遺伝子型を同定する両センター（２６、２７）で、Ｂｉｒｄｓｅｅｄアルゴリズムを遺伝子型判定に使用した。両センターで３２４人に対して遺伝子型を同定したので、一致チェックを実施した。１試料は、２センター間に実質的な相違を示したが、過度のメンデルの法則のエラーを示さなかった。このことは、同一試料として同定した異なる同胞種に対して各センターが遺伝子型を同定したことに試料混乱が起きたことを示している。この試料を除くと、２センター間の全体的な遺伝子型一致は９９．７２％だった。

データを混合する前に、カイ平方値の分布を調査し、強力なＳＮＰセットを同定するように設計した一連の品質管理（ＱＣ）フィルターを使用した。ＡＧＲＥ遺伝子型を完全性９８％及びＭＥ１０未満まで選別することは、ＭＡＦ（マイナー対立遺伝子頻度）＞０．０５を有するＳＮＰのカイ２乗分布を人為的に膨張させたＳＮＰを除去するのに十分であることが見出された。ＭＡＦ＜０．０５に関しては、マイナー対立遺伝子（ＯＲ＜１）の伝達下での、もっぱらＳＮＰの過度の強さのために、非常に大きなインフレーション（λ＝１．１７）を観察した。同一フィルターが、マイナー対立遺伝子（λ＝１．０４）の過度の伝達を有するＳＮＰで高品質の結果を得た一方、非常に厳密な選別が、ＯＲ＜１（欠測データ＜．００５）を有する、よりまれなＳＮＰのために必要だった。これは、ＴＤＴにおいて十分に立証された偏りに基づき予想外ではなかった：欠測データがヘテロ接合体又はまれなホモ接合体に対して優先的に偏っている場合、共通の対立遺伝子の有意で人為的な過度の伝達が予想される（２８、２９）。比較可能な品質を達成するために、完全性９６％及びＭＥ４未満でＮＩＭＨデータセットを選別した。組合せデータセット用最終ＱＱプロットを図５に示すが、λ約１．０３を有している。１，０３１家系からなる（両親がいるのは８５６）組合せデータセット、及び合計１，５５３人の罹患子孫を、関連試験に用いた。

連鎖解析のために、組合せＡＧＲＥ／ＮＩＭＨデータセットをChildren's Hospital of Philadelphia（ＣＨＯＰ）で作製し、ＡＧＲＥから入手可能なＩｌｌｕｍｉｎａ ５５０Ｋ遺伝子型データとさらに混合し、約３００核家族（１，４９９の試料）を追加した。ＡＧＲＥ／ＮＩＭＨデータセットとＣＨＯＰデータセット（２，２８２試料）との間の広範囲に重複している試料を使用して、非常に高品質な連鎖解析用ＳＮＰセットを選択した。
具体的には、ＳＮＰは、アフィメトリクス ５００Ｋ／５．０プラットフォーム及びＩｌ
ｌｕｍｉｎａ ５５０Ｋプラットフォームの両方のプラットフォーム全域で＞９９．５％
一致を有する必要があった。ＳＮＰは、ＭＡＦ＞０．２、欠測データ＜１％、ハーディーワインベルクＰ＞０．０１、及びわずか１ＭＥにさらに限定された。これにより、約３６，０００の優れた品質のＳＮＰが残った。常染色体ＳＮＰに関しては、ｒ^２＞０．１を有するＳＮＰを除去するために、ＰＬＩＮＫを使用してＳＮＰをさらに剪定し、１６，３１１ＳＮＰを得た。

複製試料
ＮＩＭＨ対照試料。
もう１つの研究のために、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍでアフィメトリクス ５００Ｋプラットフォームにおいて、ＮＩＭＨ遺伝子リポジトリから得た対照の遺伝子型を同定した。これらのうち、１，４９４は、我々の試料と良く一致し、この研究の症例及び両親と比較するための対照として使用した。

モントリオール試料。
両親と共に自閉症スペクトラム障害と診断された対象を広汎性発達障害（ＰＤＤ）の診断を専門とするクリニック、再適応センター、並びにモントリオール及びケベック都市圏（カナダ）の専門学校で集めた（３１）。ＡＳＤの評価における児童精神科及び心理学の専門家がＡＳＤを有する対象を診断した。精神障害の診断と統計の手引き（ＤＳＭ）基準に基づいた評価には、自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）（２５）及び自閉症診断観察スケジュール（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｄｕｌｅ）（ＡＤＯＳ）（３２）の使用が含まれていた。ＡＳＤ診断用の新たなスクリーニング手段として、ＡＤＩ−Ｒに由来する自閉症スクリーニングアンケート（Ａｕｔｉｓｍ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）が、完成した（３３）。さらに、ＰＤＤの児童精神科医の専門家が、全発端者カルテを再評価して診断を確認し、何れかの共依存障害を有している対象を除外した。除外基準は次のとおりだった：（１）推定される精神年齢＜１８か月、（２）レット症候群又は小児崩壊性障害の診断、及び（３）次のものを含む何れかの精神医学及び神経学的条件の証拠：出生時無酸素症、妊娠中の風疹、脆弱Ｘ症候群、脳炎、フェニルケトン尿症、結節性硬化症、トゥレット症候群、及びウェスト症候群。これらの条件を有している対象を、親の面接及びカルテ評価に基づいて除外した。しかしながら、発達性言語障害（semantic-pragmatic disorder）、（ＰＤＤ
とそれとの大きな重複のために）、注意欠陥多動性障害（発達の間にＡＳＤを有している多くの対象に見られる）、及び突発性てんかん（ＡＳＤのコア症候群に関連する）が同時に起こる診断を有する参加者は、研究のための資格を有していた。

Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ ＥＤＳＰ家系試料。
非常に不一致な同胞種対連鎖研究のために、１人又はそれ以上の自閉症の小児と少なくとも１人の自閉症でない１６歳以上の子供を有している家系を確認した。親のサポートグループ及び患者支援グループ、パンフレット、ニューズレター並びに研究ウェブサイトで接触して、マサチューセッツ州及び周辺の州で募集を行った。両親は自分の小児についての面接を受け、自閉症でない小児は自分自身についての面接を受けた。通常発端者の母である報告者／介護者は、自閉症診断手段改訂版（Autism Diagnostic Instrument-Revised）（ＡＤＩ−Ｒ）を使用して面接を受け、４〜５歳での自閉症の診断を確認した（２５、３４）。家系には、罹患児が自閉症性障害のための精神障害の診断と統計の手引きＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）基準に合致し、自閉症ではないその同胞種（１６歳以上）が（Ｍ−ＰＡＳ−Ｒ）、実用言語尺度（ＰＬＳ）、及び友情面接（Friendship Interview）（３５、３６）で評価したより広範囲の自閉症表現型特質を全く示さなかった場合が含まれていた。発端者が脆弱Ｘ症候群又は全ＣＮＳ損傷などの自閉症に関連する病状を有していた場合、又は発端者が４歳未満であった場合は、より若い年齢での診断に不確実な可能性があるために発端者を除外した。２９家系が、研究のための適格基準に合致し、解析用最終サンプルに含まれた。

高機能自閉症家系試料。
以前から自閉症又はアスペルガー症候群と診断されていた罹患児が、精神遅滞の範囲を超える知的機能レベル（つまり全尺度、言葉の及びパフォーマンスのＩＱ＞７０）を有し、暦年齢６〜２１歳で、重大な医学的又は神経学的障害（脆弱Ｘ症候群及び結節性硬化症を含む）がなかった場合の家系が含まれていた。McLean病院の急性収容治療（Acute Residential Treatment）（ＡＲＴ）プログラム、並びに外来小児患者及び思春期サービスを
介して、さらには関連病院及びクリニックを介して家系を確認し、集めた。パンフレット及びウェブサイトも利用した。３３家系（参加者１３３人）を研究に登録した。参加は任意だった。

ＭＧＨ−フィンランド共同比較研究。
高機能自閉症（ＨＦＡ）又はアスペルガー症候群（ＡＳ）の診断を有する５８人全てをフィンランドで集めた。２００３年Oulu大学病院で８歳〜１５歳の５２人の小児及び若者を患者記録から同定した。これらの小児及び若者をＯｕｌｕ大学病院でＨＦＡ／ＡＳに関して評価した。さらに、６人（３人の少年、３人の少女）の１１歳の小児を、２００１年に行われた疫学的研究から集めた（３７）。

参加者は全員、ウェクスラー児童知能検査−改訂第３版を用いて測定されたフルスケールＩＱスコア８０以上を有していた（３８）。さらに、他の発達障害（例えば、不全失語症、脆弱Ｘ症候群）と診断された小児対象は１人もいなかった。自閉症診断面接改訂版及び自閉症診断観察スケジュールの実施によってＨＦＡ／ＡＳの臨床診断を確認した。ＩＣＤ−１０診断基準に従って、ＨＦＡ／ＡＳを有している参加者５８人のうち３５人は、ＡＳのための診断基準に合致し、２１人はＨＦＡのための診断基準に合致した（３９）。２人の参加者が、ＰＤＤ−ＮＯＳの診断基準に合致したが、彼らはＨＦＡ又はＡＳを有している小児に関する我々の試料とは異なりそれほど重度でない症状を現していたために、これらの参加者を除外した。

ボストン小児病院（Children's Hospital Boston）の試料。
ＡＳＤの臨床診断のカルテを有する発端者をボストン小児病院で集めた。参加するためには、月齢が２４か月を超え、少なくとも１人の実の親又は罹患した入手可能な同胞種を有していなければならなかった。彼らに代謝障害若しくは慢性全身性疾患、後天性発達障害（例えば、出生時仮死、外傷関連の損傷及び髄膜炎など）、又は脳性麻痺の何れかを有していた場合、対象を除外した。参加者全員にインフォームドコンセントを提供し、自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）、自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）及び認識状態を評価する他の手段を含む、表現型バッテリー（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂａｔｔｅｒｙ）を実施した。臨床診断を有する対象の７５％は、ＡＤＩ−Ｒ及びＡＤＯＳの両方でＡＳＤのための厳密な研究基準に合致した。さらに、完全な家族歴及び病歴を得た。

自閉症についてのホモ接合性マッピング共同研究（ＨＭＣＡ）用試料。
いとこ結婚、及び精神遅滞（ＭＲ）の有無にかかわらず自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）に罹患している小児を有する家系が、ＨＭＣＡの複数の共同研究者によって集められた。自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）及び自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩＲ）に熟練しており、ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ基準及び小児自閉症評定尺度（ＣＡＲＳ）に従って診断法を作成した児童精神科医（Nahit M.Mukaddes）がイスタンブール出身の患者を評価した。Samira Al-Saadが、クウェート出身の患者をクウェート自閉症センター（Kuwait Centre for Autism）から登録した。サウジアラビアのジッダ（Ｊｅｄｄａｈ）で、発達小児科医（Soher Balkhy）及び小児神経科医（Generoso Gascon)の両者が患者を評価したが、診断法はＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ診断基準に基づいていた。パキスタンのラホールで、ＡＤＯＳ及びＡＤＩ−Ｒに熟練している神経科医（Asif Hashmi）がＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ基準を
使用して患者を診断した。ほとんどの設定で、患者は第３次臨床センターから登録された。これらの患者は、指定されたとき、身体的診察、内科及び神経学的病歴、脆弱Ｘ試験、並びに他の遺伝子及び代謝的試験を含む医療神経内科評価（ｃａｒｅ ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）の標準型を有していた。脳奇形が疑われるか、又はてんかんが存在した患者のためにＭＲＩを入手した。さらに、ＩＱスコア（通常Ｓｔａｎｆｏｒｄ−Ｂｉｎｅｔから）及び順応行動手段を、患者の既存の診療記録から入手した。地域の学際的チームとの共同作業で、ボストン臨床チームが最も参考になる家系で第２次評価を行った。ボストンチームの臨床メンバーには、発達心理学者（Janice Ware、Elaine LeClaire、Robert M.Joseph）、小児神経科医（Ganesh H. Mochida、Anna Poduri）、臨
床遺伝学者（Wen-Han Tan）、及び神経精神病医（Eric M.Morrow）が含まれていた。患者及び家系における現在及び過去の自閉症症状、認識及び適応機能、並びに神経学的及び身体的形態の状態を包括的に説明するように第２次評価バッテリーを設計した。第２次評価には、ＡＤＩ−Ｒ信頼性が高い試験官によってＡＤＩ−Ｒと同等での調査を実施した神経学的検査、遺伝子異常形態学検査、ＣＡＲＳ、社会的コミュニケーションアンケート（ＳＣＱ）；ＡＤＯＳ（通常モジュール１）；Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度、第２版（ＶＡＢ Ｓ−ＩＩ）；Ｋａｕｆｍａｎ簡潔な知能検査（第２版（ＫＢＩＴ−ＩＩ）が含ま
れていた。記録保管を目的として、ＡＤＯＳ評価を録画し、異常形態学知見の写真をとった。

ＡＧＰ試料。
個体は、典型的に自閉症の症状の３評価、すなわちＡＤＩ−Ｒ、ＡＤＯＳ、及び臨床評価のうち、少なくとも２つを受けた。１，４４３家系から１，６７９人の患者のうち、９６６人は、ＡＤＩ−Ｒ及びＡＤＯＳの自閉症についての基準に合致していて、これらの大部分は自閉症の臨床評価も有していた；１６０人の患者が、２つの診断手段（ＡＤＩ−Ｒ、ＡＤＯＳ）のうち、１つの自閉症についての基準に合致したが、別の測定手段の情報を欠いていた；そして、５５３の人が、１つの又は両方の測定手段のスペクトラム障害についての基準に合致した。単一性及び多発家系の両方から患者を集めたが、この試料の７１％は多発家系出身であった。大多数の家系は、ヨーロッパの家系（８３％）だった。

フィンランド人の自閉症家系試料。
大学及び中央病院を介して家系を集めた。別記するように（４０）経験を積んだ小児神経科医が、詳細な臨床及び健康診断を実施した。診断は、ＩＣＤ−１０（３９）及びＤＳＭ−ＩＶ（４１）診断術後体系に基づいた。公知の関連する病状又は染色体異常を有している家系を研究から除外した。合計１０６家系には、遺伝子型データが入手可能な４００個人が含まれていた。これらのうち、１１１人は乳児自閉症と診断され、１３人はアスペルガー症候群と診断された。父親がトルコ人だった１家系を除いて、全家系がフィンランド人だった。

イランの３人組試料。
この研究の適格な参加者は、自閉症性障害、アスペルガー症候群及び特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）の症例を含むＡＳＤに罹患した少なくとも１人の小児がいるイラン人家系だった。イラン出身の８０家系（２８２個人）を確認し評価した。２００４年の９０，０００人を超えるテヘラン出身の未就学児のスクリーニング及び診断試験によりこの試料を確認した。ＡＤＩ−Ｒ及びＡＤＯＳによるＤＳＭ−ＩＶ基準に従って、小児の診断法を作成した。異常な核型及び異型症の特徴を有する患者を除外した。大部分の家系は、父母子の３人家族だったが、一部は１人を超える罹患児がいた。罹患した実の同胞種を全員、同一の診断ツールで評価した。イラン出身の８０家系（２８２個人）を得て確認した。

アフィメトリクス遺伝子型同定
標準的なプロトコールを用いて、Broad InstituteのＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍでアフィメトリクス５．０チップ上でＡＧＲＥ試料の遺伝子型を同
定した。ゲノムワイド関連研究（２６、２７）を可能にするために、ゲノム全域で約５００，０００ＳＮＰの遺伝子型を同定するように５．０チップを設計した。同様のプロトコールを用いて、アフィメトリクス５００Ｋ Ｓｔｙ及びＮｓｐチップを使用してブロード
研究所（Broad Institute）でＮＩＭＨ対照の遺伝子型を同定した。自閉症コンソーシア
ム及びモントリオール複製試料も、同一の条件下においてブロード研究所で遺伝子型を同定した。Johns Hopkins Center for Complex Diseaseで、同様の標準的なプロトコールを使用してアフィメトリクス５００Ｋ（Ｎｓｐ及びＳｔｙ）並びに５．０プラットフォームにおいて、ＮＩＭＨ自閉症試料に対して遺伝子型を同定した。

５．０アレイに関する遺伝子型判定を、Birdseed（２６と２７）によって実施し、５００Ｋアレイに対してＢＲＬＭＭによって実施した。ブロード研究所で作成したデータの基本的なＱＣフィルターとして、遺伝子型同定が各個人に対して＞９５％完全であり、各家系がゲノム全域で１０，０００未満のメンデル遺伝のエラーを有しているという条件を設定した。各ＳＮＰは、遺伝子型同定＞９５％、メンデルの法則のエラー１５未満、ハーディーワインベルク平衡Ｐ＞１０^−１０、及び１％を超えるマイナー対立遺伝子頻度を有するという条件を設定した。ＡＧＲＥ試料に関して、これは、平均コールレート９９．６％を有する３９９，１４７ＳＮＰに対して遺伝子型を同定した２，８８３の高品質個人を残した。Johns Hopkinsで作成したデータのための基本フィルターは、５．０アレイデータ
に対して個々のコールレート＞９５％、５００Ｋアレイデータに対して＞９０％で、１家系当たりのメンデルの法則のエラーが５，０００未満であった。単一形のＳＮＰ及び５０％を超える欠測データを有するもののみを、４９８，２１６ＳＮＰに入れた。総合データセットは、ＱＣを通過する約３６５，０００ＳＮＰを有していた。

シーケノム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）遺伝子型同定
ＳＮＰを、３センター、すなわちグルベンキアン（Gulbenkian）、マウントサイナイ（Mt. Sinai）、及びオックスフォードでＡＧＰ試料に対してシーケノム技術を使用してア
ッセイし、多数の採用サイトを代表する１，６２９家系由来のＤＮＡは５４ＳＮＰに対して遺伝子型を同定した。欠測データ＞３％を有するＳＮＰ、すなわち、ｒｓ４６９０４６４、ｒｓ１０５１３０２５及びｒｓ１７０８８２９６を解析から除外した。品質管理法の次のステップは、残りの５１遺伝子座から≧４のメンデルの法則エラーを有する家系を、このことが家系エラーを示すという仮定の下で除外することだった。１１０家系由来のデータをメンデルの法則エラーにより除去した。その後、残りの家系において、データが過度のメンデルの法則エラー（＞１６）を示した場合にＳＮＰを除去した。この基準を使用して、もう２つのＳＮＰ（ｒｓ１５５４３７及びｒｓ１９２５０５８）を解析から取り除いた。ＤＮＡ品質は研究場所によって変化して、付随する遺伝子型の品質相違の原因となり得ることが明らかだった。そのため、遺伝子座及び研究場所当たりの欠失した遺伝子型の比率も評価した。残りの個体群試料と比較して、いくつかの個体群試料由来のＤＮＡは、２つのＳＮＰ、すなわちｒｓ４７４２４０８及びｒｓ７８６９２３９に対して過度の欠損状態を示したことが解析によってわかった。具体的には、３群の試料は、ｒｓ４７４２４０８及びｒｓ７８６９２３９に対する７％を超える欠損遺伝子型を示したが、残りの群の試料は約１％以下の欠損遺伝子型を有していた。そのため、これらの遺伝子座に対して過度の欠損状態を示す試料のみに由来する遺伝子型を削除した。最終品質管理ステップとして、残りの遺伝子座に対する欠損遺伝子型を評価した。５を超える遺伝子座が欠損遺伝子型だった場合、その個体データを解析から取り除いた。この基準によって、関連解析に対する１，４４３家系を残して、７６のさらなる家系が、家系に基づいた関連解析に対して情報価値の無いものとなった。プレトネン研究所（Peltonen lab）でフィンランド人自閉症試料の遺伝子型を同定し、非常に類似したプロトコールを使用して、ブロード研究所でイラン人の３人組家系（ｔｒｉｏｓ）の遺伝子型を同定した。同一のプールされたプライマー及びプローブ由来のアリコートを使用して全ての試料の遺伝子型を同定した。

コピー数解析
２つの大きな（１Ｍｂを超える）以前の報告により、この遺伝子座（４２）に広がる独立した新規欠失（de novo deletion）、ｒｓ１０５１３０２５の周辺領域及び全ＳＥｉＡ５Ａ遺伝子座は、全てのアフィメトリクス５．０試料を解析するBirdsuite（２６）を使用して、自閉症に対するこの領域の重要性の独立した証拠を説明又は提供のどちらかを可能にするようにコピー数変化について評価した。Birdsuite遺伝子型は、以前に一般的なコピー数多型を注釈付けしており（２７）、ＨＭＭを使用して並行して新規のコピー数変異体を検索する。領域におけるプローブカバー率は良好であり、プローブが１０未満、プローブ間の平均間隔が２．５ｋｂの５０ｋｂウィンドウは全く無く、２５ｋｂを超えるＣＮＶに対する非常に良好な感受性を可能にした。欠失又は複製は、このＳＮＰの近傍で全く見出されなかった。また、遺伝子ＳＥｉＡ５Ａの重複も全く見出されなかった。このＳＮＰの上流及び下流に最も接近したコピー数変異体は、ＳＥｉＡ５Ａの３’末端から２８８ｋｂからのまれな（頻度約２−３％、以前に注釈付けられたＣＮＰ）４０ｋｂ欠失、及びＳＥｉＡ５Ａの５’末端の上流の３５６ｋｂからのまれな（頻度約１％、新規の）２０ｋｂ欠失であるように見えた。これらのそれぞれは、多型を分離するが、ＳＥｉＡ５Ａ及びＴＡＳ２Ｒ１の境界外の遠くに、そしてｒｓ１０５１３０２５を含む連鎖不平衡ブロックから遠くに収まるように見えた。

有意性の確認
ゲノムワイドな有意性についての適切な実験閾値を確認するために、このデータセット上でｇｅｎｅ−ｄｒｏｐｐｉｎｇによりパーミュテーションを実施し、パーミュテーションした１０００の各データセットから最低Ｐ値を取ることにより、及び実験の全範囲に及ぶ有意性Ｐ＜０．０５に対する閾値として５０番目を使用することにより、ゲノムワイドな有意性を推定した（Ｐ＜２．５×１０^−７）。試験の有効数（Ｔ_ｅｆｆ）の推定値を計算するために、以下のアルゴリズムを使用した：
１．ｉ＝染色体、ｊ＝ＳＮＰ位置である染色体（ＳＮＰｉｊ）に最多の５’ＳＮＰでスタートし、１Ｍｂ（ｒ^２［ＳＮＰ_１，１×ＳＮＰ_１，ｎ］）以内の全下流ＳＮＰでペアワイズＬＤを計算する。
２．ＳＮＰ_１，１に対して、Ｔ_{ｅｆｆ（（１，１）}＝１−ｍａｘ（ｒ^２［ＳＮＰ_１，１×ＳＮＰ_１，ｎ］）
３．染色体ｉに対して、
式中、ｍ＝染色体上のＳＮＰの総数。
４．
このアルゴリズムは、ペアワイズＬＤを説明するだけなので、有効試験数の保守的な推定を提供する。

参考文献
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他の実施態様
前記の説明から、本発明を様々な用法及び条件に適用させるために、本明細書中に記載の本発明に対して様々な変更及び改変を行うことができることは明らかである。このような実施態様もまた、以下の特許請求の範囲内である。

本明細書の可変部分の定義の何れかにおける構成要素の列挙の記述は、何れかの単一構成要素又は列挙される構成要素の組合せ（又は部分的組合せ）としての、その可変部分の定義を含む。本明細書の実施態様の記述は、何れかの単一の実施態様、又は他の実施態様との組み合わせ若しくはそれらの部分としてのその実施態様を含む。

この明細書に述べられた全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物が具体的に及び個別に参照により組み込まれると示されているのと同じ範囲まで、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (24)

1. 方法が、対象に由来するＪＡＲＩＤ２核酸分子における遺伝子変異の有無を識別することを含む、対象における自閉症若しくは自閉症スペクトラム障害に対する遺伝的素因、又はそれらの存在を確認する方法。
2. 対象が自閉症と診断された家族を有すると同定する、請求項１に記載の方法。
3. 対象が統合失調症と診断された家族を有すると同定する、請求項１に記載の方法。
4. 遺伝子変異が、ＪＡＲＩＤ２の連鎖不平衡領域にあるか、又は染色体６ｐ２３に関連している、請求項１に記載の方法。
5. 遺伝子変異が当該ＪＡＲＩＤ２核酸分子における一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項１に記載の方法。
6. ＳＮＰが、ｒｓ７７６６９７３、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ６９１５３４４及びｒｓ１３１９３４５７よりなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 多型部位ｒｓ７７６６９７３でのＣの同定が、自閉症に対するリスクの上昇を示す、請求項５に記載の方法。
8. 遺伝子変異が対象由来の生体試料において同定される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 生体試料が、血液、尿、糞便、唾液、チークスワブ、羊水及び組織よりなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 生体試料が血液である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
11. 試料が、年齢０〜６か月、年齢６〜１２か月、又は年齢１２〜３６か月の対象から単離される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
12. 対象が、コミュニケーション技能、社会的技能に遅延を有すると同定された小児、又はそうでなければ発達障害と同定された小児である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
13. 方法がさらに、対象における遺伝子変異を対象の親類における対応する配列と比較することを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
14. 遺伝子変異が、直接配列決定法、１本鎖多型アッセイ、変性高速液体クロマトグラフィー、核酸アレイハイブリダイゼーション、制限長多型アッセイ、リガーゼ連鎖反応、酵素的切断、サザンハイブリダイゼーション、質量分析法、及びポリメラーゼ連鎖反応よりなる群から選択される方法によって検出される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
15. 生体試料が、デオキシリボ核酸又はリボ核酸を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
16. 遺伝子変異が、１本鎖多型アッセイによって検出される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
17. 遺伝子変異が、変性高速液体クロマトグラフィーを使用して検出される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
18. 試料の試験が、核酸の直接配列決定法によって実施される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
19. 多型が、ｒｓ７７６６９７３、ｒｓ６９１５３４４、ｒｓ１２５３０２０２、ｒｓ２２９５９５４、ｒｓ９４６４７７９、ｒｓ１１９６２７７６、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ９３９６５７８、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ９３７０８０９、ｒｓ３７５９、ｒｓ９５７３８７、ｒｓ７０７８３３、ｒｓ１３１９３４５７、ｒｓ９０９６２６よりなる群から選択される部位にある、請求項１又は２に記載の方法。
20. 対象が発達遅延又は自閉症の行動異常特徴を有することを同定することをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
21. 方法が、対象に由来するＪＡＲＩＤ２核酸分子における遺伝子変異の有無を識別することを含んでなる、対象を自閉症又は自閉症スペクトラム障害を改善するために治療介入の必要があると同定する方法。
22. キットが、ＪＡＲＩＤ２核酸分子における多型に特異的に結合又はハイブリダイズできる少なくとも１つのポリヌクレオチド分子、及び請求項１〜２０の何れかに記載の方法においてキットを使用するための説明書を含んでなる、対象における自閉症関連多型を検出するためのキット。
23. キットがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での使用に適した少なくとも１セットのプライマーを含んでなり、ここでプライマーセットはＪＡＲＩＤ２核酸分子を増幅する、対象における自閉症関連多型を検出するためのキット。
24. キットがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での使用に適した少なくとも１セットのプライマーを含んでなり、ここでプライマーセットは、ｒｓ７７６６９７３、ｒｓ６９１５３４４、ｒｓ１２５３０２０２、ｒｓ２２９５９５４、ｒｓ９４６４７７９、ｒｓ１１９６２７７６、ｒｓ６９２１５０２、ｒｓ９３９６５７８、ｒｓ６４５９４０４、ｒｓ９３７０８０９、ｒｓ３７５９、ｒｓ９５７３８７、ｒｓ７０７８３３、ｒｓ１３１９３４５７、ｒｓ９０９６２６よりなる群から選択される多型部位を増幅する、対象における自閉症関連多型を検出するためのキット。