DE102010020870B3

DE102010020870B3 - Doxorubicin-Therapieoptimierung bei Krebspatienten durch DNA-Methylierungsprofil

Info

Publication number: DE102010020870B3
Application number: DE201010020870
Authority: DE
Inventors: Dr. Kischkel Frank; Dr. Böttcher Michael; Dr. Hoheisel Jörg
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2012-01-12
Anticipated expiration: 2030-05-19

Abstract

Die Nichtwirksamkeit von Medikamenten ist in der Onkologie aufgrund der Toxizität der Medikamente ein großes Problem. Die Wirksamkeit oder Nichtwirksamkeit von Medikamenten vor Therapiebeginn zu ermitteln wäre ein wichtiger Schritt in der Therapieoptimierung Durch die Verwendung von epigenetischen Markern kann man die Wirksamkeit der Medikamente ermitteln. Das Patent konzentriert sich auf des Medikament Doxorubicin. Die Ergebnisse der epigenetischen Marker lassen sich mit anderen Verfahren kombinieren. Dieses Verfahren kann in der gesamten Onkologie verwendet werden, in der Doxorubicin verwendet wird.

Description

Es ist bekannt, dass sich das Ansprechen, bzw. Nichtansprechen von chemotherapeutischen Medikamenten für Patienten mittels individuellen in vitro Testungen an lebenden Tumorzellen vor oder während der Therapie ermitteln lassen kann (in vitro Testungen). Hierzu werden lebende Tumorzellen ausserhalb des Patienten mit unterschiedlichen chemotherapeutischen Medikamenten (z. B. Paclitaxel, Topotecan, Doxorubicin, Gemcitabin oder andere) einzeln oder in Kombination inkubiert. Ob und wie stark das jeweilige chemotherapeutische Medikament oder die Medikamentenkombination eine zytotoxische oder zytostatische Wirkung auf die Tumorzellen hat, läßt sich durch unterschiedliche Verfahren – auch funktionale Tests genannt – auslesen. Beispiele sind der Thymidin-Einbau-Test (CTR- oder EDR-Test), „Colony-Forming-Assay”, der DiSC-Test, ein Test basierend auf der Detektion der Ansäuerungsfähigkeit von Zellen (Biosensorchip-Test), der ATP-Test oder der SenRes-Test (Patentanmelung: 10 2010 007 243.5 und 10 2008 058 984.5) (Weisenthal, Marsden et al. 1983; Weisenthal and Kern 1991; Waldenmaier, Babarina et al. 2003; Neubauer, Stefanova et al. 2008; Klatt 2010).
Es ist ebenfalls bekannt, dass epigenetische Analysen für die Tumordiagnostik geeignet sind, da man nur geringe Probenmenge benötigt, die beim Tumorprobentransport von der Klinik zum Analyselabor über Nacht und anschließender Tumoraufarbeitung stabil bleiben, was eine problemlose kommerzielle Anwendung ermöglicht. Jedoch sind die richtigen Methylierungsstellen auf dem Genom für die Vorhersage der Wirksamkeit eines Medikamentes (wie z. B. für Doxorubicin) noch nicht bekannt. Aus der Tabelle S2 geht für den Fachmann eine Möglichkeit der Detektion von Methylierungsstellen durch Hybridisierung mittels eines CpG-Sonden-Mikroarrays (Biochip, Genchip, DNA-Chip) hervor.
Die Idee der personalisierten Medizin in der Onkologie ist nicht neu, aber je nach Ansatz hat man unterschiedlich hohe falsch-negative und falsch-positive Ergebnisse. Bei dem hier angestrebten Lösungsansatz werden entweder lediglich die Methylierungsdaten genommen oder aber ein oder mehrere funktionale Tests mit dem molekularen Test für Methylierungsstellen kombiniert. Die Testergebnisse von unterschiedlichen Messmethoden wird zu unterschiedlichen Einteilungen und Ergebnissen führen, sodass sie in ihrer Kombination eine sehr genaue synergistische Aussage über das Ansprechen von Doxorubicin zulassen. Für den Biochip- und/oder CTR-Test und/oder SenRes-Test ergibt sich ein Diagramm mit vier Feldern, bei dem die Ergebnisse je nach Ansprechen im Patienten und je nach Ansprechen im Test eingeteilt werden. Daraus folgen falsch-negative, falsch-positive, richtig-negative und richtig-positive Ergebnisfelder. Die epigenetische Analyse wird im Vergleich zu den herkömmlichen pathologischen Klassifikationen eine viel präzisere Einteilung von Tumorsubtypen ermöglichen. Es ist heute schon bekannt, dass Tumoren sich mit genetischen Analysen weiter untergliedern lassen. Von der Kombination der Ergebnisse werden falsch-positive und falsch-negative Fälle aussortiert werden können, wodurch sich die Sensitivität und Spezifität des Biochip- und/oder des CTR-Tests und/oder des SenRes-Tests bedeutend erhöhen wird/werden. Die Definition der erfindungsgemäßen Gene und Methylierungsstellen im Genom (CpG Sequenzen) für die Wirksamkeit, bzw. Unwirksamkeit für Doxorubicin wird durch die Patentansprüche 1–4 gelöst.
Die Möglichkeiten der Kombinationsanalyse werden in den Patentansprüche 5–6 gelöst.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, dass es zu einer speziell zugeschnittenen Therapie für den einzelnen Patienten kommt und dass dadurch, die Behandlungserfolge gezielt erhöht werden, wodurch das Gesundheitssystem Kosten einsparen kann.
Versuche zu den Tabellen S1, S2 und S3 sind im Einzelnen in dem Artikel von Michael Böttcher, Frank Kischkel und Jörg Hoheisel „High-definition DNA methylation profiles from breast and ovarian carcinoma cell lines with differing doxorubicin resistance.” PLoS One (8.6.2010) 5 (6) e11002 angegeben.
Literatur

Böttcher, M. et al. (2010) ”High-definition DNA methylation profiles from breast and ovarian carcinoma cell lines with differing doxorubicin resistance.” PLoS One 5 (6) e11002
Klatt, Jennifer (2010). ”Entwicklung eines Diagnostikums zur Identifikation der möglichen Sensitivierung chemoresistenter Zellpopulationen”, Diplomarbeit an der Hochschule Mannheim, Studiengang: Biotechnologie
Neubauer, H., M. Stefanova, et al. (2008). ”Predicting resistance to platinum-containing chemotherapy with the ATP tumor chemosensitivity assay in primary ovarian cancer.” Anticancer Res 28 (2A): 949–55.
Otto, C., U. Kaemmerer, et al. (2008). ”Growth of human gastric cancer cells in nude mice is delayed by a ketogenic diet supplemented with omega-3 fatty acids and medium-chain triglycerides.” BMC Cancer 8: 122.
Waldenmaier, D. S., A. Babarina, et al. (2003). ”Rapid in vitro chemosensitivity analysis of human colon tumor cell lines.” Toxicol Appl Pharmacol 192 (3): 237–45.
Weisenthal, L. M. and D. H. Kern (1991). ”Prediction of drug resistance in cancer chemotherapy: the Kern and DiSC assays.” Oncology (Williston Park) 5 (9): 93–103; disc 104, 111–4, 117–8.
Weisenthal, L. M., J. A. Marsden, et al. (1983). ”A novel dye exclusion method for testing in vitro chemosensitivity of human tumors.” Cancer Res 43 (2): 749–57.

Tabellen:
Tabelle S1 und S2 sind als Anhang mitgeschickt.
Tabelle S1: Sequenzen der Primer für die Amplifikation der spezifischen CpG-Inseln (CGIs)
Aufgelistet sind die ENSEMBL Transkripte und Exon IDs, die für die CGI-Definitionen benutzt werden. Zusätzlich sind auch die Sequenzen für die Primer angegeben, die für die PCR Amplifikation der spezifischen CGIs benutzt wurden.
Tabelle S2: Stufen der Methylierung von allen analysierten CpG-Stellen
Die Stufen der Methylierung (M/[M + U]) × 100 sind von allen CpG-Stellen der untersuchten Zelllinien MCF-7_wt, MCF-7_ADR, OVCAR-5, OVCAR-4 und NCI/ADR-RES angegeben. Zusätzlich sind die Stufen angegeben, die man bei der Hybridisierung von 100% methylierten, wie auch 100% unmethylierten Fragementenpool erhält. Die Spalte SD zeigt die Standardabweichung.

Spaltenbeschriftung: Associtated Gene steht für assoziiertes Gen, Relative to exon heißt relativ zum Exon. Tabelle S3: Tendenz der Veränderung der Stufe der Methylierung, die mit der Doxorubicin-Resistenz zusammenhängt.

	Brustkarzinom	Ovarialkarzinom
ABCB1	–	–
APC	–	–
BRCA1	+	+
CDH1	+	+
DNAJC15	+	+
ESR1	+	keine
GSTP1	–	keine
HIC1	–	–
IGFBP3	keine	–
PLAU	–	keine
RAB6C	+	keine
RASSF1	–	keine
SULF2	+	+
TGM2	–	keine

Hypo-Methylierung der Doxorubicin Resistenz im Vergleich zu sensitiven Zelllinien ist mit einem Minus (–) gekennzeichnet, während Hyper-Methylierung ist mit einem Plus gekennzeichnet. Zellen, die mit ”keine” gekennzeichnet sind, repräsentieren CGIs mit gleich hoher Stufe der Methylierung zwischen den analysierten Zellen.

Claims

Verfahren zur Ermittlung der Wirksamkeit oder Nichtwirksamkeit von Doxorubicin (einzeln oder in Kombination mit anderen Medikamenten) für Patienten mit Tumorerkrankung, insbesondere bei gynäkologischen Tumoren, insbesondere bei Brustkrebs oder Ovarialkrebs, mittels DNA Methylierungsprofil vor oder während der Therapie, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksamkeit oder Nichtwirksamkeit von Doxorubicin mit Hilfe eines Methylierungsprofils, das mindestens durch einen CpG-Sonden-Mikroarray (Biochip, Genchip, DNA-Chip) aufgenommen wird, getestet wird, wobei das Methylierungsprofil von mindestens einer der CpG-Inseln (CGIs) in mindestens einer Region der Tabelle des Anhangs S1 von mindestens einem der Gene: ABCB1, APC, BRCA1, CDH1, DNAJC15, ESR1, GSTP1, HIC1, IGFBP3, PLAU, RAB6C, RASSF1, SULF2 oder TGM2 bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Methylierungsprofil von mindestens einer der CpG-Inseln (CGIs) der Tabelle des Anhangs S2 bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Methylierungsprofil von mindestens einer der CpG-Inseln (CGIs) der Tabelle des Anhangs S2 im Hinblick auf die Hyper- oder Hypomethylierung gemäß Anhang S2 ermittelt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Methylierungsprofil so erstellt wird, dass die Hyper- oder Hypomethylierung von mindestens einem der Gene gemäß Anhang S3 ermittelt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zur Ermittlung zusätzlich Schritte funktionaler Tests einbezieht, wobei lebende Tumorzellen ausserhalb des Patienten mit unterschiedlichen Medikamenten (z. B. Paclitaxel, Topotecan, Doxorubicin, Gemcitabin) einzeln oder in Kombination inkubiert werden und ermittelt wird, ob und wie stark das jeweilige Medikament oder die Medikamentenkombination eine zytotoxische oder zytostatische Wirkung auf die Tumorzellen hat.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der funktionale Test der Thymidin-Einbau-Test (CTR- oder EDR-Test), der „Colony-Forming-Assay”, der DiSC-Test, der Test basierend auf der Detektion der Ansäuerungsfähigkeit von Zellen (Biosensorchip-Test), der ATP-Test oder der SenRes-Test ist.