EP2467496A1 - Verfahren zur bestimmung des metastasierungsrisikos als indikator für eine bildgebende diagnostik - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des metastasierungsrisikos als indikator für eine bildgebende diagnostik

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EP2467496A1
EP2467496A1 EP10732854A EP10732854A EP2467496A1 EP 2467496 A1 EP2467496 A1 EP 2467496A1 EP 10732854 A EP10732854 A EP 10732854A EP 10732854 A EP10732854 A EP 10732854A EP 2467496 A1 EP2467496 A1 EP 2467496A1
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EP
European Patent Office
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expression
risk
metastasis
increased
tumor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10732854A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Untch
Ralph Markus Wirtz
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Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Original Assignee
Siemens Healthcare Diagnostics Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Siemens Healthcare Diagnostics Inc filed Critical Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority to EP10732854A priority Critical patent/EP2467496A1/de
Publication of EP2467496A1 publication Critical patent/EP2467496A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention is in the field of in vitro diagnostics and relates to a method for determining the metastasis risk of a tumor, wherein a high risk of metastasis indicates that subsequent examinations are indicated to the patient by means of imaging methods are.
  • Cancers are the second leading cause of death in Europe. Currently, about 100 different cancers are known, which differ greatly in disease pattern, chance of survival and treatment options. In particular, the metastasis, d. H. The removal of tumor cells of the primary tumor into other, sometimes distant organs is of crucial importance for the survival of a patient.
  • tumor diagnostics in vitro methods for the determination of tumor markers are increasingly used, such.
  • tissue-based gene studies at the RNA or DNA level or blood tests. These markers allow disease prediction, efficient follow-up, and therapy assessment.
  • Further indications for tumor-diagnostic markers are the investigation of risk groups (eg in case of a positive family history, liver cirrhosis, undescended testicles, gynecological tumors), the differential diagnosis in case of unclear tumors, eg. For example, in an unfindable primary tumor and the prognosis of the course of the disease.
  • the goal of tumor diagnosis is the Increasing the survival time for the affected patient, improving his quality of life, but also reducing treatment and other follow-up costs.
  • Previous genetic examinations usually have the aim of enabling prognostic or predictive statements regarding a defined initial treatment of a tumor disease. The statements are not specified at a specific time or the location of metastases. The previous genetic studies also have no aim to predict the failure of a primary treatment for the purpose of performing an adapted aftercare and secondary treatment.
  • Tumor markers are substances that are produced by the cancer itself or by the organism in response to tumor growth. Tumor markers occur in elevated concentrations in the blood or other body fluids, e.g. As tear secretions, ascites, cerebrospinal fluid or urine. Determining the concentration of tumor markers allows conclusions to be drawn as to the presence, course and prognosis of tumor diseases.
  • the measurable concentration of tumor markers in body fluids depends, inter alia, on the total number of tumor cells (tumor mass), the reaction of the surrounding tumor stroma, the rate of synthesis of the tumor marker, the blood and lymph supply of the tumor and the marker-specific half-life.
  • tumor markers which have so far been used mostly in serum and plasma diagnostics, almost without exception are characterized by unsatisfactory sensitivity and specificity.
  • metastases of hormone receptor-negative high-risk tumors are not recognized by conventional markers such as CEA and CA15-3 [Sener Dede D, Aksoy S, Bulut N, Dizdar O, Arik Z, Gulu I 1 Ozisik Y, Altundag K (2009) Comparison of serum levels of CEA and CA 15-3 in triple-negative breast cancer at the time of metastases and serum levels at the time of first diagnosis.
  • metastasis screening designed purely for tumor marker diagnostics in blood samples can not exceed a sensitivity of 60-70%.
  • the primary diagnosis of a tumor disease is generally diagnosed by a clinical examination, by imaging and / or endoscopic procedures and / or a biopsy with subsequent pathological clarification. Subsequently the tumor-specific laboratory parameters are determined in vitro, since tumor follow-up must be planned at the time of the primary diagnosis.
  • Most cancers are treated as potentially systemic diseases because there is already a significant risk for the presence of unrecognizable micro- or macro-metastases in more distant body regions at an early stage.
  • systemic therapy eg, chemotherapy or endocrine therapy
  • chemotherapy e.g., chemotherapy or endocrine therapy
  • endocrine therapy e.g., chemotherapy or endocrine therapy
  • These minimal residual diseases are at the early time of primary treatment of the primary tumor using the standard in vivo imaging techniques, such as.
  • PET-CT, PET-MRI or MRI are not yet detectable.
  • the growth of non-detectable micrometastases to clinically manifest macrometastases takes different lengths, depending on the tumor biology of the primary tumor, overall constitution of the patient and more or less random implantation of tumor cells in distant organ systems.
  • the lymph node status of cancer patients is conventionally determined by surgical removal of the axillary lymph nodes and pathological assessment thereof.
  • this parameter alone is insufficiently sensitive and specific with respect to the presence of micrometastases and their development into lethal macrometastases and also says nothing about the time or place of metastasis.
  • biopsy is completely unsuitable for screening (screening) wide asymptomatic collectives.
  • Another form of tumor diagnostics is the use of so-called imaging techniques. These are understood as investigation methods by means of which structures and organs of the body can be made visible. Examples include X-ray examinations, computed tomography, magnetic resonance imaging, ultrasound diagnostics, scintigraphy, positron emission tomography. Endoscopy also falls under the imaging techniques, but in contrast to the above methods, a probe must be inserted into the body of the patient. Imaging methods have the disadvantage that they are associated with high costs and often go hand in hand with radiation exposure. Therefore, these methods are also not suitable for screening large asymptomatic collectives.
  • the object of the present invention is therefore to provide a noninvasive in vitro method with which the metastasis risk of a tumor can be predicted reliably, ie specifically and sensitively, or with which those cancer patients can be identified with high probability To develop metastases.
  • diagnostic is understood to mean the proportion of true-positive test results in the total number of all patients in percent.
  • diagnosis specificity is understood to mean the proportion of true-negative test results in the total number of non-sufferers in percent.
  • tissue-based gene measurement or also the combination of tissue-based gene measurement and blood-based tumor marker measurement can be used to predict metastasis screening with high sensitivity and meaningful specificity.
  • This makes it possible for the first time at the time of the first diagnosis or shortly before or after the first treatment, which generally usually surgery, radiation, chemo and possibly also includes endocrine therapies, to be able to carry out a further therapy planning, which includes an intensified aftercare program.
  • metastatic risks are predicted time-dependent, so that, in contrast to the usual predictors, risk collectives are defined that are time-dependent, for example within the first three years or in the years 3 to 5 or in the years 8 to 12 after initial diagnosis, for a defined metastatic event are enriched.
  • the object is achieved according to the invention in that at least the expression of MMP7 is quantitatively determined in a biological sample of a tumor patient, wherein a high (increased) MMP7 expression indicates an increased risk of metastasis and a lack or low MMP7 expression does not indicate an increased metastasis risk.
  • 604 patients with advanced breast tumors T1-3 N1 MO or T3N0M0
  • Formalin-fixed and paraffin-embedded samples from 315 treatment-na ⁇ ve patients were available for analysis.
  • RNA from a 10 ⁇ m tumor section was isolated by means of a semi-automated, bead-based technique (Bohmann K.
  • RNA Extraction from Archival FFPE Tissue A Comparison of Manual, Semi-Automated and Mobile Automated Purification Methods Clin Chemistry 2009, ePub JuIy 17, 2009).
  • the relative expression values of MMP7 were then used by quantitative PCR using TaqMan® probes for the respective target genes and housekeeping genes identical to the previously published data and methods [Pentheroudakis G. et al., Gene expression of estrogen receptor, progesterone receptor and microtubule -associated protein Tau in high-risk early breast cancer: a quest for molecular predictors of treatment benefit in the context of a Hellenic Cooperative Oncology Group trial. Breast Cancer Res Treat.
  • the number of reaction cycles is used as the measured value for this gene.
  • the height of this measurement correlates with the amount of mRNA of a target gene present in the tissue sample.
  • the threshold is exceeded depending on the initial amount of the target gene at a different early time of the reaction cycles performed. The more mRNA was present, the sooner the threshold is exceeded.
  • the reaction cycle, in which the threshold value of the respective gene is exceeded, is also referred to as the "CT” value ("cycle of threshold”).
  • a CT value which is higher by the value 1 corresponds to a doubling of the starting amount of the target gene RNA, which corresponds mathematically to a logarithmic representation of the relative gene expression.
  • the term "increased risk of metastasis” is understood to mean a risk of the occurrence of metastases, in contrast to the status-dependent basic risk of the occurrence of metastases for a particular type of tumor taking into account the influence of any treatment, tumor size, proliferation status of the tumor cells, age of the patient, etc It is known, for example, that in the case of nodal positive breast cancer despite chemotherapy and endocrine therapy there is a basic risk of approximately 15% to 20%, and adjuvant treatment within 5 years after the first diagnosis in neoadjuvant treated patients or after surgery In the example of the adjuvant HE10 / 97 study, the risk of having distant metastasis within the first three years was about 20% in the subgroup of 315 patients examined, ie within the first three patients of the patient group Years a symptomatic distant metastasis discovered (Figure 3).
  • the invention relates to a method for determining the risk of metastasis of a tumor, wherein in a biological sample of a tumor patient at least the expression of MMP7 is quantified, wherein a high (increased) MMP7 expression indicates an increased metastatic risk and a lack or low MMP7 expression does not indicate an increased metastatic risk.
  • the method according to the invention has the advantage that an increased risk of metastasis of a tumor can be reliably predicted and that a cancer patient can thus be assigned to a risk group for whom diagnostic follow-up examinations aimed at distant metastasis, preferably by means of imaging methods, are indicated. Furthermore, in the high-risk group for early metastasis, follow-up after more than three years can be saved.
  • "Remote metastasis-targeted diagnostic follow-up examinations” include, in particular, imaging techniques by means of which structures and organs of the living body can be visualized, for example x-ray examinations, computed tomography (CT), magnetic resonance imaging, ultrasound, scintigraphy, positron emission tomography (PET ), Magnetic resonance imaging (MRI).
  • the method according to the invention already enables a follow-up planning for the targeted further treatment of the patient at the time of the primary diagnosis of the primary tumor or shortly before or after the first treatment, which generally comprises surgery, radiation, chemotherapy and / or endocrine therapy.
  • the method according to the invention thus makes it possible to identify patients who, because of their increased risk of metastasis, will benefit from intensified follow-up, preferably by means of imaging techniques, in that metastases can be detected and treated as early as possible by means of a targeted, regular examination by means of imaging techniques improve the chances of survival.
  • the method according to the invention makes it possible to identify patients who would not benefit from intensified follow-up by means of imaging methods because of an undiminished risk of metastasis.
  • the expression of ESR1 in a biological sample of the tumor patient is determined quantitatively, wherein a missing or low ESR1 expression indicates an increased risk of metastasis and a high (increased) ESR1 expression does not indicate an increased risk of metastasis.
  • Estrogen receptor activity directly represses stem cell activities of transcription factors that mediate stem cell properties (eg, Slug, Snail, FOXC2, and Twist) and indirectly inhibits other stem cell properties by upregulating inhibitory members of stem cell activity signaling pathways (e.g., increased expression of E-cadherin , thereby reducing WNT stem cell activity due to the decreased amount of beta-catenin).
  • Genes of interest in this regard are ESR1, MLPH, AR, ALCAM as hormone receptor marker genes and MMP7, SFRP1, Snail, Slug, FOXC2, TWIST, KRT5, notch, TGFB, OPN as stem cell activity marker.
  • ESR1 and MMP7 are exemplified.
  • the difference between the two negatively regulated genes MMP7 and ESR1 was calculated by subtracting non-RPL37A normalized ESR 1 CT from the non-RPL37A normalized CT value of MMP7 (CT MMP7 - CT ESR1).
  • CT MMP7 - CT ESR1 CT MMP7 - CT ESR1
  • ESR1 - MMP7 both bills are equivalent.
  • this gene ratio for various reasons. On the one hand, because the ratio allows more breast cancer patients to be categorized as high-risk who metastasize within three years. This causes an increased sensitivity. With the MMP7 individual proof, 36 patients are assigned to the high-risk group and give an approx. 50% Remote metastasis risk (18 out of 36 MMP7 positive patients relapse).
  • Another advantage of this methodology is that the formation of the gene ratio by subtraction of the raw CT values eliminates the need to measure one or more housekeeping genes, which reduces the risk of biasing the data through systematic errors, if by definition "Neutral” and always uniformly produced housekeeping gene is not so evenly produced and in certain tumors, without being associated with the prognosis, the patient is produced stronger or weaker. This entails the risk that over or underestimation of the risk could result for individual tumors.
  • the inventive combination of two information-bearing genes that are counter-regulated, this risk is no longer. Furthermore, it saves on reagent costs, increases the throughput of patient samples and creates the possibility of a multiplex measurement of all necessary genes in only one reaction vessel (eg one well of a microtiter plate with 384 reaction chambers).
  • the expression of MAPT and the expression of RACGAP1 in a biological sample of the tumor patient is determined quantitatively, wherein a low MAPT expression combined with a high RACGAP1 expression indicates an increased risk of metastasis and a high MAPT Expression combined with low RACGAP1 expression indicates a low risk of metastasis (FIG. 6).
  • the ratio of the two processes can be determined in particular by the difference between the crude CT values or the values normalized to the housekeeping gene RPL37A.
  • the addition of MMP7 to the expression ratio RACGAP1 to MAPT makes sense.
  • the expression ratio of RACGAP1 to MAPT was linked to the RPL37A normalized MMP7 gene by decision tree with defined cut-off (DCT of 31.8 for MMP7 and 0.39 in the gene ratio of RACGAP1 MAPP) ( Figure 7). This detects a high-risk collective.
  • DCT decision tree with defined cut-off
  • splitting with MMP7 offers the possibility of predicting the site of metastasis, since the resulting MMP7 positive patient group preferentially metastasizes in the brain, lungs and liver, especially in the bones, especially if it is in addition to Her-2 / new positive tumors (DCT> 38 from Her-2 / neu).
  • the method according to the invention is suitable inter alia for determining the risk of metastasis of a tumor from the group of breast cancer, ovarian carcinoma, colorectal carcinoma, lung carcinoma, gastric carcinoma and head and neck carcinoma.
  • the quantitative determination of the expression of a gene can be carried out both at the nucleic acid level (eg RNA hybridization techniques, RT-PCR methods, array-based methods) and at the protein level (eg immunological detection methods such as ELISA or RIA).
  • the quantitative determination of the expression of a gene by detecting the mRNA by means of reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • the quantitative determination of the expression of a gene at the mRNA level can be carried out by any suitable method, e.g. With kinetic PCR or gene expression array techniques, including commercially available platforms such as TaqMan®, Lightcycler®, Affymterix, Illumina, Luminex, Planar Waveguide, microarray chips with optical, magnetic, electrochemical or gravimetric chips
  • the determination of the expression of a gene such as MMP7, RACGAP1, MAPT and / or ESR1, is carried out in a biological sample of a tumor patient, preferably in a sample of tumor tissue, the z. B. was obtained by biopsy.
  • the tumor tissue may be fresh or it may be fixed and / or embedded, for example with formalin and / or paraffin.
  • the biological sample must be pretreated to provide the analyte (s), i. H. the gene expression products of the genes, eg. As proteins or mRNAs, for a subsequent detection reaction to enrich or make available.
  • the invention has been tested as an embodiment on a breast cancer study cohort.
  • a prospective randomized clinical trial Hellenic Cooperative Oncology Group Trial HE 10/97
  • a total of 595 high-risk breast cancer patients (T1-3N1 M0 or T3N0M0) treated with chemotherapy were treated over a 3-year period (1997- 2000).
  • These patients had been biopsied for tumor tissue fixed with formalin and embedded in paraffin (FFPE sample material).
  • FFPE sample material formalin and embedded in paraffin
  • the mRNA was isolated from this FFPE sample material by mRNA extraction and purified by reverse transcription and associated kinetic PCR (kPCR). Based on TaqMan® (Applied Biosystems) the expression of the various marker genes was quantified.
  • FIG. 1 A first figure.
  • the relative expression level was determined according to the formula "40- (CT MMP7-CT RPL37A)", so that a comparatively high number corresponds to a high expression level of MMP7, while a low value corresponds to a low MMP7 level of expression.
  • the genes MMP7 and RPL37A were measured by reverse transcription and related kinetic PCR based on TaqMan®.
  • the fluorescence signals generated within the kinetic PCR reaction are proportional to the initial amount of the original gene particles (RNAs or mRNAs) and exceed a predefined threshold according to the
  • CT value The CT values thus obtained were then transformed into a relative and normalized by either the formula "40- (CT target gene - CT housekeeping gene)", ie "40- (CT MMP7-CT RPL37A)"
  • breast cancer subtypes are listed according to their specific metastasis time; For example, triple negative tumors (classically due to immunohistochemistry negativity for ER, PR, and Her-2 / redefined) metastasize earlier (up to three years), often show elevated MMP7 expression and concomitantly decreased ESR1 expression, and preferentially metastasize to lung (See also below.)
  • the reduction to two major biological motifs for breast cancer, ie stem cell activity and hormone receptor activity allows the prediction of metastatic events in both timing and localization
  • WNT stem cell activities as measured by MMP7 marker gene expression, prevent implantation of tumor cells migrating into the blood and / or lymph circulation into the bones, in particular due to the increased expression of SFRP1 (DCT> 35 according to the formula "40 - (CT SFRP1 - CT RPL37A) ", ie after Abgle me on the housekeeping gene RPL37A.
  • SFRP1 prevents the activation of Bone marrow stem cells and thus prevents the Einnistung of circulating tumor cells in the bone and their development into micrometastatic lesions.
  • Tumor cells with increased stem cell activity represented by increased expression of MMP7 (DCT> 33), SPP1 (DCT> 38), have the ability to metastasize into bone simultaneously with low expression of SFRP1 (DCT ⁇ 35). This is especially true for Her-2 / neu positive tumors that inhibit SFRP1 expression due to Her-2 / neu-related activity.
  • the degree of direct and indirect, negative interaction of stem cell activities is crucial for the metastasis behavior.
  • Estrogen receptor activity mediated largely by the isoforms of ESR1 when there is sufficient estrogen, directly represses transcription factors that mediate stem cell properties (eg, Slug, Snail, FOXC2, and Twist) and indirectly inhibits other stem cell properties by upregulating inhibitory members of stem cell activity.
  • Signaling pathways eg, increased expression of E-cadherin, thereby reducing WNT stem cell activity due to the decreased amount of beta-catenin).
  • ESR1 increased expression after alignment on RPL37A as of DCT 34
  • MLPH increased expression after alignment on RPL37A as of DCT 34
  • ALCAM increased expression after alignment on RPL37A as of DCT 34
  • Hormone receptor marker genes and MMP7 increased expression after alignment on RPL37A from DCT 32
  • SFRP1 increased expression after alignment on RPL37A from DCT 35
  • KRT5 increased expression after alignment on RPL37A from DCT 34
  • OPN increased expression after alignment on RPL37A DCT 34
  • ESR1 have an elevated and early metastasis rate in the time frame between one and three years ("1", lower red line)
  • Example characterized the tumors whose DCT ratios of MMP7 and ESR1, according to the formula "(40 - (CT MMP7 - CT RPL37A)) - (40 - (CT ESR1 - CT RPL37A))” or "CT MMP7 - CT ESR1" , above the value -2,7.
  • Patients with MMP7-negative tumors ("2", upper green line) show no increased and early metastasis rate in the 1 to 3 year window compared to the underlying risk within this cohort shown in FIG.
  • the genes RACGAP1 and MAPT were measured by reverse transcription and related kinetic PCR based on TaqMan®.
  • FIG. 1 shows by way of example a refined algorithm consisting of the gene ratio of RACGAP1 and MAPT in combination with MMP7 as a flowchart or decision tree.
  • Primary breast tumors from 315 patients were available for analysis. Based on the ratio of RACGAP1 to MAPT and the cut-off point of DCT 0.39, the patients were divided into two groups.
  • cytoskeleton of the cell is of crucial importance for cell division and migration.
  • the balance between migration and micrutulbar stabilization is of crucial importance for both the level of cell division activity (Y-axis), as well as the time of distant metastasis (X-axis) and the location of distant metastasis.
  • breast cancer subtypes are listed according to their specific metastasis time; For example, triple negative tumors (classically due to immunohistochemistry negativity for ER, PR and Her-2 / redefined) metastasize earlier (up to three years), often show elevated RACGAP 1 expression and simultaneously decreased MAPT expression, and preferentially metastasize in lung, brain and liver and more rarely in the bones (see also below) .
  • triple negative tumors classically due to immunohistochemistry negativity for ER, PR and Her-2 / redefined metastasize earlier (up to three years)
  • RACGAP 1 epidermatitis
  • MAPT preferentially metastasize in lung, brain and liver and more rarely in the bones
  • the reduction to two crucial biological motifs for breast cancer both on regulation of the microtubule cell skeleton, allows prediction of metastatic events.
  • the hormone receptors ESR1 and PGR influence the microtubulidynamics by increasing the MAPT expression in order to differentiate the cells.
  • the degree of positive versus negative regulation of microtubility is crucial for metastasis behavior and resistance to chemotherapeutic agents. This is particularly relevant for resistance to taxane-containing therapies (such as in the HE10 / 97 study) because they are said to "freeze” the microtubule system and cause suicide of the dividing or migrating cell
  • genes of interest in this regard are RACGAP1 (increased expression after alignment on RPL37A from DCT 34) and TOP2A (increased expression after alignment on RPL37A as of DCT 34), as cell division and migration motif and MAPT (increased expression after alignment on RPL37A as of DCT 34), ESR1 (ESR1) increased expression after alignment on RPL37A from DCT 34), PGR (increased expression after alignment on RPL37A from DCT 32), as a microtubule stabilization and differentiation motif
  • RACGAP1 and MAPT are exemplified (see target gene activity)
  • Tumors with elevated RACGAP1 to MAPT ratio (DCT> 0.39) using ALCAM identified those tumors that have a low risk of metastasis.
  • the decision point used is the cut-off of RPL37A normalized ALCAM values at a DCT value of 35.4.
  • Tumors with ALCAM expression above DCT 35.4 are at lower risk ("2" mean green line, 10% femtastasis rate at three years) than tumors with lower ALCAM expression ("3" lower blue line; 44% femtastastation rate after three years) years).
  • the low-cost protocol is characterized by a low ratio of RACGAP1 to MAPT (DCT ⁇ 0.39) and is identical to the low-cost protocol of Figures 8 and 6.
  • sequence accession numbers are from the following database: http://genome.ucsc.edu/ UCSC Genome Browser:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der in vitro-Diagnostik und betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Metastasierungsrisikos eines Tumors, wobei ein hohes Metastasierungsrisiko anzeigt, dass nachfolgende Untersuchungen mittels bildgebender Verfahren für den Patienten indiziert sind.

Description

Verfahren zur Bestimmung des Metastasierungsrisikos als Indikator für eine bildgebende Diagnostik Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der in vitro-Diagnostik und betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Metastasierungsrisikos eines Tumors, wobei ein hohes Metastasierungsrisiko anzeigt, dass nachfolgende Untersuchungen mittels bildgebender Verfahren für den Patienten indiziert sind. Krebserkrankungen sind in Europa die zweithäufigste Todesursache. Gegenwärtig sind etwa 100 verschiedene Krebserkrankungen bekannt, die sich in Krankheitsbild, Überlebenschance und Behandlungsmöglichkeiten stark unterscheiden. Insbesondere die Metastasierung, d. h. die Absiedlung von Tumorzellen des Primärtumors in andere, zum Teil entfernt liegende Organe ist dabei von entscheidender Bedeutung für das Überleben eines Patienten. Das Wissen um das Risiko einer Metastasierung sowie die Früherkennung von Metastasen ist außerordentlich wichtig, um frühzeitig, bevor weitere Organe befallen werden, therapeutische Maßnahmen ergreifen zu können. In diesem Stadium einer Krebserkrankung haben chirurgische oder systemische Behandlungsansätze die höchste Erfolgswahrscheinlichkeit und sind auch kostengünstiger durchzuführen als in späteren Stadien.
In der Tumordiagnostik werden zunehmend in vitro-Verfahren zur Bestimmung von Tumormarkern eingesetzt, wie z. B. gewebsbasierte Genuntersuchungen auf RNA- oder DNA-Ebene oder Blutuntersuchungen. Diese Marker ermöglichen eine Vorhersage des Krankheitsverlaufs, eine effiziente Verlaufskontrolle und Therapiebeurteilung. Weitere Anwendungsgebiete für tumordiagnostische Marker sind die Untersuchung von Risikogruppen (z. B. bei positiver Familienanamnese, Leberzirrhose, Hodenhochstand, gynäkologischen Tumoren), die Differentialdiagnostik bei unklaren Tumoren, z. B. bei nicht auffindbarem Primärtumor und die Prognose des Krankheitsverlaufs. Das Ziel der Tumordiagnostik ist die Verlängerung der Überlebensdauer für den betroffenen Patienten, die Verbesserung seiner Lebensqualität, aber auch die Verminderung von Behandlungs- und anderen Folgekosten. Bisherige Genuntersuchungen haben zumeist das Ziel, prognostische oder prädiktive Aussagen hinsichtlich einer definierten Erstbehandlung einer Tumorerkrankung zu ermöglichen. Die Aussagen sind dabei nicht spezifiziert auf einen bestimmten Zeitpunkt oder die Lokalisierung von Metastasen. Die bisherigen Genuntersuchungen haben auch nicht zum Ziel das Scheitern einer Primärbehandlung zu dem Zwecke vorherzusagen eine adaptierte Nachsorge und Zweitbehandlung durchzuführen.
Tumormarker sind Substanzen, welche vom Krebs selbst oder vom Organismus als Reaktion auf das Tumorwachstum gebildet werden. Tumormarker treten in erhöhten Konzentrationen im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, z. B. Tränensekret, Aszites, Liquor oder Urin auf. Die Konzentrationsbestimmung von Tumormarkern ermöglicht Rückschlüsse auf das Vorliegen, den Verlauf und die Prognose von Tumorerkrankungen. Die messbare Konzentration an Tumormarkern in Körperflüssigkeiten ist unter anderem abhängig von der Gesamtzahl an Tumorzellen (Tumormasse), der Reaktion des umliegenden Tumorstromas, der Syntheserate des Tumormarkers, der Blut- und Lymphversorgung des Tumors und von der markerspezifischen Halbwertszeit. Problematisch ist jedoch, dass nahezu alle heute bekannten Tumormarker in niedriger, aber variierender Konzentration auch bei gesunden Menschen vorkommen und nicht nur bösartige Erkrankungen zu einer Erhöhung der Tumormarker führen können. Tumormarker, die bislang zumeist in der Serum- und Plasmadiagnostik eingesetzt wurden, zeichnen sich fast ausnahmslos durch unbefriedigende Sensitivität und Spezifität aus. Insbesondere werden entstehende Metastasen von hormonrezeptomegativen Hochrisikotumoren durch konventionelle Marker wie etwa CEA und CA15-3 nicht erkannt [Sener Dede D, Aksoy S, Bulut N, Dizdar O, Arik Z, GuIIu I1 Ozisik Y, Altundag K (2009) Comparison of serum levels of CEA and CA 15-3 in triple-negative breast Cancer at the time of metastases and serum levels at the time of first diagnosis. J Clin Oncol 27, 2009 (suppl; abstr e12017)], so dass ein rein auf Tumormarkerdiagnostik in Blutproben ausgelegtes Metastasescreening nicht über eine Sensitivität von 60-70 % hinauskommen kann. Die Primärdiagnose einer Tumorerkrankung wird im Allgemeinen durch eine klinische Untersuchung, durch bildgebende und/oder endoskopische Verfahren und/oder eine Biopsie mit anschließender pathologischer Abklärung diagnostiziert. Anschließend werden die tumorspezifischen Laborparameter in vitro bestimmt, da die Tumornachsorge schon zum Zeitpunkt der Primärdiagnose geplant werden muss. Die meisten Krebserkrankungen werden als potenziell systemische Erkrankungen therapiert, da in einem noch frühen Stadium bereits ein signifikantes Risiko für das Vorhandensein von noch nicht erkennbaren Mikro- oder Makrometastasen in entfernter liegenden Körperregionen besteht. Demzufolge ist eine systemische Therapie (z. B. Chemotherapie oder endokrine Therapie), die die Bekämpfung solcher noch minimalen Resterkrankungen zum Ziele hat, integraler Bestandteil der initialen Krebstherapie. Problematisch ist jedoch, dass nur ein Teil der Patienten (zwischen 10 % und 70 % je nach Tumorart) nach lokaler Behandlung des Primärtumors durch Operation und/oder Bestrahlung tatsächlich noch Metastasen in entfernter liegenden Körperregionen aufweist. Diese minimalen Resterkrankungen sind zu dem frühen Zeitpunkt der Erstbehandlung des Primärtumors mit Hilfe der Standard-in vivo-Bildgebungsverfahren, wie z. B. PET-CT, PET-MRT oder MRT allerdings noch nicht nachweisbar. Das Heranwachsen der nicht nachweisbaren Mikrometastasen zu klinisch manifesten Makrometastasen dauert unterschiedlich lange, je nach Tumorbiologie des Primärtumors, Gesamtkonstitution des Patienten und mehr oder minder zufälliger Einnistung von Tumorzellen in entfernt liegenden Organsystemen. Als derzeit wichtigster Surrogatparameter für eine mögliche Fernabsiedlung von Primärtumoren in (nicht hämatogene bzw. lymphogene) Organsysteme, d. h. für eine mögliche Metastasierung, dient der Lymphknotenstatus von Krebspatienten. Der Lymphknotenstatus wird konventionellerweise durch operative Entfernung der axillären Lymphknoten und pathologischer Begutachtung derselben ermittelt. Dabei wird hinsichtlich des Risikos der Fernmetastasierung zwischen Patientinnen unterschieden, bei denen keine, 1 bis 3 oder mehr als 3 Lymphknoten abgesiedelte Tumorzellen aufweisen. Dieser Parameter allein ist allerdings nur unzureichend sensitiv und spezifisch hinsichtlich des Vorhandenseins von Mikrometastasen und deren Entwicklung zu letalen Makrometastasen und sagt auch nichts über Zeitpunkt oder Ort der Metastasierung aus. Um das Vorhandensein von Mikrometastasen überhaupt diagnostizieren zu können, werden in der klinischen Routine derzeit u. a. Knochenmarksbiopsien durchgeführt, die anschließend histopathologisch mit monoklonalen Antikörpern gegen Zytokeratine untersucht werden. Die klinische Relevanz dieser Minimalerkrankungen ist jedoch umstritten, da es sich hierbei auch um ruhende Tumorzellen handeln könnte, die sich niemals zu distanten Metastasen entwickeln werden und somit ebenfalls nur als weiterer Surrogatparameter für eine mögliche, bevorstehende Fernmetastasierung zu betrachten sind. Da es sich bei einer Biopsie um einen invasiven Eingriff in den menschlichen Körper handelt - oft unter Vollnarkose -, der oft mit Schmerzen und Risiken für den Patienten verbunden ist, muss ihre Durchführung sorgfältig erwogen werden. Bei begründetem Verdacht auf eine proliferative oder neoplastische Veränderung ist eine Biopsienahme oder sogar direkte Operation indiziert. Für ein Screening (Durchmustern) breiter asymptomatischer Kollektive ist die Biopsie jedoch völlig ungeeignet. Eine andere Form der Tumordiagnostik ist die Anwendung sogenannter bildgebender Verfahren. Darunter werden Untersuchungsmethoden verstanden, mit deren Hilfe Strukturen und Organe des Körpers sichtbar gemacht werden können. Beispiele hierfür sind Untersuchungen mittels Röntgenstrahlen, Computertomographie, Kernspintomographie, Ultraschalldiagnostik, Szintigraphie, Positronenemissionstomographie. Auch die Endoskopie fällt unter die bildgebenden Verfahren, wobei im Gegensatz zu den oben genannten Verfahren jedoch eine Sonde in den Körper des Patienten eingeführt werden muss. Bildgebende Verfahren haben den Nachteil, dass sie mit hohen Kosten verbunden sind und oft mit einer Strahlenbelastung einhergehen. Daher sind auch diese Verfahren nicht für ein Screening großer asymptomatischer Kollektive geeignet.
Es besteht also ein Bedarf nach einem wirksamen, möglichst nicht-invasiven Verfahren zur verlässlichen Vorhersage des Metastasierungsrisikos eines Tumors bzw. zur Identifizierung von Krebspatienten, die mit hoher Wahrscheinlichkeit Metastasen entwickeln werden. Auch wenn der Primärtumor eines Krebspatienten mit einer initialen Krebstherapie erfolgreich behandelt wurde und der Patient keine Symptome mehr zeigt, besteht weiterhin die Gefahr der Entstehung von Metastasen. Krebspatienten, bei denen ein hohes Metastasierungsrisiko diagnostiziert wird, könnten regelmäßig und intensiviert mit auf Fernmetastasierung abzielenden Nachsorgeuntersuchungen, bevorzugterweise mittels bildgebender Verfahren beobachtet werden, damit Metastasen so frühzeitig wie möglich erkannt und schließlich therapiert werden können.
Eine intensivierte Nachsorge aller Krebspatienten - ohne vorherige Risikostratifikation - erbrachte in den bisherigen randomisierten, prospektiven
Studien keinen Überlebensvorteil [EBM Reviews (1994). Intensive Diagnostic Follow- up did not improve survival in breast Cancer. ACP Journal Club 121 :77]. Zudem wäre eine intensivierte Nachsorge aller Krebspatienten mit extremen Kosten verbunden, da regelmäßige bildgebende Verfahren mit hoher Richtig-Negativ Rate (>95 %) durchgeführt werden müssten. Demzufolge ist eine regelmäßige und auf Femmetastasierung abzielendende Nachsorge bei asymptomatischen Patienten derzeit bei keiner Krebserkrankung indiziert, wie am Beispiel Brustkrebs ausgeführt [Janni W, Gerber B; Arbeitsgemeinschaft Gynäkologische Onkologie (2009). Breast Cancer Follow-Up. Gidelines Breast Version 2009.1.0. http://www.ago- online.org/download/g_mamma_09_1 _0_14_breast_cancer_follow_up.pdf]. Derzeitig wird eine regelmäßige ärztliche Kontrolle empfohlen, die sich auf Abtasten und Erfragen des Allgemeinzustandes beschränkt. Erst bei klinischem Verdacht, zumeist begründet durch erste symptomatische Auffälligkeiten (Schmerzen oder Ausfälle in distanten Organsystemen) wird eine adaptierte, bildgebende Diagnostik durchgeführt (z. B. Ultraschall der Leber, Knochenszintigramm, PET-CT oder MRT des Gehirns). In diesen bereits symptomatischen Stadien ist eine kurative Behandlung mit dem Ziel der Heilung der Patienten meist leider nicht mehr möglich, und es entstehen hohe Folgekosten auf Grund von leitliniengerechten, kostenintensiven Palliativbehandlungen, die den Aufschub des Versterbens oder die Linderung der Schmerzen zum Ziel hat. Der vorliegenden Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, ein nicht-invasives in vitro-Verfahren bereit zu stellen, mit dem das Metastasierungsrisikos eines Tumors verlässlich, d. h. spezifisch und sensitiv vorhergesagt werden kann bzw. mit dem solche Krebspatienten identifiziert werden können, die mit hoher Wahrscheinlichkeit Metastasen entwickeln werden.
Unter dem Begriff diagnostische „Sensitivität" wird der Anteil richtig-positiver Testergebnisse an der Gesamtzahl aller Kranken in Prozent verstanden.
Unter dem Begriff diagnostische „Spezifität" wird der Anteil richtig-negativer Testergebnisse an der Gesamtzahl an Nichterkrankten in Prozent verstanden.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich durch gewebebasierte Genmessung bzw. auch durch die Kombination von gewebebasierter Genmessung und blutbasierter Tumormarkermessung ein Metastase-Screening mit hoher Sensitivität und sinnvoller Spezifität vorhersagen lassen. Dies ermöglicht es erstmals bereits zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bzw. kurz vor oder nach der ersten Behandlung, die im allgemeinen meist eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und ggf. auch endokrine Therapien umfasst, eine weitere Therapieplanung durchführen zu können, die ein intensiviertes Nachsorgeprogramm umfasst. Hierbei werden Metastaserisiken zeitabhängig vorhergesagt, so dass im Gegegnsatz zu den bisher üblichen Prädiktoren, Risikokollektive definiert werden, die zeitabhängig, beispielsweise innerhalb der ersten drei Jahre oder in den Jahren 3 bis 5 oder in den Jahren 8 bis 12 nach Erstdiagnose, für ein definiertes Metastasierungsgeschehen angereichert sind.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass in einer biologischen Probe eines Tumorpatienten mindestens die Expression von MMP7 quantitativ bestimmt wird, wobei eine hohe (erhöhte) MMP7-Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine fehlende oder niedrige MMP7-Expression kein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt. Dies wurde im Rahmen der adjuvanten Brutskrebsstudie HE10/97 getestet [Fountzilas G. et al., Postoperative dose-dense sequential chemotherapy with epirubicin, followed by CMF with or without paclitaxel, in patients with high-risk operable breast cancer: a randomized phase III study conducted by the Hellenic Cooperative Oncology Group. Ann Oncol. 2005 Nov;16(11):1762-71]. Im Rahmen dieser Studie wurde die Wirksamkeit von zwei Therapieformen untersucht: eine erste Therapieform umfassend Epirubicin gefolgt von Paclitaxel, gefolgt von dosisintensiviertem Cyclophosphamide, Methotrexate und Fluoruacil sowie eine zweite Therapieform umfassend Epirubicin gefolgt von dosisintensiviertem Cyclophosphamide, Methotrexate und Fluoruacil. 604 Patientinnen mit fortgeschrittenen Brusttumoren (T1-3 N1 MO oder T3N0M0) wurden randomisiert mit einer der beiden Therapieformen behandelt. Formalin-fixierte und Paraffin-eingebettete Proben von 315 therapienaiven Patientinnen standen für die Analyse zur Verfügung. RNA aus jeweils einem 10 μm-Tumorschnitt wurde mittels einer halbautomatisierten, Bead-basierten Technik isoliert (Bohmann K. et al., RNA Extraction from Archival FFPE Tissue: A Comparison of Manual, Semi-automated and FuIIy Automated Purification Methods Clin Chemistry 2009, ePub JuIy 17, 2009). Die relativen Expressionswerte von MMP7 wurden anschließend mittels quantitativer PCR unter Verwendung von TaqMan® Sonden für die jeweiligen Zielgene und Housekeeping Gene identisch mit den bereits publizierten Daten und Verfahren verwendet [Pentheroudakis G. et al., Gene expression of estrogen receptor, progesterone receptor and microtubule-associated protein Tau in high-risk early breast cancer: a quest for molecular predictors of treatment benefit in the context of a Hellenic Cooperative Oncology Group trial. Breast Cancer Res Treat. 2009 Jul;116(1):131-43; Koutras A. K. et al., Evaluation of the prognostic and predictive value of HER family mRNA expression in high-risk early breast Cancer: a Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) study. Br J Cancer. 2008 Dec 2;99(11):1775- 85]. Bei der kinetischen RT-PCR Methodik werden innerhalb der kinetischen Polymerase-Ketten-Reaktion (= PCR) genspezifische Fluoreszenzsonden, bei denen der Fluoreszenzfarbstoff durch einen „Quencher" blockiert ist, durch Abbau der Sonden freigesetzt und messtechnisch als Licht detektierbar. Die entstehenden Fluoreszenzsignale sind bei dieser Methodik proportional zur Menge der in einer Probe enthaltenen mRNA eines Gens. Überschreiten die freigesetzten Fluoreszenzfarbstoffe nach Anregung einen vordefinierten Helligkeitsschwellenwert (= Threshold bzw.„T") wird die Zahl des Reaktionszykluses als Messwert für dieses Gen verwendet. Die Höhe dieses Messwertes korreliert mit der Menge der in der Gewebeprobe vorhandenen mRNA eines Zielgens. Der Schwellenwert wird je nach Ausgangsmenge des Zielgens zu einem unterschiedlich frühen Zeitpunkt der durchgeführten Reaktionszyklen überschritten. Je mehr mRNA vorhanden war, desto früher wird der Schwellenwert überschritten. Der Reaktionszyklus, bei dem der Schwellenwert des jeweiligen Genes überschritten wird, wird auch als„CT" Wert bezeichnet („Cycle of Threshold"). Ein um den Wert 1 höherer CT Wert entspricht dabei einer doppelt so hohen Ausgangsmenge der Zielgen-RNA, was mathematisch betrachtet einer logarithmischen Darstellung der relativen Genexpression entspricht. Die Messergebnisse des Zielgens MMP7 wurden gemäß der in Pentheroudakis G. et al. (2009) und in Koutras A. K. et al. (2008) (vollständiges Zitat siehe oben) publizierten Methodik auf das gleichmäßig exprimierte, ribosomale„Housekeeping" Gen RPL37A normalisiert und gemäß der Formel ,,40-(CT Wert von MMP7 - CT Wert von RPL37A)" in DCT Werte (=„Delta CT" Werte) umgerechnet. Figur 1 zeigt die Verteilung der auf RPL37A normalisierten Genexpressionshöhen von MMP7 als Einzelgen und nach Normalisierung durch die oben genannnte Formel. Die mediane Expressionshöhe von MMP7 nach Normalisierung auf RPL37A beträgt DCT 30,76. 50 % der Tumore weisen also eine relative Expressionshöhe von MMP7 von über DCT 30,76 auf und haben somit eine erhöhte Expression von MMP7. Darüber hinaus erkennt man, daß ca. 10 % der Tumore eine MMP7-Expressionshöhe von mindestens DCT 33 haben in Figur 2) und somit eine stark erhöhte Expression von MMP7. Dichotomisiert man die Brustkrebspatientinnen in zwei Gruppen anhand der relativen Expressionshöhe von MMP7 über den Wert von DCT 33, so ergibt sich ein signifikant (p=0,005) kürzeres Metastase-freies Überleben der intensiv chemo- und hormontherapierten Brustkrebspatientinnen (Figur 2). Ca. 40 % der Brustkrebspatientinnen mit einer relativen MMP7 Expressionshöhe von > DCT 33 weisen eine Fernmetastasierung nach nur 30 Monaten auf. Interessanterweise kommt es nach einem Zeitraum von mehr als 36 Monaten Nachbeobachtungszeit innerhalb dieses Kollektives zu keinen weiteren Metastasierungen.
Unter dem Begriff „erhöhtes Metastasierungsrisiko" ist ein Risiko für das Auftreten von Metastasen zu verstehen, das gegenüber dem statusabhängigen Grundrisiko des Auftretens von Metastasen für einen bestimmten Tumortyp unter Berücksichtigung des Einflusses von einer etwaigen Behandlung, Tumorgröße, Proliferationsstatus der Tumorzellen, Alter des Patienten etc. erhöht ist. Es ist beispielsweise bekannt, dass im Fall von nodalpositiven Mammakarzinomen trotz Chemotherapie und endokriner Therapie ein Grundrisiko von ca. 15 % bis 20 % besteht, innerhalb von 5 Jahren nach der ersten Diagnose bei neoadjuvant behandelten Patientinnen bzw. nach Operation bei adjuvant behandelten Patientinnen Fernmetastasen zu entwickeln. Im Beispiel der adjuvanten HE10/97 Studie betrug das Risiko innerhalb der ersten drei Jahre eine Fernmetastase zu erleiden im untersuchten Subkollektiv von 315 Patientinnen ca. 20 %. Bei jeder 5. Patientin des Patientenkollektivs wurde also innerhalb der ersten drei Jahre eine symptomatische Fernmetastase entdeckt (Figur 3). Darüber hinaus fällt auf, dass auch im weiteren Verlauf Fernmetastasierung symptomatisch wird, so dass schliesslich ca. 32 % der Patientinnen distant metastasiert sind. Die Diagnose, dass ein Tumor eine hohe MMP7 Expression hat, birgt zweierlei Informationen bezüglich der weiteren Nachbeobachtung. Zum einen deutet dies auf ein erhöhtes Fernmetastasierungrisiko innerhalb der ersten drei Jahre hin, so dass durch frühzeitige bildgebende Verfahren die Chance besteht, eine Metastase frühzeitig zu erkennen und effektiv zu behandeln, insbesondere durch lokale Therapiemaßnahmen (Bestrahlung, Chirurgie), die in weiterfortgeschrittenen Stadien nicht mehr möglich oder sinnhaft wäre. Andererseits weiß man, dass bei Patientinnen mit MMP7-Tumoren, wenn die dreijährige Nachbeobachtungszeit ohne Fernmetastasierung verlaufen ist, die Wahrscheinlichkeit einer später auftretenden Metastase nahezu auszuschließen ist. Demzufolge bedürfen derartige Patientinnen keiner weiteren Nachbeobachtungsmaßnahme mehr. Dies bringt neben psychologischen Vorteilen für die Patientinnen auch den Vorteil mit sich, dass zusätzliche Kosten auf Grund von jahrelangen klinischen Untersuchungen eingespart werden können. Die Kostenersparnis durch Weglassen von verlängerter Nachbeobachtung in dieser Patientengruppe könnte also eine intensivere, frühere Diagnostik gegenfinanzieren. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen des Metastasierungsrisikos eines Tumors, wobei in einer biologischen Probe eines Tumorpatienten mindestens die Expression von MMP7 quantitativ bestimmt wird, wobei eine hohe (erhöhte) MMP7-Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine fehlende oder niedrige MMP7-Expression kein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass ein erhöhtes Metastasierungsrisiko eines Tumors verlässlich vorhergesagt werden kann und dass so ein Krebspatient einer Risikogruppe zugeordnet werden kann, für die auf Fernmetastasierung abzielendende diagnostische Nachsorgeuntersuchungen, bevorzugterweise mittels bildgebender Verfahren, indiziert sind. Ferner kann in dem Hochrisikokollektiv für eine frühe Metastasierung eine Nachbeobachtung nach länger als drei Jahren eingespart werden. Unter „auf Fernmetastasierung abzielende diagnostische Nachsorgeuntersuchungen" sind insbesondere bildgebende Verfahren zu verstehen, mit deren Hilfe Strukturen und Organe des lebenden Körpers sichtbar gemacht werden können. Beispiele hierfür sind Untersuchungen mit Röntgenstrahlen, Computertomographie (CT), Kemspintomographie, Ultraschall, Szintigraphie, Positronenemissionstomographie (PET), Magnetresonanztomographie (MRT).
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht bereits zum Zeitpunkt der Erstdiagnose des Primärtumors bzw. kurz vor oder nach der ersten Behandlung, die im Allgemeinen eine Operation, Bestrahlung, Chemotherapie und/oder eine endokrine Therapie umfasst, eine Nachsorgeplanung für die gezielte Weiterbehandlung des Patienten. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also die Identifizierung von Patienten, die aufgrund ihres erhöhten Metastasierungsrisikos von einer intensivierten Nachsorge, bevorzugterweise mittels bildgebender Verfahren, insofern profitieren werden, als dass durch eine gezielte, regelmäßige Untersuchung mittels bildgebender Verfahren Metastasen frühestmöglich entdeckt und therapiert werden können, wodurch sich die Überlebenschancen verbessern. Gleichzeitig ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Identifizierung von Patienten, die aufgrund eines nicht erhöhten Metastasierungsrisikos nicht von einer intensivierten Nachsorge mittels bildgebender Verfahren profitieren würden. Bei diesen Patienten kann auf Grund des geringen Risikos auf regelmäßige und auf Fernmetastasierung abzielende Nachsorgeuntersuchungen verzichtet werden. Dies hat einerseits den medizinischen Vorteil, dass diese Patienten nicht durch überflüssige Untersuchungen belastet werden, z. B. durch strahlungsintensive bildgebende Verfahren, und andererseits den sozioökonomischen Vorteil, dass die Kosten für unnötige Untersuchungen eingespart werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich die Expression von ESR1 in einer biologischen Probe des Tumorpatienten quantitativ bestimmt, wobei eine fehlende oder niedrige ESR1 -Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine hohe (erhöhte) ESR1 -Expression kein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt. Dieser Berechnung liegt die Beobachtung zu Grunde, dass das Metastasierungsrisiko maßgeblich auf zwei für das Brustkrebs entscheidende biologische Motiven reduziert werden kann, nämlich Stammzellaktivität und Hormonrezeptoraktivität, um eine Vorhersage von Metastasierungsereignissen sowohl bezüglich des Zeitpunktes als auch der Lokalisation zu ermöglichen (Figur 4). Eine erhöhte ESR1 -Genaktivität korreliert mit Knochenmetastasierung und späten Metastasierungereignissen. Erfindungsgemäß ist der Grad der direkten und indirekten negativen Interaktion von Stammzellaktivitäten entscheidend für das Metastasierungsverhalten. Die Östrogenrezeptoraktivität reprimiert direkt Stammzellaktivitäten von Transkriptionsfaktoren, die Stammzelleigenschaften vermitteln (z. B. Slug, Snail, FOXC2 und Twist) und inhibiert andere Stammzelleigenschaften indirekt durch Hochregulation von inhibitorisch wirkenden Mitgliedern von Stammzellaktivitäts- Signalwegen (z. B. erhöhte Expression von E-Cadherin, dadurch verminderte WNT- Stammzellaktivität auf Grund der verminderten beta-Catenin Menge). Gene, die in diesem Zusammenhang von Interesse sind ESR1 , MLPH, AR, ALCAM als Hormonrezeptormarkergene und MMP7, SFRP1 , Snail, Slug, FOXC2, TWIST, KRT5, notch, TGFB, OPN als Stammzellaktivitätsmarker. In der Figur 5 sind ESR1 und MMP7 beispielhaft aufgeführt. Hierfür wurde die Differenz der beiden negativ regulierten Gene MMP7 und ESR1 dadurch gebildet, dass der nicht auf RPL37A normalisierte CT von ESR 1 von dem ebenfalls nicht auf RPL37A normalisierten CT Wert von MMP7 abgezogen wird (CT MMP7 - CT ESR1). Mathematisch betrachtet kann die Differenz auch durch die Differenzbildung von ESR1 - MMP7 erzielt werden. Beide Rechnungen sind äquivalent. Vorteilhaft gegenüber der in Figur 2 dargestellten Lösung ist dieses Genverhältnis aus verschiedenen Gründen. Zum einen, weil durch das Verhältnis weitere Brustkrebspatientinnen richtigerweise als Hochrisiko eingestuft werden können, die innerhalb von drei Jahren metastasieren. Dies bewirkt eine erhöhte Sensitivität. Mit dem MMP7 Einzelgennachweis werden 36 Patientinnen der Hochrisikogruppe zugeordnet und ergeben ein ca. 50 %iges Fernmetastasierungsrisiko (18 von 36 MMP7 positiven Patientinnen erleiden einen Rückfall). Wie man in Figur 5 erkennt, werden mit dem Genverhältnis zwischen MMP7 und dem gegenregulierten ESR1 36 Patientinnen der Hochrisikogruppe zugeordnet und ergeben ein ca. 44 %iges Fernmetastasierungsrisiko (35 von 80 MMP7-ESR1 positiven Patientinnen erleiden einen Rückfall). Eine erhöhte Expression von MMP7 entspricht im Falle der Differenz mit ESR1 ein DCT Wert von größer als -2,7. Ein weiterer Vorteil dieser Methodik ist, dass durch die Bildung des Genverhältnisses mittels Subtraktion der rohen CT Werte die Notwendigkeit entfällt, ein oder mehrere„Housekeeping" Gene zu messen. Dies reduziert das Risiko einer Verfälschung der Daten durch systematische Fehler, also wenn das per definitionem „neutrale" und immer gleichmäßig produzierte Housekeeping-Gen doch nicht so gleichmäßig produziert wird und in bestimmten Tumoren, ohne dass es in Zusammenhang stände mit der Prognose, der Patientinnen stärker oder schwächer produziert wird. Dies birgt die Gefahr, dass bei einzelnen Tumoren eine Über- oder Unterschäzung des Risikos resultieren könnte. Durch die erfindungsgemäße Kombination von zwei informationstragenden Genen, die gegenreguliert sind, besteht diese Gefahr nicht mehr. Weiterhin werden so Reagenzienkosten eingespart, der Durchsatz an Patientenproben erhöht und die Möglichkeit einer Multiplex Messung aller notwendigen Gene in nur einem Reaktionsgefäß geschaffen (z.B. eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 384 Reaktionskammern).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich die Expression von MAPT und die Expression von RACGAP1 in einer biologischen Probe des Tumorpatienten quantitativ bestimmt , wobei eine niedrige MAPT-Expression kombiniert mit einer hohen RACGAP1 -Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine hohe MAPT-Expression kombiniert mit einer niedrigen RACGAP1 -Expression ein geringes Metastasierungsrisiko anzeigt (Figur 6). Es zeigt sich, dass auch die Reduktion auf die Motive „Invasion" bzw. „Zellwanderung" (bestimmt durch das RAC GTPase Aktivierende Protein 1) und „hormonabhängige Mikrotubuli-Regulation" (bestimmt durch das Mikrotubulus- Assozierte Protein TAU) sinnvoll ist. Dies ist insbesondere deshalb interessant, da beide Proteine funktional das Mikrotubulus-Zytoskelett und somit die Veränderung der Zellmorphologie, wie sie etwa bei der Wanderung von Zellen oder bei der Verteilung der Chromosomen während der Zellteilung notwendig ist, beeinflussen. Beide Gene bzw. Genprodukte wirken dabei an entgegengesetzten Prozessen mit. Das Gleichgewicht dieser Genprodukte ist deshalb mitentscheidend für das Wachstums- und Wanderungsverhalten von Tumorzellen (Figur 9). Beide sind Voraussetzung für den Prozess der Femmetastasierung. Das Verhältnis der beiden Prozesse lässt sich im Sinne der Erfindung insbesondere durch die Differenz der rohen CT Werte oder aber der auf das Housekeeping-Gen RPL37A normalisierten Werte ermitteln. Testet man das dieses Verhältnis an den RNA Extrakten der 315 Primärtumore der HE10/97 Brustkrebsstudie, besteht bei 43 % der Patientinnen ein hohes Fernmetastasierungsrisiko für die Zeitdauer der ersten drei Jahre (77 von 178 RACGAP1 positiven Patientinnen mit einer Differenz von RACGAP1 - MAPT > 0,39 erleiden einen Rückfall). Diesem Genverhältnis liegt die Rationale zu Grunde, dass sowohl RACGAP1 als auch MAPT Einfluss auf die Dynamik des Mikrotubuli- Zytoskeletts haben, allerdings in entgegengesetzter Richtung: während RACGAP1 eine erhöhte Dynamik bewirkt, indem es die Zellteilung und Zellmigration begünstigt, verringert MAPT die Dynamik, indem es in stark differenzierten Geweben die Mikrotubulistruktur erhält. Vorteilhafterweise nimmt so auch die Zahl der Falsch- Negativen Patientinnen in der RACGAP1 negativen Gruppe ab, so dass nur noch 16 % der Niedrig-Risikopatientinnen einen Rückfall und dann zumeist nach 3 Jahren erleiden. Da im Rahmen der untersuchten HE 10 /97 Studie zudem Taxane gegeben wurden, die die Mikrotubuli als therapeutisches Ziel stabilisieren, erscheint die Genauswahl auch klinisch nachvollziehbar. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform ist die Hinzunahme von MMP7 zu dem Expressionsverhältnis RACGAP1 zu MAPT sinnvoll. Hierzu wurde das Expressionsverhältnis von RACGAP1 zu MAPT mit dem auf RPL37A normalisierten MMP7-Gen per Entscheidungsbaum mit definiertem Cut-Off (DCT von 31 ,8 für MMP7 und 0,39 bei dem Genverhältnis von RACGAP1 -MAPT) verknüpft (Figur 7). Hierdurch wird ein Hochrisikokollektiv erkannt. Durch Hinzunahme von MMP7 zu dem Verhältnis von RACGAP1-MAPT kann man zudem ein Hochrisikokollektiv von einem Mittleren- und Niedrig-Risikokollektiv unterscheiden. Zudem ergibt sich durch die Aufspaltung mittels MMP7 die Möglichkeit, den Metastasierungsort vorherzusagen, da das so entstehende MMP7 positive Patientenkollektiv bevorzugt im Gehirn, in den Lungen und in der Leber metastasiert, seltner in den Knochen, insbesondere wenn es sich zusätzlich um Her-2/neu positive Tumore (DCT >38 von Her-2/neu) handelt.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich unter anderem zum Bestimmen des Metastasierungsrisikos eines Tumors aus der Gruppe Mammakarzinom, Ovarialkarzinom, Kolorektalkarzinom, Lungenkarzinom, Magenkarzinom und Hals- Kopf-Karzinom. _ _
Die quantitative Bestimmung der Expression eines Gens, wie beispielsweise von MMP7, RACGAP1 , MAPT und/oder ESR1 , kann sowohl auf Nukleinsäureebene (z. B. RNA-Hybridisierungstechniken, RT-PCR-Methoden, Array-basierte Verfahren) als auch auf Proteinebene (z. B. immunologische Nachweisverfahren wie ELISA order RIA) erfolgen. Bevorzugterweise erfolgt die quantitative Bestimmung der Expression eines Gens durch einen Nachweis der mRNA mittels reverser Transkription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Die quantitative Bestimmung der Expression eines Gens auf mRNA-Ebene kann mit jeder geeigneten Methode durchgeführt werden, z. B. mit kinetischer PCR oder Genexpressions-Array- Methoden, einschließlich kommerziell erhältlicher Plattformen wie TaqMan®, Lightcycler®, Affymterix, Illumina, Luminex, Planar Waveguide, Microarray Chips mit optischen, magnetischen, elektrochemischen oder gravimetrischen
Detektionssystemen und andere.
Die Bestimmung der Expression eines Gens, wie beispielsweise von MMP7, RACGAP1 , MAPT und/oder ESR1 , erfolgt in einer biologischen Probe eines Tumorpatienten, bevorzugterweise in einer Probe von Tumorgewebe, das z. B. durch eine Biopsie erhalten wurde. Das Tumorgewebe kann frisch sein oder es kann fixiert und/oder eingebettet sein, beispielsweise mit Formalin und/oder Paraffin. Gegebenfalls muss die biologische Probe vorbehandelt werden, um den oder die Analyten, d. h. die Genexpressionsprodukte der Gene, z. B. Proteine oder mRNAs, für eine nachfolgende Nachweisreaktion anzureichern bzw. zugänglich zu machen. Die Erfindung wird anhand der beigefügten Beispiele und Figuren näher erläutert. Beispiele
Die Erfindung wurde als Ausführungsbeispiel an einer Brustkrebsstudienkohorte getestet. Im Rahmen einer prospektiven, randomisierten klinischen Studie (Hellenic Cooperative Oncology Group Trial HE 10/97) wurden insgesamt 595 Hochrisiko- Brustkrebspatientinnen (T1-3N1 M0 oder T3N0M0), die mit einer Chemotherapie behandelt wurden, über einen Zeitraum von 3 Jahren (1997-2000) beobachtet. Diesen Patientinnen war durch Biopsie Tumorgewebe entnommen worden, welches mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet worden war (FFPE-Probenmaterial). Aus diesem FFPE-Probenmaterial wurde durch mRNA-Extraktion die mRNA isoliert und mittels reverser Transkription und verbundener kinetischer PCR (kPCR) _ basierend auf TaqMan® Basis (Applied Biosystems) wurde die Expression der diversen Markergene quantifiziert.
Figur 1
zeigt beispielhaft die Verteilung der MMP7 Expressionswerte bei den 315 vermessenen Brusttumoren der adjuvanten HE10/97 Chemotherapiestudie. Die relative Expressionshöhe wurde gemäß der Formel„40 - (CT MMP7 - CT RPL37A)" ermittelt, so dass ein vergleichsweise hoher Zahlenwert einer hohen Expressionshöhe von MMP7 entspricht, während ein niedriger Zahlenwert einer niedrigen MMP7 Expressionshöhe entspricht. Diese Expressionswerte sind auf der Y-Achse aufgetragen, wohingegen die Häufigkeit der sich in dem jeweiligen Messbereich bewegenden Werte auf der X-Achse dargestellt sind. Die Zahlenwerte bewegen sich zwischen 28,5 und 23,6. Auf Grund der logarithmischen Natur der CT Werte einer kinetischen Polymerasekettenreaktion, bei der mit jedem Reaktionszyklus eine Verdopplung der Ausgangsmenge erreicht wird, entspricht dies einem dynamischen Bereich der Markergenexpression von 210. Dies bedeutet, dass der höchste Messwert um den Faktor 1024 über dem niedrigsten Wert liegt. Als Grenzwert für eine erhöhte Expression des Markergens MMP7 wurde unter den gewählten Reaktionsbedingungen (Assay Design, Reaktionsansatz, PCR Gerät, etc.) ein Wert von über DCT 33 definiert. Die entsprechenden Werte sind mit dunklerer Färbung markiert.
Figur 2
zeigt beispielhaft mittels Kaplan Meier Analytik die prognostische Aussagekraft von MMP7, die in pathologischem Routinematerial, d. h. in Formalin-fixierten
Tumorresektaten (n=315) von Brustkrebspatientinnen vor adjuvanter Chemotherapie, die im Rahmen der HE10/97 Studie (Fountzilas et al., Ann Oncol 2005) behandelt wurden. Hierfür wurden die Gene MMP7 und RPL37A mittels reverser Transkription und verbundener kinetischer PCR basierend auf TaqMan® Basis gemessen. Die innerhalb der kinetischen PCR Reaktion entstehenden Fluoreszenzsignale sind proportional zur Ausgangsmenge der ursprünglichen Genpordukte (RNAs bzw. mRNAs) und überschreiten einen vordefinierten Threshold entsprechend der
Ausgangsmenge unterschiedlich früh (CT Wert). Die so erzielten CT Werte wurden dann entweder mittels der Formel„40 - (CT Zielgen - CT Housekeeping Gen)", also „40 - (CT MMP7 - CT RPL37A)", in eine relative und normalisierte
Genexpressionhöhe von MMP7 transformiert. Ein um den Wert 1 höherer CT Wert entspricht dabei einer doppelt so hohen Ausgangsmenge der MMP7-mRNA, was mathematisch betrachtet der logarithmischen Darstellung der relativen Genexpression entspricht. Das Ergebnis zeigt, dass die Patientinnen mit MMP7 positiven Tumoren („2"; untere Linie) eine erhöhte und frühe Metastasierungsrate im Zeitfenster zwischen einem und drei Jahren haben. Eine hohe Expression wurde in diesem Beispiel für die Tumore charakterisiert, deren DCT Messwerte, gemäss der Formel„40 - ( CT MMP7 - CT RPL37A)", über dem Wert 33 lagen. Patientinnen mit MMP7 negativen Tumoren („1"; obere Linie) weisen keine erhöhte und frühe Metastasierungsrate im Zeitfenster zwischen einem und drei Jahren auf. Figur 3
zeigt beispielhaft die Fernmetastasierungsrate in dem untersuchten Patientenkollektiv. In dieser Kaplan Meier Darstellung ist auf der Y-Achse die Wahrscheinlichkeit aufgetragen ohne Fernmetastasierung zu überleben. Auf der X- Achse ist die Beobachtungszeit in Monaten aufgetragen. Man kann somit erkennen, dass in dem untersuchten Brustkrebspatientinnenkollektiv nach 30 Monaten ca. 20 % der Patientinnen Fermetastasen aufweisen.
Figur 4
zeigt das der Erfindung zu Grunde liegende Prinzip, dass in humanen Tumoren das Gleichgewicht zwischen Stammzeil- und Hormonrezeptoraktivität von maßgeblicher Bedeutung für sowohl die Höhe des generellen Metastasierungsrisiko (Y-Achse), als auch für den Zeitpunkt der Fernmetastasierung (X-Achse) und den Ort der Fernmetastasierung ist. Zusätzlich sind die Brustkrebssubtypen entsprechend ihres spezifischen Metastasierungszeitpunktes aufgeführt; beispielsweise metastasieren „Triple Negative" Tumore (klassischerweise auf Grund der Immunhistochemie- Negativität für ER, PR und Her-2/neu definiert) früher (bis drei Jahre), weisen häufig erhöhte MMP7 Expression und gleichzeitig erniedrigte ESR1 Expression auf und metastasieren bevorzugt in Lunge, Gehirn, und Leber und seltener in die Knochen (siehe auch unten). Die Reduktion auf zwei für Brustkrebs entscheidende biologische Motive, d. h. Stammzellaktivität und Hormonrezeptoraktivität, ermöglichen eine Vorhersage von Metastasierungsereignissen sowohl bezüglich des Zeitpunktes als auch der Lokalisation . Dem liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass beispielsweise WNT-Stammzellaktivitäten, gemessen durch die MMP7 Markergenexpression, eine Einnistung von in die Blut- und/oder Lymphzirkulation abgewanderten Tumorzellen in die Knochen verhindert. Dies liegt insbesondere an der erhöhten Expression von SFRP1 (DCT >35 gemäss der Formel" 40 - ( CT SFRP1 - CT RPL37A)", also nach Abgleich auf das Housekeepinggen RPL37A. SFRP1 verhindert die Aktivierung von Knochenmarksstammzellen und verhindert somit die Einnistung von zirkulierenden Tumorzellen in den Knochen und deren Entwicklung zu mikrometastatischen Läsionen. Tumorzellen mit erhöhter Stammzellaktivität, dargestellt durch erhöhte Expression von MMP7 (DCT >33), SPP1 (DCT > 38), besitzen die Fähigkeit bei gleichzeitig geringer Expression von SFRP1 (DCT < 35), in die Knochen zu metastasieren. Dies trifft insbesonder für Her-2/neu positive Tumore zu, die auf Grund der Her-2/neu bedingten Aktivität die SFRP1 Expression hemmen.
Erfindungsgemäß ist der Grad der direkten und indirekten, negativen Interaktion von Stammzellaktivitäten entscheidend für das Metastasierungsverhalten. Die Östrogenrezeptoraktivität, die bei ausreichender Östrogenmenge maßgeblich durch die Isoformen von ESR1 vermittelt werden, reprimiert direkt Transkriptionsfaktoren, die Stammzelleigenschaften vermitteln (z. B. Slug, Snail, FOXC2 und Twist) und inhibiert andere Stammzelleigenschaften indirekt durch Hochregulation von inhibitorisch wirkenden Mitgliedern von Stammzellaktivitäts-Signalwegen (z. B. erhöhte Expression von E-Cadherin, dadurch verminderte WNT-Stammzellaktivität auf Grund der verminderten beta-Catenin Menge). Gene, die in diesem Zusammenhang von Interesse sind, sind ESR1 (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34), MLPH (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34), ALCAM (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34), Hormonrezeptormarkergene und MMP7 (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 32), SFRP1 (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 35), KRT5 (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34), OPN (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34) als Stammzellaktivitätsmarker. In der Figur 8 sind ESR1 und MMP7 beispielhaft aufgeführt (siehe Zielgenaktivität).
Figur 5
zeigt beispielhaft mittels Kaplan Meier Analytik die prognostische Aussagekraft von dem Genverhältnis von MMP7 zu ESR1 , das in Formalin-fixierten Tumorresektaten
(n=315) von Brustkrebspatientinnen vor adjuvanter Chemotherapie, die im Rahmen der HE10/97 Studie (Fountzilas et al. Ann Oncol 2005) behandelt wurden, gemessen wurde. Hierfür wurden die Gene MMP7 und ESR1 mittels reverser Transkription und verbundener kinetischer PCR basierend auf TaqMan® Basis gemessen. Das Ergebnis zeigt, dass die Patientinnen mit einem erhöhten Verhältnis von MMP7 zu
ESR1 eine erhöhte und frühe Metastasierungsrate im Zeitfenster zwischen einem und drei Jahren haben(„1"; untere rote Linie). Als hohe Expression wurden in diesem Beispiel die Tumore charakterisiert, deren DCT Verhältnisse von MMP7 und ESR1 , gemäss der Formel „(40 - (CT MMP7 - CT RPL37A)) - (40 - (CT ESR1 - CT RPL37A))" bzw.„CT MMP7 - CT ESR1", über dem Wert -2,7 lagen. Patientinnen mit MMP7-negativen Tumoren („2"; obere grüne Linie) weisen keine erhöhte und frühe Metastasierungsrate im Zeitfenster zwischen einem und drei Jahren auf gegenüber dem in Figur 3 dargestellten Grundrisiko innerhalb dieser Kohorte.
Figur 6
zeigt beispielhaft mittels Kaplan Meier Analytik die prognostische Aussagekraft von dem Genverhältnis von RACGAP1 zu MAPT, das in Formalin-fixierten Tumorresektaten (n=315) von Brustkrebspatientinnen vor adjuvanter Chemotherapie, die im Rahmen der HE10/97 Studie (Fountzilas et al. Ann Oncol 2005) behandelt wurden, gemessen wurde. Hierfür wurden die Gene RACGAP1 und MAPT mittels reverser Transkription und verbundener kinetischer PCR basierend auf TaqMan® Basis gemessen. Das Ergebnis zeigt, dass die Patientinnen mit einem erhöhten Verhältnis von RACGAP1 zu MAPT eine erhöhte und frühe Metastasierungsrate im Zeitfenster zwischen einem und drei Jahren haben(„1"; untere rote Linie). Als hohe Expression wurden in diesem Beispiel die Tumore charakterisiert, deren DCT Verhältnisse von RACGAP1 und MAPT, gemäss der Formel„(40 - (CT RACGAP1 - CT RPL37A)) - (40 - (CT MAPT - CT RPL37A))" bzw.„CT RACGAP1 - CT MAPT", über dem Wert 0,39 lagen. Patientinnen mit RACGAP 1 -negativen Tumoren („2"; obere grüne Linie) weisen keine erhöhte und frühe Metastasierungsrate im Zeitfenster zwischen einem und drei Jahren auf gegenüber dem in Figur 3 dargestellten Grundrisiko innerhalb dieser Kohorte.
Figur 7
zeigt beispielhaft einen verfeinerten Algorithmus bestehend aus dem Genverhältnis von RACGAP1 und MAPT in Kombination mit MMP7 als Flussdiagramm bzw. Entscheidungsbaum. Primäre Brusttumore von 315 Patientinnen standen für die Analyse zur Verfügung. Auf Grund des Verhältnisses von RACGAP1 zu MAPT und dem Cut-Off bzw. Entscheidungspunkt von DCT 0,39 wurden die Patientinnen in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Patientinnen, die ein RACGAP1 zu MAPT-Verhältnis von <0,39 haben, werden der Niedrigrisikogruppe zugeordnet („1"; 8 % Metastasierungsrisiko; n=137; obere rote Linie in Figur 8). Die Patientinnen, die ein RACGAP1 zu MAPT Verhältnis von >0,39 haben, werden einem erhöhten Risiko zugeordnet und anhand der auf RPL37A normalisierten Markergenexpression von MMP7 in eine Gruppe mit mittlerem Risiko („2"; n=122; 21 % Metastasierungsrisiko; _ _ mittlere grüne Linie in Figur 8) und einem hohen Risiko („3"; n=56; 45 % Metastasierungsrisiko; untere blaue Linie in Figur 8) zugeordnet.
Figur 8
zeigt beispielhaft mittels Kaplan Meier Analytik die prognostische Aussagekraft für den in Figur 7 beschriebenen Algorithmus bestehend aus dem Genverhältnis RACGAP1 zu MAPT in Kombination mit dem definierten Cut-Off für MMP7, die in Formalin-fixierten Tumorresektaten (n=315) von Brustkrebspatientinnen vor adjuvanter Chemotherapie, die im Rahmen der HE10/97 Studie (Fountzilas et al. Ann Oncol 2005) behandelt wurden, gemessen wurden. Hierfür wurden die Gene RACGAP1 , MAPT, MMP7 und RPL37A mittels reverser Transkription und verbundener kinetischer PCR basierend auf TaqMan® Basis gemessen. Das Ergebnis zeigt, dass die Patientinnen mit einem erhöhten Verhältnis von RACGAP1 zu MAPT und nicht-erhöhter MMP7-Expression bzw. erhöhter MMP7-Expression eine erhöhte und frühe Metastasierungsrate im Zeitfenster zwischen einem und drei Jahren haben („2" und„3"; mittlere grüne und untere blaue Linie; 25 % und 50 % Fernmetastasierungsrate nach drei Jahren) gegenüber dem Niedrigrisikokollektiv mit niedrigem RACGAP1 zu MAPT Verhältnis haben und niedriger MMP7-Expression („1"; obere rote Linie; 10 % Fernmetastasierungsrate nach drei Jahren ).
Figur 9
zeigt das der Erfindung zu Grunde liegende Prinzip, dass das Zytoskelett der Zelle von entscheidender Bedeutung ist für Zellteilung und -Wanderung. Maßgeblich beteiligt sind an diesem Prozess die Mikrutubuli, mikroskopisch kleine, fädige, intrazelluläre Verbindungen, die für die Verteilung der Chromosomen während der Zellteilung und für die während der Zellwanderung stattfindenden Zellformveränderungen entscheidend sind. Das Gleichgewicht zwischen Wanderung- und Mikrutubulistabilisierung ist von maßgeblicher Bedeutung für sowohl die Höhe der Zellteilungsaktivität (Y-Achse), als auch für den Zeitpunkt der Fernmetastasierung (X-Achse) und den Ort der Fernmetastasierung. Zusätzlich sind die Brustkrebssubtypen entsprechend ihres spezifischen Metastasierungszeitpunktes aufgeführt; beispielsweise metastasieren „Triple Negative" Tumore (klassischer Weise auf Grund der Immunhistocheminegativität für ER, PR und Her-2/neu definiert) früher (bis drei Jahre), weisen häufig erhöhte RACGAP 1 -Expression und gleichzeitig erniedrigte MAPT-Expression auf und metastasieren bevorzugt in Lunge, Gehirn und Leber und seltener in die Knochen (siehe auch unten). Die Reduktion auf zwei für Brustkrebs entscheidende biologische Motive, die beide auf der Regulation des Mikrotubuli-Zellskeletts beruhen, ermöglicht eine Vorhersage von Metastasierungsereignissen. Hierbei ist von Bedeutung, dass die Hormonrezeptoren ESR1 und PGR zwecks Differenzierung der Zellen die Mikrotubulidynamik durch Erhöhung der MAPT-Expression beeinflussen.
Erfindungsgemäß ist der Grad der positiven versus negativen Regulation der Mikrotubistabilität entscheidend für das Metastasierungsverhalten und die Resistenz gegenüber Chemotherapeutika. Dies ist insbesondere relevant für Resistenz gegenüber Taxan-haltigen Therapien (wie etwa in der HE10/97 Studie), da diese durch„Einfrieren" des Mikrotubulisystems den Selbstmord der sich teilenden bzw. wandernden Zelle hervorrufen sollen. Gene, die in diesem Zusammenhang von Interesse sind, sind RACGAP1 (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34) und TOP2A (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34), als Zellteilungs- und Wanderungsmotiv und MAPT (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34), ESR1 (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 34), PGR (erhöhte Expression nach Abgleich auf RPL37A ab DCT 32), als Mikrotubulistabilisierungs- und Differenzierungsmotiv. In der Figur 9 sind RACGAP1 und MAPT beispielhaft aufgeführt (siehe Zielgenaktivität). Figur 10
zeigt das erfindungsgemäße Verfahren, wonach Patientinnen, bei denen mittels Tumormarkerbestimmung (im Blut oder im Gewebe) ein erhöhtes Fernmetastasierungsrisiko festgestellt wurde, im Anschluss einer intensivierten Nachbeobachtung zugeführt werden (d. h. adäquate bildgebende Verfahren werden in dem entsprechenden Zeitfenster und bei den zu erwartenden Metastasierungsorten durchgeführt). Sobald eine frühe, asymptomatische Metastase entdeckt wird, sollte entsprechend behandelt werden mittels chirurgischer, systemischer oder radiologischer Verfahren. Falsch positive Patientinnen sollten weiterhin einer intensivierten Nachbeobachtung mittels Serummarkeranalytik oder Bildgebung unterliegen. Gegebenenfalls kann die Nachbeobachtung nach drei Jahren für die Hochrisikopatientinnen beendet werden, da dann keine weitere Metastasierung zu erwarten ist.
Figur 11
zeigt beispielhaft mittels Kaplan Meier Analytik die prognostische Aussagekraft für einen Algorithmus, der angelehnt an den Entscheidungsbaum aus Figur 7, das Genverhältnis von RACGAP1 zu MAPT als Basis hat, dann aber innerhalb der _
Tumore mit erhöhtem RACGAP1 zu MAPT-Verhältnis (DCT > 0,39) mittels ALCAM diejenigen Tumore identifiziert, die ein geringes Metastaserisiko aufweisen. Hierfür wird als Entscheidungspunkt der Cut-Off der auf RPL37A normalisierten ALCAM- Werte bei einem DCT Wert von 35,4 verwendet. Tumore mit einer ALCAM Expression über DCT 35,4 haben ein geringeres Risiko („2" mittlere grüne Linie; 10 % Femmetastasierungsrate nach drei Jahren) als Tumore mit einer niedrigeren ALCAM-Expression („3" untere blaue Linie; 44 % Femmetastasierungsrate nach drei Jahren). Das Niedrigrisikokollektiv ist durch ein niedriges Verhältnis von RACGAP1 zu MAPT charakterisiert (DCT < 0,39) und ist identisch mit dem Niedrigrisikokollektiv aus Fig. 8 und 6.
Die Sequenzzugangsnummern (Accession No.) stammen aus folgender Datenbank: http://genome.ucsc.edu/ UCSC Genome Browser:
Kent WJ1 Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 2002 Jun;12(6):996-1006.
Karolchik D, Kuhn, RM, Baertsch R, Barber GP, Clawson H, Diekhans M, Giardine B, Harte RA, Hinrichs AS, Hsu F, Miller W, Pedersen JS, Pohl A, Raney BJ, Rhead B, Rosenbloom KR, Smith KE, Stanke M, Thakkapallayil A, Trumbower H, Wang T1 Zweig AS, Haussler D, Kent WJ. The UCSC Genome Browser Database: 2008 update. Nucleic Acids Res. 2008 Jan;36:D773-9.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Bestimmen des Metastasierungsrisikos eines Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass in einer biologischen Probe eines Tumorpatienten mindestens die Expression von MMP7 quantitativ bestimmt wird, wobei eine erhöhte MMP7-Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine fehlende oder niedrige MMP7-Expression kein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich in einer biologischen Probe des Tumorpatienten die Expression von ESR1 quantitativ bestimmt wird, wobei eine fehlende oder niedrige ESR1 -Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine erhöhte ESR1 -Expression keine erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich in einer biologischen Probe des Tumorpatienten die Expression von MAPT und die Expression von RACGAP1 quantitativ bestimmt wird, wobei eine niedrige MAPT-Expression kombiniert mit einer hohen RACGAP1 -Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine hohe MAPT-Expression kombiniert mit einer niedrigen RACGAP1 -Expression kein erhöhtes
Metastasierungsrisiko anzeigt.
4. Verfahren zum Bestimmen des Metastasierungsrisikos eines Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass in einer biologischen Probe eines Tumorpatienten mindestens die Expression von MAPT und die Expression von RACGAP1 quantitativ bestimmt wird, wobei eine niedrige MAPT-Expression kombiniert mit einer hohen RACGAP 1 -Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine hohe MAPT-Expression kombiniert mit einer niedrigen RACGAP1- Expression kein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4 weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich in einer biologischen Probe des Tumorpatienten die Expression von ALCAM quantitativ bestimmt wird, wobei eine niedrige ALCAM-Expression ein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt und eine erhöhte ALCAM-Expression kein erhöhtes Metastasierungsrisiko anzeigt.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zum Bestimmen des Metastasierungsrisikos eines Tumors aus der Gruppe Mammakarzinom, Ovarialkarzinom, Kolorektalkarzinom, Lungenkarzinom, Magenkarzinom und Hals-Kopf-Karzinom.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche weiterhin dadurch
gekennzeichnet, dass die Expression von MMP7, ESR1 , MAPT, RACGAP1 und/oder ALCAM durch Messung der mRNA-Menge quantitativ bestimmt wird.
8. In vitro-Verfahren zur Identifizierung von Tumorpatienten, die mit hoher
Wahrscheinlichkeit von einer Untersuchung mittels eines bildgebenden in vivo- Verfahrens profitieren werden, dadurch gekennzeichnet, dass das
Metastasierungsrisiko des Tumors eines Patienten mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7 bestimmt wird und wobei ein erhöhtes
Metastasierungsrisiko anzeigt, dass der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer Untersuchung mittels eines bildgebenden in vivo-Verfahrens profitieren wird.
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