CN111615561A - 单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针和顺式-反式判别方法 - Google Patents
单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针和顺式-反式判别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开包含对第一单核苷酸多态性进行检测的报告区、对第二单核苷酸多态性进行检测的锚定区和接头区的探针。上述报告区具有由与上述第一靶碱基序列完全匹配的碱基序列构成的寡核苷酸、和在与存在上述第一单核苷酸多态性的第一靶碱基序列杂交时猝灭的荧光色素。上述锚定区具有由与存在上述第二单核苷酸多态性的第二靶碱基序列完全匹配的碱基序列构成的寡核苷酸。上述报告区的寡核苷酸的长度比上述锚定区的寡核苷酸的长度短。
Description
技术领域
本发明涉及单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针、以及判别两种单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的方法。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR：Epidermal Growth Factor Receptor)为跨膜型受体酪氨酸激酶，作为与细胞的增殖、生长的调控有关的因子而为人所知。EGFR作为癌基因在包括肺癌在内的多种癌中过表达，因此作为癌治疗的分子靶标而受到关注，已开发出了EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)等癌治疗药。
但是，已知吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制剂在一年左右会产生耐性而使病情再次恶化。获得该耐性的原因约半数是作为EGFR的第790位氨基酸的苏氨酸(T)被置换为蛋氨酸(M)的突变(T790M)。因此，开发了用于能够对该T790M进行检测的探针，并报道了以与包含T790M的EGFR基因的序列杂交的方式设计的多态性检测用探针(专利文献1、专利文献2)。另外，开发了对该T790M有效的EGFR酪氨酸激酶抑制剂奥希替尼，将其用作肺癌治疗药。
但是，有报道称，由于进一步耐性突变的追加，已被临床应用的EGFR酪氨酸激酶抑制剂全部失效。认为该耐性的原因之一是作为EGFR的第797位氨基酸的半胱氨酸(C)被置换为丝氨酸(S)的突变(C797S)。据报道，在该C797S相对于T790M以反式存在时，得到了现有的EGFR-TKI的组合可能有效的发现，但是在C797S相对于T790M以顺式存在时，包括它们的组合在内的已被临床应用的EGFR酪氨酸激酶抑制剂全部失效(非专利文献1)。这样，在由于作为对治疗药的耐性的原因的两种不同的单核苷酸多态性(以下有时省略为“SNP(SingleNucleotide Polymorphism)”)以顺式或反式这样不同的位置关系存在而使对治疗药的耐性的强度等有所不同的情况下，为了进行对该耐性的应对的选择和用于克服耐性的治疗药/治疗方法的开发等，判别位置关系为顺式或为反式的方法变得重要。就现状而言，为了判别位置关系为顺式或为反式，只有使用新一代测序仪或数字PCR的复杂方法。因此，期望开发出用于简单地判别位置关系为顺式或为反式的多态性检测用探针。
多态性检测用探针优选合成简便且价格低、能够准确地以良好的灵敏度检测多态性的存在。作为这样的探针，开发出了一种单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针，其具有对单核苷酸多态性进行检测的报告区、无论有无单核苷酸多态性均与靶碱基序列结合的锚定区、以及连接报告区和锚定区的接头区，该探针利用报告区所具有的荧光色素，能够基于其荧光强度来检测单核苷酸多态性的有无(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2006/086777号
专利文献2：国际公开第2011/052754号
专利文献3：国际公开第2016/098595号
非专利文献
非专利文献1：K.Uchibori et al.,Brigatinib combined with anti-EGFRantibody overcomes osimertinib resistance in EGFR-mutated non-small-cell lungcancer,Nature communications 8,Article number:14768(2017)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供用于在第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性存在于不同的位置的靶核酸中判别上述第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针。另外，本发明的目的在于提供使用上述寡核苷酸探针来判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的方法。
用于解决问题的方法
本发明提供一种探针，其是用于在第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性存在于不同的位置的靶核酸中判别上述第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针，其中，
上述靶核酸包含存在上述第一单核苷酸多态性的第一靶碱基序列、和存在上述第二单核苷酸多态性的第二靶碱基序列，
上述探针包含对上述第一单核苷酸多态性进行检测的报告区、对上述第二单核苷酸多态性进行检测的锚定区、以及接头区，
上述报告区具有由与上述第一靶碱基序列完全匹配的碱基序列构成的寡核苷酸、和在上述第一靶碱基序列与上述报告区杂交时猝灭的荧光色素，
上述锚定区具有由与上述第二靶碱基序列完全匹配的碱基序列构成的寡核苷酸，
上述接头区连接着上述报告区和上述锚定区，具有由与上述第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式存在时的上述靶核酸中的上述第一靶碱基序列和上述第二靶碱基序列之间的碱基序列不互补的碱基序列构成的寡核苷酸，
上述报告区的寡核苷酸的长度比上述锚定区的寡核苷酸的长度短。
本发明的探针在用于对第一单核苷酸多态性进行检测的报告区之外还具备用于对第二单核苷酸多态性进行检测的锚定区，两区域由接头区连接着。另外，报告区的寡核苷酸的长度比锚定区的寡核苷酸的长度短。因此，在通过锚定区与第二靶碱基序列杂交而确保探针的结合性时，利用由接头区连接的具有荧光色素的报告区，能够以良好的灵敏度检测第一单核苷酸多态性的有无。通过按照报告区和锚定区这两者与各自对应的靶碱基序列杂交而使荧光强度减小的方式进行适当调节，能够利用单个的探针以良好的准确性和检测灵敏度判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在。
上述接头区优选为由不包含通用碱基的碱基序列构成的寡核苷酸。通过在接头区不使用通用碱基，能够更廉价地合成探针。
上述接头区优选为仅由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一种碱基构成的寡核苷酸。由此，以探针的接头区与靶核酸结合的可能性降低，因此报告区的自由度增加，能够提高第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性的检测能力。另外，利用仅由上述碱基构成接头区，能够更廉价地合成探针。
上述接头区优选为由3～11个核苷酸构成的寡核苷酸。由此，锚定区与报告区隔开一定距离，因此报告区的自由度增加，能够提高第一单核苷酸多态性的检测能力，结果能够提高顺式SNP的检测能力。
另外，本发明提供一种判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的方法，其包括：将上述本发明的探针与第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性存在于不同的位置的靶核酸混合而制备混合液的步骤；测定上述混合液的荧光强度的步骤；以及基于上述荧光强度来判别上述第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的步骤。
根据本发明的方法，通过使用单个的探针，能够基于其荧光强度来判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在。
发明效果
根据本发明，能够使用单个的探针，在无需复杂步骤的情况下简单地在第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性存在于不同的位置的靶核酸中判别上述第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在。
附图说明
图1是利用本实施方式的探针对以顺式存在的T790M和C797S进行检测的机理的示意图。围起来的部分表示SNP或对应于SNP的部分。
图2示出使用C797S检测用探针时的热熔解曲线分析的结果。100％表示模板DNA全部为具有包含C797S_1的EGFR基因序列的DNA的情况，50％～5％表示模板DNA中的具有包含C797S_1的EGFR基因序列的DNA的比例分别为50％～5％的情况(其他为具有野生型EGFR基因序列的DNA)，0％表示模板DNA全部为具有野生型EGFR基因序列的DNA的情况，C797S_2表示模板DNA全部为具有包含C797S_2的EGFR基因序列的DNA的情况。
图3是在实施例3中设计的3个探针(1)～(3)、以及识别T790M的序列和识别C797S的序列由接头结合而成的合成寡核苷酸的示意图。围起来的部分表示SNP或对应于SNP的部分，结合在各探针的与接头区相反一侧的末端的圆圈表示QProbe。
图4示出使用识别T790M的序列和识别C797S的序列由接头结合而成的图3所示的合成寡核苷酸时的热熔解曲线分析的结果。
图5示出使用顺式检测用接头探针时的热熔解曲线分析的结果。“顺式(T790M/C797S+wt)”表示模板DNA包含具有以顺式包含T790M和C797S的EGFR基因序列的DNA(T790M/C797S)、以及作为其等位基因的具有不包含上述突变的野生型EGFR基因序列的DNA(wt)的情况。顺式50％和顺式25％表示模板DNA分别包含含有50％和25％的T790M/C797S的DNA(其他为具有野生型EGFR基因序列的DNA)、以及作为其等位基因的具有不包含上述突变的野生型EGFR基因序列的DNA(wt)的情况。因此，顺式50％和顺式25％的整体中的T790M/C797S的突变存在率分别为25％和12.5％。“反式(T790M+C797S)”表示模板DNA全部为具有以反式包含T790M和C797S的EGFR基因序列的DNA的情况，wt表示模板DNA全部为具有野生型EGFR基因序列的DNA的情况，T790M表示模板DNA全部为具有仅包含T790M的EGFR基因序列的DNA的情况，C797S表示模板DNA全部为具有仅包含C797S的EGFR基因序列的DNA的情况。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式(以下称为“本实施方式”)详细地进行说明。需要说明的是，本发明并不限定于下述的实施方式。
本说明书中，“单核苷酸多态性(SNP：Single Nucleotide Polymorphism)”是指由碱基序列上的单个碱基的置换引起的多态性。
本说明书中，“靶核酸”是指作为用于使用本实施方式的探针来确认SNP的有无的对象的核酸。靶核酸包含作为存在第一单核苷酸多态性的区域的第一靶碱基序列、和作为存在第二单核苷酸多态性的区域的第二靶碱基序列。第一靶碱基序列和第二靶碱基序列可以事先从已知存在SNP的核酸的碱基序列中确定。
第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式或反式中的任意一种位置关系存在。顺式是指第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性位于相同的染色体上，反式是指第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性位于不同的染色体上。在第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性可存在于同一等位基因上的情况下，顺式是指第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性位于同一等位基因上，反式是指第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性位于不同的等位基因上。作为第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性可存在于同一等位基因上的示例，可以列举EGFR基因，作为第一单核苷酸多态性，可以列举C797S，作为第二单核苷酸多态性，可以列举T790M。
第一靶碱基序列优选已知存在SNP的核酸的碱基序列中由包含可能含有想要检测的SNP(第一单核苷酸多态性)的碱基的3～6个核苷酸构成的区域。第一靶碱基序列更优选由3～5个核苷酸构成的区域，进一步优选由4或5个核苷酸构成的区域。第一靶碱基序列中，可能含有SNP的碱基的位置没有特别限定，优选第一靶碱基序列的中心附近。
第二靶碱基序列与第一靶碱基序列不重复，优选已知存在SNP的核酸的碱基序列中由包含可能含有想要检测的SNP(第二单核苷酸多态性)的碱基的8～20个核苷酸构成的区域。第二靶碱基序列更优选由10～18个核苷酸构成的区域，进一步优选由11～15个核苷酸构成的区域，特别优选由14或15个核苷酸构成的区域。第二靶碱基序列中，可能含有SNP的碱基的位置没有特别限定，优选第二靶碱基序列的中心附近。
在第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式的位置关系存在时，第二靶碱基序列位于第一靶碱基序列的3’侧或5’侧。在第二靶碱基序列位于第一靶碱基序列的3’侧的情况下，从第一靶碱基序列的3’末端至第二靶碱基序列的5’末端的核苷酸的数量(间隔)优选为0～15个，更优选为3～12个，进一步优选为4～10个。通过将第一靶碱基序列与第二靶碱基序列的间隔设定为上述范围，能够在本实施方式的探针中的报告区与锚定区之间保持适当的距离，因此具有SNP的检测能力提高的倾向。另外，能够根据第一靶碱基序列与第二靶碱基序列的间隔来设定接头区的长度，因此不需要合成多余的核苷酸，具有在经济上也优良的倾向。在第二靶碱基序列位于第一靶碱基序列的5’侧的情况下，可以将第一靶碱基序列的5’末端至第二靶碱基序列的3’末端的核苷酸的数量设定为上述范围。
作为本实施方式中的靶核酸，可以列举DNA或RNA，优选为DNA。作为靶核酸的来源，只要包含DNA或RNA则没有特别限定，可以列举例如动物、植物、菌类、微生物、病毒等。另外，靶核酸的制备方法也没有特别限定，可以直接从生物体或病毒制备，也可以从特定的组织制备，也可以从作为模板的核酸人工克隆来制备，还可以使用利用PCR法或LAMP法得到的扩增产物。
在本说明书中，“完全匹配”是指，相对于靶核酸中的第一靶碱基序列，报告区的碱基序列具有完全互补的序列，因此，第一靶碱基序列与报告区杂交。与此相对，“错配”是指，相对于靶核酸中的碱基序列，报告区的碱基序列具有至少一个碱基不同的序列，因此，与完全匹配的情况相比，该碱基序列与报告区不易杂交。
<探针>
本实施方式的探针包含对第一单核苷酸多态性进行检测的报告区、对第二单核苷酸多态性进行检测的锚定区和接头区。在本实施方式的探针中，报告区和锚定区的位置关系可以根据靶核酸中第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式的位置关系存在时的第一靶碱基序列和第二靶碱基序列的位置关系而适当设定。例如，在第二靶碱基序列位于第一靶碱基序列的3’侧时，锚定区配置于报告区的5’侧。
本实施方式的探针在用于对第一单核苷酸多态性进行检测的报告区之外还具备用于对第二单核苷酸多态性进行检测的与靶碱基序列结合的锚定区。报告区的寡核苷酸的长度比锚定区的寡核苷酸的长度短。因此，在通过锚定区与第二靶碱基序列杂交而确保探针的结合性时，利用由接头区连接的报告区，能够准确地以良好的灵敏度检测第一单核苷酸多态性的有无。
作为本实施方式的探针的制造方法，没有特别限定，可以列举例如使用化学合成法的通常的寡核苷酸的合成方法等。本实施方式的探针由通常的寡核苷酸构成，因此不需要复杂的合成方法，能够简便且廉价地制造。
(报告区)
报告区为用于对第一单核苷酸多态性进行检测的区域。报告区的寡核苷酸是由与存在第一单核苷酸多态性的第一靶碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸。报告区是由与存在第一单核苷酸多态性的第一靶碱基序列完全匹配、在第一靶碱基序列以外的序列(包含除了不存在第一单核苷酸多态性以外与第一靶碱基序列相同的序列)时发生错配的碱基序列构成的寡核苷酸。
另外，报告区具有在第一靶碱基序列与报告区杂交时猝灭的荧光色素。通过使报告区具有这样的荧光色素，能够通过测定其荧光强度而简便地进行单核苷酸多态性的检测。作为具有这样的特征的荧光色素，可以列举例如QProbe系列(日铁住金环境公司制造)。QProbe在发生杂交时在与经荧光色素修饰的碱基互补的碱基的附近存在鸟嘌呤时会产生荧光共振能量转移，荧光发生猝灭。作为QProbe所具有的荧光色素，具体而言，可以列举太平洋蓝(Pacific Blue)、ATTO465、BODIPY-FL、罗丹明6G、TAMRA和ATTO655等。通过使用这样的荧光色素，荧光特性根据报告区与第一靶碱基序列是否杂交而发生变化。因此，本实施方式的探针无需像使用具有荧光色素的探针的通常的SNP的检测方法那样添加猝灭剂，经济性优良。荧光色素优选结合在报告区中与接头区相反一侧的末端。
从进一步提高第一单核苷酸多态性的检测能力的观点出发，报告区的寡核苷酸的长度优选为3～6个核苷酸，更优选为3～5个核苷酸，进一步优选为4或5个核苷酸。另外，在本实施方式的探针中，从提高顺式SNP的检测能力的观点出发，报告区的寡核苷酸的长度比锚定区的寡核苷酸的长度短。从报告区与靶核酸杂交而使荧光色素的荧光猝灭的观点出发，报告区的寡核苷酸优选在距离荧光色素的结合部位1～3个以内按照在第一靶碱基序列中存在鸟嘌呤的方式进行设计。
(锚定区)
锚定区为用于对第二单核苷酸多态性进行检测的区域。锚定区的寡核苷酸是由与存在第二单核苷酸多态性的第二靶碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸。锚定区是由与存在第二单核苷酸多态性的第二靶碱基序列完全匹配、在第二靶碱基序列以外的序列(包含除了不存在第二单核苷酸多态性以外与第二靶碱基序列相同的序列)时发生错配的碱基序列构成的寡核苷酸。从对于第二靶碱基序列得到良好的结合性的观点出发，锚定区的寡核苷酸的长度优选为8～20个核苷酸，更优选为10～18个核苷酸，进一步优选为11～15个核苷酸，特别优选为14或15个核苷酸。
(接头区)
接头区为用于增加探针的自由度的区域。接头区连接着报告区和锚定区。接头区具有由与第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式存在时的靶核酸中的第一靶碱基序列和第二靶碱基序列之间的碱基序列不互补的碱基序列构成的寡核苷酸。
从能够更廉价地合成探针的观点出发，接头区优选不包含通用碱基。作为通用碱基，可以列举作为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的碱基的通用碱基或其类似物等。作为通用碱基或其类似物，可以列举例如5-硝基吲哚、脱氧核糖核苷、3-硝基吡咯脱氧核糖核苷、4-硝基苯并咪唑脱氧核糖核苷、脱氧水粉蕈素、脱氧肌苷、2’-OMe肌苷、2’-OMe5-硝基吲哚核糖核苷、2’-OMe3-硝基吡咯核糖核苷、2’-F肌苷核糖核苷、2’-F水粉蕈素、2’-F5-硝基吲哚核糖核苷、2’-F4-硝基苯并咪唑核糖核苷、2’-F3-硝基吡咯核糖核苷、PNA-5-硝基吲哚(introindole)、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉基-5-硝基吲哚、吗啉基-水粉蕈素、吗啉基-肌苷、吗啉基-4-硝基苯并咪唑、吗啉基-3-硝基吡咯、亚磷酰胺-5-硝基吲哚、亚磷酰胺-水粉蕈素、亚磷酰胺-肌苷、亚磷酰胺-4-硝基苯并咪唑、亚磷酰胺-3-硝基吡咯、2’-O-甲氧基乙基肌苷、2’-O-甲氧基乙基水粉蕈素、2’-O-甲氧基乙基-5-硝基吲哚核糖核苷、2’-O-甲氧基乙基-4-硝基-苯并咪唑核糖核苷、2’-O-甲氧基乙基-3-硝基吡咯核糖核苷、脱氧RPMP-5-硝基吲哚二聚体、2’-OMeRPMP-5-硝基吲哚二聚体等。
接头区优选为仅由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一种碱基构成的寡核苷酸。由此，以接头区与靶核酸结合的可能性降低，因此报告区的自由度增加，容易提高顺式SNP的检测能力。另外，通过仅由上述碱基构成接头区，具有能够更廉价地合成探针的倾向。
另外，接头区的寡核苷酸的长度优选为3～11个核苷酸，更优选为3～9个核苷酸，特别优选为7个。通过使接头区的寡核苷酸的长度为上述范围，与靶核酸结合的锚定区和报告区隔开一定距离，因此报告区的自由度增加，具有顺式SNP的检测能力提高的倾向。另外，从在靶核酸与本实施方式的探针杂交时得到立体结构上的自由度的观点出发，接头区的寡核苷酸的长度相对于上述的第一靶碱基序列和第二靶碱基序列的间隔(interval)优选为-5～+5个，更优选为-3～+3个。
<使用探针的判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的方法>
本实施方式的探针在对第一单核苷酸多态性进行检测的报告区中具有荧光色素，因此，能够基于其荧光强度来检测靶核酸中的第一单核苷酸多态性的有无。
作为判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的方法的一个实施方式，可以列举具备下述步骤的方法：将本实施方式的探针与第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性存在于不同的位置的靶核酸混合而制备混合液的步骤；测定该混合液的荧光强度的步骤；以及基于所测定的荧光强度来判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的步骤。
图1是示意性地示出在第一单核苷酸多态性为C797S、第二单核苷酸多态性为T790M的情况下将本实施方式的探针与靶核酸混合时的两者的状态的图。在具有与存在T790M的第二靶碱基序列互补的序列的锚定区中，探针与靶核酸杂交(图1(a)和(b-1))。并且，报告区进一步与存在C797S的第一靶碱基序列杂交时，荧光色素的荧光猝灭(图1(a))。这种情况下，可以判断为C797S和T790M以顺式存在。另一方面，在报告区发生错配的情况下，报告区无法杂交，因此荧光色素的荧光继续发光(图1(b-1))。这种情况下，可以判断为C797S和T790M以反式存在。另外，本实施方式的探针中，报告区的核苷酸的长度比锚定区的核苷酸的长度短，利用锚定区来确保探针的结合性。因此，在锚定区发生错配的情况下，即使具有存在C797S的第一靶碱基序列，报告区也无法与第一靶碱基序列杂交，因此荧光色素的荧光继续发光(图1(b-2))。这种情况下，也可以判断为C797S和T790M以反式存在。
本实施方式的探针在报告区不与靶核酸中的第一靶碱基序列杂交时发出荧光。因此，例如在将探针和靶核酸混合时，在与混合前相比该混合液的荧光强度减小时，可以判断为第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式存在。相反地，在将探针和靶核酸混合时，在与混合前相比该混合液的荧光强度维持或增加时，可以判断为第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以反式存在。上述荧光强度在室温(25℃附近)下也能够测定，因此，根据本实施方式的方法，能够高效地进行第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的判别。
作为用于检测SNP的方法的其他实施方式，可以列举进行Tm(熔解温度：MeltingTemperature)分析的方法。Tm分析可以利用本领域技术人员通常使用的方法来进行。作为Tm分析，可以列举例如如下方法：将探针和靶核酸混合，在改变该混合液的温度的同时测定此时的混合液的荧光强度。在报告区发生错配的情况下，与完全匹配的情况相比，探针和靶核酸的复合物的热稳定性低，因此报告区在更低的温度下与靶核酸结合，测定到荧光的猝灭。将此时的温度称为猝灭开始温度。另一方面，在报告区完全匹配的情况下，与发生错配的情况相比，探针和靶核酸的复合物的热稳定性强，因此，即使在更高的温度下，报告区也与靶核酸结合，测定到荧光的猝灭。因此，测定例如报告区发生错配时的靶核酸的猝灭开始温度，在猝灭开始温度比该值高时，可以判断为在测定所用的靶核酸中第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式存在。但是，在报告区的特异性高、发生错配时完全未测定到猝灭的情况下，测定例如锚定区发生错配时的靶核酸的猝灭开始温度，在猝灭开始温度比该值高时，可以判断为在测定所用的靶核酸中第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式存在。
本实施方式的判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的方法中，在将探针与第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性存在于不同的位置的靶核酸混合而制备混合液的步骤中，可以进一步混合竞争寡核苷酸。竞争寡核苷酸可以为具有与针对第一靶碱基序列的野生型的碱基序列完全互补的序列的寡核苷酸，也可以为具有与针对第二靶碱基序列的野生型的碱基序列完全互补的序列的寡核苷酸，另外还可以为其组合，优选为具有与针对第二靶碱基序列的野生型的碱基序列完全互补的序列的寡核苷酸。通过进一步添加竞争寡核苷酸，能够提高顺式SNP的检测精度。
本实施方式的探针的锚定区藉由第二靶碱基序列与靶核酸杂交，因此，能够使对第一单核苷酸多态性进行检测的报告区的核苷酸的长度非常短。因此，报告区的特异性提高，即使在室温这样的温度低的条件下，报告区也不易与错配的序列杂交。其结果，错配时的室温附近的混合液的荧光强度与猝灭开始温度时的荧光强度相比没有显著降低。另一方面，在报告区完全匹配时，报告区在室温附近藉由第一靶碱基序列与靶核酸杂交。因此，完全匹配时的室温附近的混合液的荧光强度与猝灭开始温度时的荧光强度相比显著减小，约变为60％以下。因此，例如，在使用Tm分析的SNP的检测方法中，在室温附近的混合液的荧光强度变为猝灭开始温度时的荧光强度的60％以下时，可以判断为在测定所用的靶核酸中第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式存在。
在本实施方式的判别方法中，可以使用利用PCR法、LAMP法等方法扩增出的扩增产物作为靶核酸。
根据本实施方式的探针和判别方法，例如，可以提供针对患有由于第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式或反式这样不同的位置关系存在而使症状发生变化的疾病的患者的诊断、选择适当的治疗药/治疗方法等方面的指标。另外，例如，可以提供针对患有由于第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式或反式这样不同的位置关系存在而使对治疗药的反应发生变化的疾病的患者的选择适当的治疗药/治疗方法等方面的指标。另外，例如，在由于成为对治疗药的耐性的原因的第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式或反式这样不同的位置关系存在而使对治疗药的耐性的强度等不同的情况下，可以提供用于应对该耐性的选择和用于克服耐性的治疗药/治疗方法的开发等的指标。
实施例
以下，列举实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例1：探针和用于LAMP法的引物的设计]
作为参比序列，使用人类表皮生长因子受体(EGFR)，7号染色体上的RefSeqGene(LRG_304)(NCBI登录号：NG_007726)的序列。EGFR基因中的突变如下所述。
[表1]
在本实施例中，以上述突变中的T790M和C797S为对象。按照表2设计用于对T790M进行检测的探针和竞争寡核苷酸序列、用于单独检测C797S的探针和竞争寡核苷酸序列、以及用于对T790M和C797S以顺式存在的情况进行检测的探针和竞争寡核苷酸序列。需要说明的是，已知C797S具有2389T>A和2390G>C这两个突变，但基于检出频率高的2389T>A设计了对C797S进行检测的探针。以下，将由2389T>A的突变得到的C797S也表示为C797S_1、将由2390G>C的突变得到的C797S也表示为C797S_2。
[表2]
下划线部表示BNA合成部分，围起来的部分表示对应于SNP的部分，I表示肌苷，
[]表示接头序列。QProbe结合在与接头序列相反一侧的报告区的末端。
用于LAMP法的引物如下设计。
[表3]
[实施例2：使用LAMP法的C797S_1的检测]
使用LAMP法测定基于实施例1中设计的用于单独检测C797S_1(2389T>A)的探针(表2的C797S检测用探针)的、C797S的检测能力。
(材料)
模板DNA：具有包含C797S_1(2389T>A)的EGFR基因序列的DNA、具有包含C797S_2(2390G>C)的EGFR基因序列的DNA、具有野生型EGFR基因序列的DNA。模板DNA单独或混合使用上述DNA。
QProbe结合探针：使QProbe与具有序列号5的碱基序列的DNA结合而得到的探针(C797S检测用探针)。
LAMP用引物：具有序列号7～10中任一者的碱基序列的引物。
LAMP用反应混合物(Master Mix)：30mM KCl、1.8％右旋糖酐、14mM三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.1％正庚基(n-heptyl)、0.5％吐温、0.3％FCP、1mM DTT、1.7mM各dNTPs、8mMMgSO4、1.6μM正向内引物(FIP、序列号9)、反向内引物(BIP、序列号10)、0.8μM环引物(LP、序列号11)、0.2μM F3(序列号7)、0.2μM B3(序列号8)、1.2μM竞争寡核苷酸、0.04μM探针、0.0375×嵌入剂(gel green)、19.7U Bst DNA聚合酶(以上，浓度为25μL时的终浓度)。
(方法)
在LAMP用反应混合物20μl中添加经加热变性的模板DNA5μl(模板量10000cps)，制备反应液。利用实时荧光测定器LC480(Roche公司制造)，将反应液在65℃下温育90分钟，使扩增产物在95℃、5分钟的条件下发生热变性后，在37℃、5分钟的条件下使扩增产物与QProbe结合探针杂交。反应后，使反应液的温度从37℃缓慢上升至80℃(采集(acquisition)7/℃)，测定荧光强度，进行热熔解曲线分析。关于荧光强度，在QProbe具有BodipyFL时在465/510(nm)进行测定，在QProbe具有TAMRA时在533/580(nm)进行测定。
(结果)
将进行热熔解曲线分析时的荧光强度的变化示于图2。表明：通过使用实施例1中设计的C797S检测用探针，在模板量为10000cps时，能够检测至C797S_1的突变含有率5％。在此，突变含有率是指模板DNA整体中的包含突变的模板DNA的比例。
[实施例3：使用LAMP法的顺式接头探针的筛选]
如图3所示，制作长度相同的3个探针(1)～(3)。各探针上结合有QProbe(TAMRA)。
(1)由包含T790M和C797S的序列构成的探针(序列号12)
(2)由包含T790M的序列和野生型的序列构成的探针(序列号13)
(3)由包含野生型的序列和包含C797S的序列构成的探针(序列号14)
与此相对，设计出识别T790M的序列与识别C797S的序列由接头结合而成的合成寡核苷酸。识别T790M的序列不变，分别改变识别C797S的序列和接头的长度，如表4所示设计出4种合成寡核苷酸。
[表4]
筛选中使用的合成寡核苷酸
| 编号 | C797S识别序列的长度 | 接头的长度 |
| C797S-1 | 5mer | 7mer |
| C797S-2 | 5mer | 9mer |
| C797S-3 | 4mer | 7mer |
| C797S-4 | 5mer | 5mer |
分别使用表4的合成寡核苷酸作为模板DNA，分别使用图3的探针(1)～(3)作为QProbe结合探针，以下述的试剂组成进行杂交。使筛选用反应混合物(30mM KCl、10mMTris-HCl(pH8.0)、0.1％吐温、1.6μM合成寡核苷酸、0.05μM探针)混合后，利用实时荧光测定器LC480(Roche公司制造)，使反应液的温度从37℃缓慢上升至80℃(采集(acquisition)7/℃)，测定荧光强度，进行热熔解曲线分析。测定荧光强度并进行热熔解曲线分析的结果是，在使用C797S-1的合成寡核苷酸时，最高效地仅使探针(1)猝灭，能够仅检测包含顺式的T790M和C797S的序列。将使用图3中记载的识别T790M的序列与识别C797S的序列由接头(TTTTTTT)结合而成的合成寡核苷酸时的热熔解曲线分析的结果示于图4。
[实施例4：使用LAMP法的顺式突变的检测]
将实施例3中能够高效地仅检测包含顺式的T790M和C797S的序列的C797S-1的合成寡核苷酸(序列号3)转换为探针，制作顺式检测用接头探针。
参考实施例1的EGFR基因参比序列和表1的突变，设计出包含顺式的T790M和C797S的EGFR基因序列、包含反式的T790M和C797S的EGFR基因序列、仅包含T790M的EGFR基因序列、以及仅包含C797S的EGFR基因序列，制作人工基因。
分别使用上述人工基因和具有野生型EGFR基因的序列的基因组DNA作为模板DNA，使用上述顺式检测用接头探针作为QProbe结合探针，与实施例2同样地利用LAMP法进行杂交。为了排除在使用具有仅包含C797S的人工基因的序列的寡核苷酸的情况下略微观察到的猝灭、进一步提高灵敏度，添加与T790M序列部位的野生型完全互补的竞争寡核苷酸(序列号2)1.2μM。将对LAMP产物与实施例2同样地测定荧光强度并进行热熔解曲线分析的结果示于图5。
通过使用上述顺式检测用接头探针，能够仅检测T790M和C797S以顺式存在的情况。另外可知，能够检测至突变含有率12.5％。在此，突变含有率是指模板DNA整体中的包含突变的模板DNA的比例。
序列表
<110> 荣研化学株式会社（Eiken Chemical CO., LTD）
<120> 单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针和顺式-反式判别方法
<130> FP19-0031-00
<150> JP2018047582
<151> 2018-03-15
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 16
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<213> 合成
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catcatgcag ctcaaaaaaa acagcc 26
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ttcggcagcc tc 12
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tggaaggggt ccatgtgc 18
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<212> DNA
<213> 合成
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cagctcatca cgcagctcat gcccttcggc agcc 34
Claims (5)
1.一种探针，其是用于在第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性存在于不同的位置的靶核酸中判别所述第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针，其中，
所述靶核酸包含存在所述第一单核苷酸多态性的第一靶碱基序列、和存在所述第二单核苷酸多态性的第二靶碱基序列，
所述探针包含对所述第一单核苷酸多态性进行检测的报告区、对所述第二单核苷酸多态性进行检测的锚定区、以及接头区，
所述报告区具有由与所述第一靶碱基序列完全匹配的碱基序列构成的寡核苷酸、和在所述第一靶碱基序列与所述报告区杂交时猝灭的荧光色素，
所述锚定区具有由与所述第二靶碱基序列完全匹配的碱基序列构成的寡核苷酸，
所述接头区连接着所述报告区和所述锚定区，具有由与所述第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性以顺式存在时的所述靶核酸中的所述第一靶碱基序列和所述第二靶碱基序列之间的碱基序列不互补的碱基序列构成的寡核苷酸，
所述报告区的寡核苷酸的长度比所述锚定区的寡核苷酸的长度短。
2.如权利要求1所述的探针，其中，所述接头区为由不包含通用碱基的碱基序列构成的寡核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的探针，其中，所述接头区为仅由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一种碱基构成的寡核苷酸。
4.如权利要求1～3中任一项所述的探针，其中，所述接头区为由3～11个核苷酸构成的寡核苷酸。
5.一种判别第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的方法，其具备：
将权利要求1～4中任一项所述的探针与第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性存在于不同的位置的靶核酸混合而制备混合液的步骤；
测定所述混合液的荧光强度的步骤；以及
基于所述荧光强度来判别所述第一单核苷酸多态性和第二单核苷酸多态性是以顺式存在还是以反式存在的步骤。
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