JPS61269066A - 核酸の塩基配列決定のための信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処理方法に
関するものである。

［発明の背景１ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野においては
、生物体の機能や複製のメカニズムを解明するために生
物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のことと
なっている。とりわけ、特定の遺伝情報を担うＤＮＡ　
（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）などの核酸の塩基
配列を決定することが必要不可欠なこととなっている。

ＤＮＡ、ＲＮＡなとの核酸の塩基配列を決定するための
代表的な方法として、オートラジオグラフィーを利用す
るマキサム・ギルバー）　（Ｎａｘａ層−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ　）法およびサンカー・クールソン（Ｓａｎｇｓｒ−
Ｇｏｕｌ＋ｏｎ）法が知られている。前者のマキサム°
ギル″−ト法は、まず、塩基配列を決定しようとしてい
るＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物の鎖状分子の一方の端部
に３２　ｐ等の放射性同位元素を含む基を結合させるこ
とにより、その対象物を放射性標識物質としたのち、化
学的な手段を利用して鎖状分子の各構成単位間の結合を
塩基特異的に切断する０次に、この操作により得られた
塩基特異的ＤＮＡ切断分解物の混合物をゲル電気泳動法
により分離展開し、多数の切断分解物がそれぞれ分離展
開されて形成された分離展開パターン（ただし、視覚的
には見ることができない）を得る。この分離展開パター
ンをたとえばｘｌｌフィルム上に可視化してそのオート
ラジオグラフを得、得られたオートラジオグラフと各々
の塩基特異的切断手段とから、放射性元素が結合された
鎖状分子の端部から一定の位置関係にある塩基を順次決
定し、これにより対象物全ての塩基配列を決定すること
ができる。

また、後者のサンガー・クールラン法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡ断片物の鎖状分子と相補的であって、かつ放射
性標識が付与されたＤＮＡ合成物を化学的な手段を利用
して塩基特異的に合成し。

この塩基特異的ＤＮＡ合成物の混合物を用いて上記と同
様にしてそのオートラジオグラフから塩基配列を決定す
る方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易かつ高精度
で行なうことを目的として、それに利用されるオートラ
ジオグラフ測定操作において、上記Ｘ線フィルム等の写
真感光材料を用いる従来の放射線写真法の代りに、蓄積
性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を利用する方
法について既に特許出願している（特開昭５９−８３０
５７号、特願昭５８−２０１２３１号）、ここで、蓄積
性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるものであり、放
射線エネルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に吸収
させたのち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）で励
起することにより、放射線エネルギーを蛍光として放出
させることができるものである。この方法によれば、露
光時間を大幅に短縮化することができ、また従来より問
題となっていた化学カブリ等が発生することがない・さ
らに、放射性標識物質のオートラジオグラフは、一旦放
射線エネルギーとして蛍光体シートに蓄積されたのち輝
尽光として時系列的に読み出されるから１画像のほかに
記号、数値など任意の形で表示記録することが可能であ
る。

従来より、核酸の塩基配列決定をしようとする者は、可
視化されたオートラジオグラフについて、放射性標識が
付与された核酸の塩基特異的切断分解物もしくは塩基特
異的合成物（以下、単に核酸の塩基特異的断片、物と称
する）のそれぞれの分離展開位置を視覚的に判断し１分
離展開列間で相互に比較することにより核酸の塩基配列
を決定している。よって、得られたオートラジオグラフ
の解析は通常人間の視覚を通して行なわれており、その
ために多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているため、オートラジオグラ
フを解析して決定された核酸の塩基配列が解析者によっ
て異なるなど得られる情報の精度には限界がある。

そこで１本出願人は、上記オートラジオグラフをデジタ
ル信号として得た後、このデジタル信号に適当な信号処
理を施すことにより、ＤＮＡの塩基配列を自動的に決定
する方法についても既に特許出願している（特開昭５９
−１２６５２７号、特開昭５９−１２６２７８号、特願
昭５９−８９６１５号、特願昭５９−１４０９０８号等
）、オートラジオグラフに対応するデジタル信号は、従
来の放射線フィルムを利用する場合には成立オートラジ
オグラフを該フィルム上に可視画像化したのち１反射光
または透過光を利用して光電的に読み取ることにより得
られる。また、蓄積性蛍光体シートを用いる場合には、
オートラジオグラフが蓄積記録された蛍光体シートを直
接に読み出すことにより得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳動法など
により支持媒体上に分離展開させて得られた分離展開パ
ターンには種々の歪みおよびノイズが生じがちである。

たとえば、支持媒体中に混入した放射性不純物から放出
される放射能または自然放射能によって写真感光材料が
感光されるこ　　　　′とにより、あるいは、蓄積性蛍
光体シートにそのエネルギーが吸収蓄積されることによ
り、ノイズが発生する。このようなノイズが発生した場
合にも、そのオートラジオグラフに対応するデジタル信
号を効率良く信号処理して核酸の塩基配列を高精度で自
動決定することが望まれている。

また、分離展開パターンは一般に、下部領域（すなわち
分離展開距離が大きい領域）においては分離展開バンド
の間隔が疎であり、一方、上部の分離展開の開始位置に
近づくにつれてバンドの間隔が密になっている。ここで
、下部とは一般に支持媒体の中央付近より下側の債城を
意味し、また上部とは中央付近より上側の領域を意味す
る。

従って、上部領域のおいてはバンドの分離が充分でない
ために、二乃至三個のバンドが連結して−個の幅広なバ
ンドを形成しがちである。

このような連結（融合）したバンドについても信号処理
による解析を可能にすることにより、−回のオートラジ
オグラフ測定でより多くの塩基配列情報を高精度で得る
ことが望まれている。

［発明の要旨］ 本発明者は、オートラジオグラフィーを利用して核酸の
塩基配列を自動決定する方法において。

バンドの融合が生じている分離展開パターンであっても
そのオートラジオグラフに対応するデジタル信号を好適
に信号処理することにより、核酸の塩基配列を簡易かつ
高精度で自動決定することを実現した。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された塩基特異
的ＤＮＡ断片物もしくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合
物が支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成さ
れた複数の分離展開列のオートラジオグラフに対応する
デジタル信号について信号処理を行なうことにより、核
酸の塩基配列を決定する方法において、 ｌ）各分離展開列の下部領域において少なくとも二つの
連続するバンドを検出し、下端から順にバンドに通し番
号を付する工程、 ２）検出されたバンドについて、ノくノド間の分離展開
方向についての距離と該バンドの番号との相関関係を得
、この相関関係から未検出のバンドの分離展開方向につ
いての位置を予測する工程、および ３）予測位置に基づいて各分離展開列上の全てのバンド
を検出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混合物を支
持媒体上で分離展開して得られた分離展開パターンにお
いて部分的にバンドの分離が充分でなく融合バンドが′
生じている場合でも、そのオートラジオグラフに対応す
るデジタル信号を融合バンドの分離のための信号処理機
能を有する適当な信号処理回路を通すことにより、核酸
の塩基配列を簡易かつ高精度で得ることができる。また
、従来においては非常に困難であった融合バンドの分離
を行なうことができるから、−回のオートラジオグラフ
測定で得られる塩基配列情報の量が増加し、このことに
よっても目的とする核酸の塩基配列決定が容易となるも
のである。

本発明者は、バンドの間隔が分離展開パターンの上部と
下部とで異なり、下部領域においては一つ一つのバンド
が充分に分離しているためバンドの序列を決定すること
が容易であることに注目して、融合バンドの分離を適性
かつ簡単に行なう方法を見い出した。すなわち、下部領
域においてはバンドの序列が容易に決定されるのみなら
ず、局所的にバンドの間隔とバンドの通し番号との相関
関係が直線的であることから、この関係に基づいてそれ
より上部領域のバンド間隔を予測して、バンドが存在す
るべき位置を予め割り出すことができ、これによりバン
ドが融合していても個々のバンドに分離することができ
る。

このようにして、融合バンドの分離を行ないながら同時
にバンドに序列を付すことができることにより、核酸の
塩基配列決定を簡易かつ高精度で行なうことができるも
のである。

［発明の構ｒ＆］ 本発明において用いられる試料の例として！よ、放射性
標識が付与されたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の塩基特異的
断片物の混合物を挙げることができる。ここで、核酸の
断片物とは長鎖状の分子の一部分を意味する。たとえば
、塩基特異的ＤＮＡ断片物混合物の一種である塩基特異
的ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述のマキサム・ギルバ
ート法に従って、放射性標識が付与されたＤＮＡを塩基
特異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前述のサンガー
・クールラン法に従って、ＤＮＡをテンプレート（鋳型
）として、放射性標識が付与されたデオキシヌクレオシ
ドトリフオスフェートとＤＮＡ合成酵素とを用いて合成
することにより得られる。

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同様
の方法により、切断分解物混合物とじてまたは合成物混
合物として得ることができる。なお、ＤＮＡはその構成
単位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシンの四
種類の塩基からなるが、一方ＲＮＡはアデニン、グアニ
ン、ウラシル、シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で”Ｐ、”Ｃ
，”Ｓｔ　　３Ｈ，−Ｉなとの放射性同位元素を保持さ
せることによって付与される。

試料である放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断
片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支持媒
体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィーなど種々の分離展開方法により
支持媒体上に分離展開される。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒体につい
て、従来の写真感光材料を用いる放射線写真法により、
あるいは蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法
によりそのオートラジオグラフが得られ１次いで適当な
読取り（読出し）系を介して放射性標識物質のオートラ
ジオグラフに対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルム等の写真感光材料とを低温（−９０〜−
７０℃）で長時間（ａ子爵間）重ね合わせて放射線フィ
ルムを感光させたのち、現像して放射性標識物質のオー
トラジオグラフを放射線フィルム上に可視画像化する０
次いで１画像読取装置を用いて放射線フィルム上に可視
化されたオートラジオグラフを読み取る。たとえば、放
射線フィルムに光ビームを照射してその透過光または反
射光を光電的に検出することにより、オートラジオグラ
フは電気信号として得られる。さらに、この電気信号を
Ａ／Ｄ変換することにより。

オートラジオグラフに対応するデジタル信号を得ること
ができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には。

まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間
（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性
標識物質から放出される放射線エネルギーを蓄積させる
ことにより、そのオートラジオグラフを蛍光体シートに
一種の潜像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体シー
トは、たとえばプラスチックフィルムからなる支持体、
二価ユーロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：
Ｅｕ”）等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透
明な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄積性蛍
光体シートに含有されている輝尽性蛍光体は、Ｘ線等の
放射線が照射されるとその放射線エネルギーを吸収して
蓄積し、そののち可視乃至赤外領域の光で励起すると蓄
積していた放射線エネルギーを輝尽光として放出すると
いう特性を有する。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録されたオートラジオグラフを読み出す、具体的には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性標識物質のオートラジオ
グラフは可視画像化することなく直接に電気信号として
得られる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換すること
により、オートラジオグラフに対応するデジタル信号を
得ることができる・ 上述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を得る方法の詳細につい
てノよ、前記特開昭５９−８３０５７号、特開昭５９−
１２６５２７号、特開昭５９−１２６２７８号などの各
明細書に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号を得る方法として、従来の放射線写真法および放射
線像変換方法を利用する方法について述べたが、これら
の方法に限定されるものではなく、それ以・外の如何な
る方法により得られたデジタル信号であっても放射性標
識物質のオートラジオグラフと対応関係がある限り、本
発明の信号処理方法を適用することが可能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジオグラフ
の読取り（または読出し）は、放射線フィルム（または
蓄積性蛍光体シート）の全面に亘って行なう必要はなく
１画像領域のみについて行なうことも勿論可能である。

サラに１本発明においては、予め各分離展開列の位置お
よびバンドの幅等についての情報を入力して読取り（読
出し）条件を設定しておき、読取り（読出し）操作にお
いては各バンド上を走査線が通過するような走査線密度
で光ビームによる走査を行なうことにより、読取（読出
）時間を短縮化して必要な情報を効率良く得ることがで
きる。

なお、本発明においてオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号とは、このようにして得られたデジタル信号
をも包含する。

得られたデジタル信号ＤＸＦは、放射線フィルム（また
は蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座標
（ｘ　、　ｙ）とその座標における信号のレベル（２）
とからなる、信号のレベルはその座標における画像濃度
、すなわち放射性標識物質の量を表わしている。従って
、一連のデジタル信号（すなわち、デジタル画像データ
）は放射性標識物質の二次元的な位置情報を有している
。

このようにして得られた支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号には、以下に述べるような本　　　　　゛発明の方
法により信号処理が施されて、目的の核酸の塩基配列決
定が行なわれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四種類の放
射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物の組合せ
により形成された泳動列（分離展開列）からなる場合に
ついて説明する。

１）グアニン（Ｇ）特異的ＤＮＡ断片物２）アデニン（
Ａ）特異的ＤＮＡ断片物３）チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ
断片物 ４）シトシンＣＣ）特異的ＤＮＡ断片物ここで、各塩基
特異的ＤＮＡ断片物は、塩基特異的に切断分解もしくは
合成された、すなわち末端の塩基を同じくする種々の長
さのＤＮＡ断片物からなる。

第１図は、上記四種類の塩基特異的ＤＮＡ断片物をそれ
ぞれ四個のスロットに電気泳動してなる□ 泳動パターンのオートラジオグラフを示す、第１１図に
示すように、泳動パターンは下部領域においてはバンド
の間隔が疎であるが、上部になるにつれてその間隔が密
となっている。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信号は、信
号処理回路において成立メモリ（バッファーメモリ、ま
たは磁気ディスク等の不揮発性メモリ）に記憶される。

まず、各泳動列（レーン）の下部領域において二つ以上
のバンドを連続的に検出し、その序列を決定する。

たとえば、各レーンの泳動方向に沿った一定領域内のデ
ジタル信号を抽出したのち、各レーンについて抽出され
た信号の位置（ｙ）とその信号のレベル（Ｚ）とからな
る−次元波形を作成する。

なお、デジタル信号の検出を、前記のように各バンドに
ついて走査線がかかるような走査線密度で泳動方向に走
査することにより行なった場合には、得られたデジタル
信号から直接に各レーンについて一次元波形を作成する
ことができる。

第２図は、各レーンについて信号の位ａｔ（ｙ）と信号
のレベル（２）とからなる−次元波形を示す、なお、第
２図において、縦軸の位置（ｙ＝ｙｏ）はデジタル画像
データ上の基準原点を示し、（１）〜（４）の−次元波
形はそれぞれ第１図の各スロットに対応する。基準原点
はたとえばスロットの位置とすることができる。

第２図の各−次元波形の右側部分（ｙが大である領域）
において、たとえば信号のレベルの差分値の符号が反転
する（＋から−に変化する）点を求めることにより、信
号レベルが極大となる位置を探し出す、極大値は各−次
元波形において少なくとも三箇所で連続して探し出す必
要がある。これにより、泳動パターンについて少なくと
も一つの基本的なバンド間隔を得ることができる。この
極大値をとる位置をバンドの位置とする。検出すべきバ
ンドの数は、泳動パターン上の総バンド数およびパター
ンの状態などによっても異なるが、たとえば総バンド数
が１５０〜２００の範囲にある場合には合計で士数個〜
数十個程度のバンドを検出するのが好ましい。

得られたバンド全部について、泳動位置（−ｙ）が基準
原点から遠い順に通し番号（ｎ）を付す。

泳動パターンの下部領域においては、第１図から明らか
なようにバンドの間隔が疎であり、各ｌくンドが充分に
分離しているために、バンドの序列を容易に決定するこ
とができる。

次に、上記バンドについて、各バンド間の泳動方向につ
いての距離、すなわちバンドとバンドの間隔（ピッチ）
と、バンドの番号との相関関係を求め、この相関関係に
基づいて残りの未検出のバンドの位置を予測する。

Ｖｓ２図の（ａ）は、検出されたバンドの序列を示す、
ここで、たとえば一番目と二番目のバンド間のピッチは
”ｌ　’　ｔ　＊　２で表わされる。

連続する各バンド間のピッチを算出し、バンド番号との
相関関係を得る。たとえば、一般式：％式％） なる関数で表わすことができる。具体的には、直線方程
式または高次の曲線方程式が得られる。

得られた相関関係から次に検出されるべきバンドの位置
を予測することができる。たとえば、七番目のバンドの
位置（ｙ７）はＶｓ−Ｙ　’　ｓ・フと予測することが
できる。

次いで、この予測位置に基づいて、泳動パターン上の全
てのバンドを検出する。

各レーンの一次元波形について信号レベルが一定の値（
閾値）を越える点もしくは領域を探し出し、抽出する。

この抽出された領域と次に検出されるべきバンドの予測
位置とが一致した場合には、該領域を有するレーン上に
次のパン、ドが存在するとみなす、たとえば、第２図に
示すように、七番目のバンドは第三スロットのレーン上
に存在すると決定される。

すなわち、二つ以上のバンドが分離されずに融合してい
るために、−次元波形上で極大値が正確に見い出されな
い場合であっても、信号レベルが閾値以上である場合に
はその予測位置にバンドが　　　　・存在すると仮想す
ることができる。このとき、各スロットに注入される試
料の量が異なることなどに起因して、レーンごとに信号
レベルが相当に異なる場合には予めレーン間で一次元波
形の強度（信号レベル）を信号処理により調整しておく
のが好ましい、あるいは、レーンごとに閾値を設定して
もよい。

また、予測位置に閾値以上の信号レベルを有するレーン
が二つ以上存在する場合には、上記塩基特異的ＤＮＡ断
片物の組合せが排他的であることから一つのバンドが二
つ以上のレーンに同時に存在することはないので、それ
らのレーンを比較して信号レベルがより高いレーンを選
び出せばよい。

このようにして、位置の予測に基づいて順次下端からバ
ンドを検出し、その序列を決定することができる。

バンドの検出順序が即ち、目的とするＤＮＡの塩基配列
を意味している。上記（１）〜（４）のスロットはそれ
ぞれ（Ｇ）、（Ａ）、（Ｔ）、（Ｃ）からなる末端塩基
についての情報を有するから、各バンドの属するスロッ
トに対応する塩基で置換することにより、ＤＮＡの塩基
配列（例えばＡ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−・・・）を
得ることができる。

なお１本発明において泳動パターンにスマイリング現象
が発生している場合には、デジタル信号に上述の信号処
理を施す前に、スマイリングの補正を行なってもよい。

スマイリング現象は、支持媒体の中央部のスロットの泳
動距離に比べて両端部のスロットの泳動距離が短くなる
現象であり、泳動過程における放熱効果（いわゆるエツ
ジ効果）などが原因となって生じるものである。

スマイリングの補正は、たとえば、以下のようにして行
なうことができる。

スマイリング現象の発生している泳動パターンにおいて
は通常、バンド（支持媒体の幅方向に長い帯状である）
が、スマイリング現象の程度に応じて泳動方向に対して
直角ではなく傾きを有していることから、まず各レーン
について少なくとも一つのバンドの傾きを検出する。傾
きはたとえばデジタル画像データ上を、各バンドに少な
くとも二本の走査線がかかるように走査してデジタル信
号を抽出したのち、各走査線について一次元波形を作成
し、その極大値の位置を結んで得られる回帰直線から求
めることができる。あるいは、オートラジオグラフの読
取（読出）過程において予め上記のようなデジタル信号
を検出しておいてもよい。

次に、スマイリング効果の程度の最も小さな一つのレー
ン（基準レーンとする）上の一つのバンド（基準バンド
）を求め、このバンドの傾きと他のレーンの最寄りのバ
ンドの傾きとから、基準バンドを当該他のレーンに外挿
し、他のレーンにおける基準バンドの相対位置を決定す
る６次いで、この相対位置と基準レーン上の位置とから
、各レーンについて泳動距離の比率を求める。得られた
比率は各レーンのスマイリング効果の程度を表わしてお
り、この比率に基づいて各レーンの泳動距離（すなわち
、レーンの一次元波形）を一括して伸縮させる。このよ
うにして、全てのレーンにっいてスマイリングの補正を
行なうことができる。

また、本発明において泳動パターンにオフセット歪みが
発生している場合には、デジタル信号に上述の信号処理
を施す前に、オフセット歪みの補正を行なってもよい。

ここで、オフセット歪みとは、試料の電気泳動の開始位
置または開始時点が各スロットで異なることによるレー
ン間相互の全体的な位置ズレを意味する。オフセット歪
みはたとえば、ゲル媒体の上端部に設けられた多数のス
ロット（試料の注入口）の形状（凹みの大きさ）が完全
に同一ではなく個々に異なっていたり、試料をゲル媒体
に付着させる際に付着位置が相互にずれたり、試料注入
直前におけるゲル媒体の尿素の洗い出しが不充分である
ためにゲル媒体への試料の浸入速度が異なることなどが
原因となって生じるものである。

オフセット歪みの補正は、たとえば、以下のよ　　　　
゛うにして行なうことができる。

泳動パターンの下部領域においては第１図に示したよう
に、一般にバンドの間隔が疎であることから、まず各レ
ーンについて少なくとも二つのバンドを検出し、下端か
ら順にバンドに通し番号を付ける。この操作は、上記の
融合バンドを分離するための信号処理における初期のバ
ンド検出操作を利用することができる。

次いで、バンドの番号とその泳動距離との相関関係（例
えば１回帰直線）を得たのち、この相関関係に基づいて
レーン間における泳動距離の差を求め、レーン間の位置
ズレとして各レーンの泳動位置（すなわちレーンの一次
元波形）を全体にずらす、このようにして、全てのレー
ンについてオフセット歪みの補正を一括して行なうこと
ができる。

なお、デジタル信号処理によるスマイリング補正および
オフセット歪みの補正の詳細については、本出願人によ
る特願昭６０−７４８９９号明細書および特願昭６０−
８５２７５号明細書にそれぞれ記載されている。

本発明の方法において、上記スマイリング補正およびオ
フセット歪みの補正の両方を行なってもよく、その場合
にはどちらを先に行なってもよい。

以上に述べた方法により、ＤＮＡの片方の鎖状分子につ
いての塩基配列を決定することができる。なお、ＤＮＡ
の塩基配列についての情報は、上記の表示形態に限られ
るものではなく、たとえば所望により同時に各バンドの
強度（２°）を放射性標識物質の相対量として表示する
ことも可能である。また同時に、オートラジオグラフの
可視　　　　“画像とともに画像として表示することも
可能であ　　　　′る。さらに、ＤＮＡの二本の鎖状分
子両方についての塩基配列を表示することもできる。

また、上記においては、試料である塩基特異的　　　　
゛ＤＮＡ断片物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排
他的組合せを利用した場合について説明したが、本発明
の信号処理方法はこの組合せに限定されるものではなく
１例えば（Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）などの種々の組合
せに適用することができる。また同様に、塩基特異的Ｒ
ＮＡ断片物の混合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ
）についても本発明の信号処理方法を適用することがで
きる。さらに、スマイリング効果の補正は、−組の核酸
の塩基特異的断片物の分離展開列に限定されるものでは
なく、支持媒体上に同時に分離展開された全ての分離展
開列について行なうことが可能である。

このよう４して得られた塩基配列情報についてはこのほ
かにも、たとえば、既に記録保存されている他の核酸の
塩基配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行な
うことも可能である。

上述の信号処理により決定された核酸の塩基配列につい
ての情報は、信号処理回路から出力されたのち１次いで
直接的に、もしくは必要により磁気ディスクや磁気テー
プなどの記憶保存手段を介して記録装置に伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に表示さ
れた記号・数値をビデオ・プリンター等に記録するもの
、熱線を用いて感熱記録材料上に記録するものなど種々
の原理に基づいた記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バンドの融合が生じている泳動パターンの例
を示す図である。 第２図は、各レーンについて信号の位置（ｙ）と信号の
レベル（２）とからなる−次元波形（１）〜（４）、お
よび模式的なバンドの序列付け（ａ）を示す図である。 特許出願人　　富士写真フィルム株式会社代　理　人　
　弁理士　　柳　川　泰　男−一一一−−−−−−−−
→−〉へ ｅ４Ｉ−１−〜　　　的　　　廿 手続補正書 昭和６０年　８月　２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
   しくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物が支持媒体上に
   一次元的方向に分離展開されて形成された複数の分離展
   開列のオートラジオグラフに対応するデジタル信号につ
   いて信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を決
   定する方法において、 １）各分離展開列の下部領域において少なくとも二つの
   連続するバンドを検出し、下端から順にバンドに通し番
   号を付する工程、 ２）検出されたバンドについて、バンド間の分離展開方
   向についての距離と該バンドの番号との相関関係を得、
   この相関関係から未検出のバンドの分離展開方向につい
   ての位置を予測する工程、および ３）予測位置に基づいて各分離展開列上の全てのバンド
   を検出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
   号処理方法。 ２、上記第一工程において、各列の分離展開方向に沿つ
   てデジタル信号を抽出したのち、各列における抽出信号
   のレベルが極大となる位置を求めることにより、バンド
   を検出することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ３、上記第二工程において、バンド間の距離とバンドの
   番号との相関関係を回帰直線もしくは回帰曲線として得
   、この回帰直線もしくは回帰曲線を外挿することにより
   未検出のバンドの位置を予測することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための信
   号処理方法。 ４、上記第三工程において、各分離展開列について信号
   のレベルが閾値を越える点もしくは領域を探索抽出し、
   この抽出された点もしくは領域が未検出のバンドの予測
   位置に一致する場合に該点もしくは領域上に未検出のバ
   ンドが存在するとみなすことにより、バンドを検出する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
   基配列決定のための信号処理方法。 ５、上記第一工程の前に、各分離展開列について少なく
   とも一つのバンドの分離展開方向に対する傾きを検出し
   たのち、この傾きに基づいて各列の分離展開距離の比率
   を求め、そしてこの比率に基づいて各列の分離展開距離
   を補正することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ６、上記第一工程の前に、各分離展開列の下部領域にお
   いて少なくとも二つのバンドを検出し、下端から順にバ
   ンドに通し番号を付したのち、各分離展開列ごとにバン
   ドの番号とその分離展開距離との相関関係を得、そして
   この相関関係から求められた列間の分離展開距離の差に
   基づいて各列の分離展開位置を補正することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のた
   めの信号処理方法。 ７、上記塩基特異的ＤＮＡ断片物の混合物が、（１）グ
   アニン特異的ＤＮＡ断片物、 （２）アデニン特異的ＤＮＡ断片物、 （３）チミン特異的ＤＮＡ断片物、 （４）シトシン特異的ＤＮＡ断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類の塩基
   特異的ＤＮＡ断片物がそれぞれ支持媒体上に分離展開さ
   れて形成された四列の分離展開列からなることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定の
   ための信号処理方法。 ８、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
   、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シー
   トとを重ね合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオ
   ートラジオグラフを該蛍光体シートに蓄積記録したのち
   、該蛍光体シートに励起光を照射して該オートラジオグ
   ラフを輝尽光として光電的に読み出すことにより得られ
   たものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ９、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
   、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせて、支持媒体
   上の放射性標識物質のオートラジオグラフを該感光材料
   に感光記録したのち、該感光材料上に可視化されたオー
   トラジオグラフを光電的に読み取ることにより得られた
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。