JP5973404B2 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、単板の受光素子を用いる蛍光検出装置及び蛍光検出方法に関する。

光を利用した検出では、意図しない背景光を低減し、測定感度を向上させるため、ピンホールを用いた光学系が利用されている。特許文献１では、蛍光標識されたＤＮＡ断片を共焦点光学系で検出して、ＤＡＮ配列を決定する方法を開示している。

特許文献１において、ＤＮＡ断片は４塩基種（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）ごとに、波長の異なる蛍光色素で標識されている。このＤＮＡ断片をガラスキャピラリに注入した後、キャピラリ両端に電圧を印加して電気泳動する。電気泳動によりＤＮＡ断片は長さの違いで分離される。キャピラリ上の検出点に励起光を照射して、電気泳動で分離されたＤＮＡ断片からの蛍光を、４つのダイクロイックミラーで分光して４つの光路に分ける。そして、４つの分光された光を４つのフォトセンサで１つあたり１色の蛍光強度を検出して色を識別する。ここで、フォトセンサの前にはピンホールが設置された共焦点光学系が用いられている。これにより、キャピラリ表面での励起光の散乱等の背景光を除去している。複数のキャピラリは、励起光に対してキャピラリの相対位置をスキャンすることで測定可能となっている。キャピラリの泳動時間からＤＮＡ塩基配列上の位置を、識別された色から塩基種を同定して、ＤＮＡ断片の配列情報の解読に成功している。

特許文献２は、ピンホールアレイとカラーカメラを使用して、印刷物の画像を取得する方法を開示している。各ピンホールは、カラーカメラ上で結像した光が互いに重ならないように配置されている。また、特許文献３は、被写体のスペクトル情報を高精度に取得する方法を開示している。特許文献３において、被写体からの光はハーフミラーで２つに分けられ、２つに分けられた光の一方はカラーカメラで画像を取得するために用いられ、もう一方はピンホールを透過した後、スペクトルセンサでスペクトル情報を取得するために用いられる。ピンホールは観察視野範囲を限定するために用いられている。スペクトルセンサは、異なる色を透過させる複数のフィルタを備えたフォトセンサで構成されている。透過させる帯域はフィルタごとにすべて異なっており、取得したいスペクトル帯域がカバーされている。

米国特許第５２７４２４０号明細書 特開平０８−１０１０６７号公報 特開２０１１−２２３３８２号公報

樹脂製マイクロチップと蛍光検出を組み合わせた分析装置では、励起光をマイクロチップに照射したとき、チップ材質からの背景光が大きいために、検出対象からの蛍光信号を良好な信号ノイズ比（ＳＮ比）で検出することが困難であった。特に検出対象が微量の場合は、蛍光が微弱になるため、背景光に埋もれてしまう。このような背景光には、チップ材質の自家蛍光やラマン散乱光などがある。

背景光の影響を低減する方法としてピンホールを用いた共焦点光学系は有効な方法である。特許文献１の技術は、高感度に蛍光を分光して蛍光を検出した例であるが、３枚のダイクロイックミラーで４色を分離するために、光路長が長くなって装置の小型化および低価格化ができない。また、複数のキャピラリからの蛍光を測定するためにキャピラリアレイを動かしてスキャンしているが、装置の安定性の点から望ましくない。

また、特許文献２の技術では、ピンホールのみを使用して結像しているため、小型な装置構成となっているが、集光レンズを用いていないために検出器で得られる蛍光量は微弱であり、感度は向上できない。さらに、特許文献３の技術では、スペクトル情報を得るスペクトルセンサを備えているが、センサ中の各色に対応するフォトセンサがそれぞれ１つのみであるため、フォトセンサの位置によって得られる蛍光強度が変動し、色判定精度が安定しない。また、各色のフォトセンサに照射される光量を最大にするための光軸調整に手間がかかる。さらに、複数個の検出点がある場合には上記センサを増やす必要があるため、装置が大型になる。

本発明は、チップ材料からの自家蛍光を低減し、かつ安価で小型な蛍光検出装置を提供することを目的とする。

本発明者らは、共焦点光学系におけるピンホールを通った光を、焦点位置から外れた位置に設けられた単板の受光素子で受光し、色毎の光量を測定することにより、上記課題が解決できることを見出した。

上記課題を解決する為に例えば特許請求の範囲に記載の構成を採用する。本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるがその一例をあげるならば、基板に保持された少なくとも１つの測定対象からの光を集光するレンズと、前記光を測定する受光器と、前記受光器と前記レンズの間で前記受光素子に対面し、前記レンズの焦点位置に配置された遮光板と、を備え、前記遮光板は、少なくとも１つのピンホールを有し、前記受光器は、前記レンズの焦点から外れた位置に配置された単板の受光素子を備え、前記単板の受光素子には、複数の色の画素を１単位とする画素群が複数個配列されており、前記受光器は、前記ピンホールを通った前記光を前記受光素子によって受光する、蛍光検出装置が提供される。

また、他の例によれば、レンズによって、基板に保持された少なくとも１つの測定対象からの光を集光するステップと、少なくとも１つのピンホールを有し、前記レンズの焦点位置に配置された遮光板によって、前記光を遮光するステップと、前記レンズの焦点から外れた位置に配置された単板の受光素子を備える受光器を用いて、前記ピンホールを通った前記光を前記受光素子によって受光するステップであって、前記単板の受光素子には、複数の色の画素を１単位とする画素群が複数個配列されている、ステップと、を含む蛍光検出方法が提供される。

本発明によれば、チップ材料からの自家蛍光を低減させ、かつ単板の受光素子で検出することによって安価で小型な蛍光検出装置を提供することができる。
本発明に関連する更なる特徴は本明細書の記述添付図面から明らかになるものである。また上記した以外の課題構成及び効果は以下の実施例の説明により明らかにされる。

第１実施例におけるチップ電気泳動装置の蛍光検出系の構成例である。 第１実施例におけるチップの上面図である。 カラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。 受光素子上のスポットの直径に対する各色画素の光強度のばらつきを計算した結果である。 受光素子上のスポットの大きさに対するＳＮ比を計算した結果である。 核酸の配列決定方法のフローチャートである。 キャリブレーションのフローチャートである。 第２実施例における電気泳動チップの構成例である。 第２実施例におけるチップ電気泳動装置の蛍光検出系の構成例である。 第２実施例におけるカラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。 第３実施例における電気泳動チップの構成例である。 第３実施例におけるチップ電気泳動装置の蛍光検出系の構成例である。 第３実施例におけるカラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。 第４実施例におけるマイクロレンズをピンホールの直後に配置した光学系の例である。 図８Ａの構成におけるカラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。 第４実施例におけるマイクロシリンドリカルレンズをピンホールの直後に配置した光学系の例である。 図８Ｃの構成におけるカラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。 第５実施例におけるチップ電気泳動装置の蛍光検出系の構成例である。第３実施例における電気泳動チップの構成例である。 第５実施例における２次元に検出点が配置されたマイクロアレイの構成例である。 第５実施例におけるカラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。 第６実施例におけるチップ電気泳動装置の蛍光検出系の構成例である。

以下添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。なお添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているがこれらは本発明の理解のためのものであり決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。なお、本実施例の形態を説明するための全図において同一機構を有するものは原則として同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。

［第１実施例］
図１Ａは、本実施例におけるチップ電気泳動装置（蛍光検出装置）の構成例である。チップ電気泳動装置では、基板に作製した流路内に、試料溶液を注入した後、両端に電圧を掛けて電気泳動を行うことにより、試料溶液成分が荷電、大きさ、形などに基づく移動度の差異で分離され、検出器より試料成分の検出を行う。

蛍光検出装置は、光学系１０１と、電気泳動チップ１３０と、電源１３６と、制御部１４０と、温調部１５０と、カラーカメラ１２０とを備える。電源１３６は、電気泳動チップ１３０内のチップ流路１３４ａ−１３４ｄに電圧を印加するために用いられる。温調部１５０は、チップ流路１３４ａ−１３４ｄの温度を一定に保つために用いられる。光学系１０１は、電気泳動で分離されたＤＮＡ断片に修飾されている色素を励起し、蛍光１０３を検出するために用いられる。カラーカメラ１２０は、以下で説明するピンホール１０４を通過した光について色に対応した画素の光量を測定するものである。電源１３６と温調部１５０と光学系１０１は、制御部１４０によって自動制御される。加えて、制御部１４０は、カラーカメラ１２０からの信号データを解析して、ＤＮＡ配列情報に変換する機能を有する。以下、蛍光検出装置の各構成要素の詳細を説明する。

電気泳動チップの構造の説明
図１Ａは、電気泳動チップの断面図を示しており、図１Ｂは、電気泳動チップの上面図を示す。電気泳動チップ１３０は、チップ本体１３５ａとチップフィルム１３５ｂを張り合わせて作製される。チップ本体１３５ａには、流路１３４ａ−１３４ｄを形成するための溝と、溶液を保持するためのウェル１３３ａ−１３３ｄが設けられている。同一チップ内に複数組のウェル１３３ａ−１３３ｄ及び流路１３４ａ−１３４ｄが設けられてもよい。チップフィルム１３５ｂをチップ本体１３５ａの溝がある側に張り合わせることにより、電気泳動チップ１３０に流路１３４ａ−１３４ｄが形成される。チップフィルム１３５ｂの材質は特に限定しないが、チップ本体１３５ａと同材質または同系統の樹脂が好ましい。

樹脂チップ材料からの自家蛍光やラマン散乱光などの背景光は蛍光測定のノイズとなる。電気泳動チップ１３０の材質には、前記背景光の少ない樹脂が望ましく、例えばアクリル樹脂やシクロオレフィン樹脂である。一例として、電気泳動チップ１３０は、シクロオレフィン系樹脂またはポリメタクリルメタクリレート樹脂の本体と、前記樹脂のフィルムとから構成される。

チップ本体１３５ａの厚みは特に限定しないが、例えば１ｍｍである。張り合わせるチップフィルム１３５ｂの厚さは特に限定しないが、背景光低減のために薄いほど良い。チップフィルム１３５ｂの厚さは１ｍｍ以下が望ましく、例えば０．１ｍｍである。また、チップフィルム１３５ｂが薄いことにより、流路１３４ａ−１３４ｄ内の温度調節が容易になり、電気泳動による検出対象（本実施例ではＤＮＡ断片）の分離度が向上する効果もある。

また、チップ本体１３５ａに検出窪み１３８を設けても良い。検出窪み１３８は、蛍光検出点１３１近傍の部分におけるチップ本体１３５ａの厚さを薄くすることで形成される。検出窪み１３８があることで、検出窪み１３８がない場合に比べて樹脂の背景光強度を低減できるので、蛍光検出の感度（ＳＮ比）が向上する。ここで、「ＳＮ比」とはカラーカメラ１２０で発生するノイズに対して検出される蛍光信号の比を意味する。もちろん、本実施例の光学系に以外の他の光学系を用いた場合にも、検出窪み１３８を用いる効果は発揮される。「ノイズ」は、蛍光信号が検出されていないときに、カラーカメラ１２０で検出される検出強度、すなわち背景光強度の標準偏差である。一方、「蛍光信号」はカラーカメラ１２０で検出された蛍光１０３強度から背景光強度を差し引いたものである。すなわち、「蛍光信号」は、理想的には検出対象から発せられる蛍光のみによる信号強度である。励起光１０２によって励起される蛍光以外の光（樹脂由来のラマン散乱光など）は背景光となる。上記のような電気泳動チップ１３０は、例えば射出成型で作成される。

流路１３４ａ−１３４ｄの断面形状は、特に限定されないが、例えば幅０．０５ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの正方形である。流路Ａ、Ｂ、Ｃ（１３４ａ−１３４ｃ）の長さは各５ｍｍであり、流路Ｄ（１３４ｄ）の長さが１０５ｍｍである。流路上の照射および検出位置は、例えばウェルＤ（１３３ｄ）から５ｍｍ離れた流路Ｄ（１３４ｄ）上にある。各ウェル１３３ａ−１３３ｄの形状は、例えば直径２ｍｍの円柱である。上記ウェル１３３ａ−１３３ｄや流路１３４ａ−１３４ｄの断面形状は他の形状でも構わない。

また、チップ本体１３５ａの上面に断熱シート１３７を密着させても良いし、チップ本体１３５ａと断熱シート１３７との間に熱伝導性の良いシートを挿入しても良い。各ウェル１３３ａ−１３３ｄには、それぞれ電極１３２ａ−１３２ｄを挿し込まれており、各電極１３２ａ−１３２ｄは、電源１３６に接続されている。

光学系の説明
光学系１０１は、光源１０５と、励起光用集光レンズ１０７と、対物レンズ１１０と、励起光カットフィルタ１０８と、チューブレンズ１０６と、ピンホール１０４（例えば、ピンホールを有する遮光板）とを備える。以下に、光が進む経路に沿って光学系１０１の構成を説明する。

光源１０５から発せられる励起光１０２は、励起光用集光レンズ１０７によって流路Ｄ（１３４ｄ）上の検出点１３１に集光される。集光された光は、ＤＮＡ断片に修飾された４種蛍光体に照射されて、これにより、蛍光１０３が励起される。本実施例では、４種蛍光体としてＢｉｇＤｙｅ^ＴＭ（登録商標：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いたが別の蛍光体でも構わない。光源１０５には５０５ｎｍで発振するレーザを用いた。

蛍光１０３を含む検出点１３１から発せられる光は、対物レンズ１１０で平行光束化された後、励起光カットフィルタ１０８で励起光の散乱成分が取り除かれる。カットフィルタ１０８を通過した蛍光１０３は、チューブレンズ１０６によって集光されて、ピンホール１０４の配置された面で結像する。対物レンズ１１０とチューブレンズ１０６にはＮＡが０．４、焦点距離３５ｍｍのカメラレンズを用い、検出点１３１からの発光をピンホール１０４の位置で等倍に結像させた。対物レンズ１１０には顕微鏡用対物レンズを用いても構わない。励起光カットフィルタ１０８には５２０ｎｍ以下の光を取り除くロングパスフィルタを用いた。

ピンホール１０４の穴径は特に限定されないが、例えば５０ｕｍである。ピンホール１０４は、カラーカメラ１２０とチューブレンズ１０６の間でカラーカメラ１２０対面し、チューブレンズ１０６の焦点位置に設置される。対物レンズ１１０の焦点から外れた位置から発せられる光はピンホール１０４を透過せずに遮断される。ピンホール１０４を通過した光は、直後に設置されたカラーカメラ１２０によってその光強度が検出される。このような共焦点光学系を用いることで、樹脂のラマン散乱等による背景光を低減できるため、高い蛍光検出感度（ＳＮ比）を達成できる。

従来では、通常、２次元センサと共焦点光学系で多色検出する場合は、ピンホール１０４位置に結像し、ピンホール１０４を透過した光線を、別のレンズで平行光束化し、分光素子で各色に分光し、さらにもう一枚の別のレンズで検出器の受光素子平面に再結像させる。しかしながら、本実施例では、このようなレンズと分光素子による再結像系を用いず、ピンホール１０４の直後にカラーカメラ１２０を設置することを特徴とする。これにより、装置の小型化や低価格化、及び光学部品数の低減、さらには、後で述べるように高い色判定精度を達成する効果がある。

図１Ｃに示すように、カラーカメラ１２０は、単板の受光素子１２１を備える。受光素子１２１はアレイ状に配置された画素群１２６の集合体である。１つの画素群１２６は、アレイ状に配置された複数の画素（１２２−１２５）によって構成される。ここで、画素（１２２−１２５）は、特定の色を透過させるフィルタと、その透過した光を検出するフォトセンサとから構成される。上記フィルタはフォトセンサ上を覆い、このフィルタを透過した光のみが、フォトセンサで検出される。画素（１２２−１２５）の形状は特に限定されないが、例えば１辺２４ｕｍの正方形である。

画素（１２２−１２５）のフィルタの種類は４つ（すなわち４色）の例を示したが、２種類以上であればよい。また、画素群１２６内に同一種のフィルタが複数枚あっても良い。ここでは１種類のフィルタが透過させる蛍光体の色は、１色となるようにフィルタの透過率特性を設計したが、複数色を透過させても構わない。ここで、「単板」とは、受光素子がカラーカメラ装置内に１つしかないことを意味する。

以下、本実施例の効果を説明する。カラーカメラ１２０の受光素子１２１はチューブレンズ１０６の焦点から外れた位置に設置される。したがって、受光素子１２１上の蛍光１０３のスポット（光束）１２７は、ピンホール１０４上に結像される像よりもぼけた像となる（図１Ｃ）。受光素子１２１上のスポット１２７の直径は、ピンホール１０４と受光素子１２１との間の距離により調整が可能である。スポット１２７の直径を大きくすることで、スポット１２７内には複数の画素群１２６が含まれる（すなわち、各色の画素（１２２−１２５）が複数含まれる）ようになる。

スポット１２７は蛍光１０３の強度分布を持つため、画素の位置によって蛍光１０３の強度がばらつく問題が生じる。しかし、本実施例では、色毎に複数の画素で検出することにより、１色あたりの蛍光信号を複数の同色画素の積算値として算出できるため、１画素の蛍光信号から算出する場合に比べて、各色の画素に入射する光のばらつきを低減できる。これにより、蛍光体の色の判定精度を向上できる。

また、受光素子１２１上に結像させる場合は、スポット１２７の直径が小さくなるため、各色の蛍光強度がばらついて色判定精度が低下する。これに対して、本実施例では、蛍光１０３のスポット１２７を、ピンホール１０４上に結像される像よりもぼけた像とし、かつ、色毎に複数の画素で検出することにより、各色の画素に入射する光のばらつきを低減できる。

図２は、光のスポット１２７の直径に対して、画素（１２２−１２５）に入射される光強度の４色間ばらつき（ＣＶ値）を算出した結果である。ばらつきの算出では、光のスポット１２７内の光強度分布が正規分布に従うと仮定し、強度分布の標準偏差の６倍以内に含まれる画素（１２２−１２５）の直径をスポット１２７の直径とした。強度のばらつきは、スポット１２７を内包する最小の正方形領域内の各色の画素（１２２−１２５）ごとの蛍光信号を、積算した値のＣＶ値である。このとき、正方形を構成する単位は、画素群１２６である。

図２に示すように、スポット１２７の直径が大きくなるにつれ、各色の光強度のばらつきは減少した。本実施例の光学系は等倍結像であり、検出点１３１の結像サイズは５０ｕｍ程度である。受光素子１２１の画素サイズは２４ｕｍであるため、この結像サイズの直径は２画素に相当する。図２の結果は、スポット１２７の直径を２画素よりも大きくすることによって、具体的には直径を３画素以上にすることによって光強度ばらつきを劇的に減少できることを示している。各色の光強度ばらつきを低減するためには、スポット１２７に含まれる各色の画素（１２２−１２５）はそれぞれ２個以上とすることが望ましく、本実施例では４色の検出を行うため、スポット１２７の直径を４画素以上とすれば良いことが分かった。さらに、直径を８画素以上とするとＣＶ値が１０％以下となり、各色の画素（１２２−１２５）に入射する光量の均一性が保たれるため、色判定精度が一層安定する。

一方、光のスポット１２７が大きくなるにつれ、光の密度が低下するため、１画素当りの蛍光信号は低下し、色判定精度も低下することになる。図３は、スポット１２７の直径を変化させたときのＳＮ比の例である。スポット１２７の直径が変化したときの１画素当りの蛍光信号とノイズを計算し、１辺がスポット１２７を内包する最小の正方形領域内の各色についてＳＮ比の平均値を求めた。図３の値には、４色のＳＮ比で最も低い値を採用した。

図３に示すように、ＳＮ比は、スポット１２７の直径とともに低下している。ＳＮ比が３以上で測定可能としたとき、スポット１２７の直径を２０画素以下とすれば色の判定が可能となる。ＳＮ比は大きいほど、色判定精度は一層安定する。前記の光量の均一性の条件より大きく、ＳＮ比が十分大きいスポット１２７の直径を選択することで色判定精度が安定する。

本実施例では、ピンホール１０４と受光素子１２１の距離を約０．５ｍｍとすることにより、スポット１２７の直径を１０画素（２４０ｕｍ）とした。ＳＮ比を向上する他の手段として、試料の濃度の増加及び入射光強度の増加、カメラの露光時間の増加などと組み合わせることが有効である。以上より、本実施例では、スポット１２７が受光素子１２１上で８×８画素以上、２０×２０画素以内の範囲に収まるように、ピンホール１０４に対するカラーカメラ１２０の距離を調整したが、上記以外の範囲でも構わない。本実施例では、正方形の領域内で各色毎に画素を積算したが、円形や長方形など他の形状の領域内で積算してもよい。また、各色毎の積算値ではなく、各色毎の画素の平均値を計算してもよい。

温調部の説明
図１Ａに示すように、温調部１５０は、チップフィルム１３５ｂの側面に配置されている。温調部１５０で流路１３４ａ−１３４ｄの温度を一定に保つことで、電気泳動時間や電気泳動による核酸の分離度を一定に保つ効果がある。本実施例では、例えば、上記温度は５０度である。

温調部１５０は、面積１００ｍｍ×１２０ｍｍ、厚み１０ｍｍの板に温度調製機構と温度センサが組み込まれた構造である。温度センサは、電気泳動チップ１３０の下面の温度を測定し、制御部１４０に温度データを送信する。制御部１４０は、受信した温度データをもとに、温度調整機構を駆動させて電気泳動チップ１３０の温度を一定に保つ。温度調整機構にはファンで風を吹き付けて空冷したり、配管を接触させて水冷温したりしても構わない。温度センサには熱電対を用いたが他のセンサでも構わない。

温調部１５０の板としては、アルミ、真鍮、銅や鉄などの金属が好ましく、金属以外でも熱伝導率が高い素材であれば良い。金属板には放熱のためのフィン構造を設けても良い。温調部１５０とチップフィルム１３５ｂは密着している方が温調効率は良い。温調部１５０とチップフィルム１３５ｂとの間に隙間があると空気層が存在し、熱伝導効率が下がる。密着させるために、電気泳動チップ１３０を温調部１５０にクランプのような固定治具で押しつけても良い。また、電気泳動チップ１３０の上面に断熱シート１３７を密着させても良いし、電気泳動チップ１３０と断熱シート１３７の間に熱伝導性の良いシートを挿入しても良い。断熱シート１３７をチップ上面に密着させることで、流路１３４ａ−１３４ｄ内の温度均一性が保たれる効果がある。熱伝導性の良いシートとしてはシリコンシートがある。断熱シート１３７としてはポリスチレンシートがある。他に温調部１５０とチップフィルム１３５ｂとの間に熱伝導シートやシリコンゴムなど、容易に変形しかつ熱伝導率の高い素材を満たしてもよい。

核酸の配列決定方法
図４は核酸の配列決定方法のフローチャートである。本法にはキャピラリーシーケンサで用いられるサンガー法を用いた。ＤＮＡ試料のチップ流路への注入にはクロスインジェクション法を用いた（Ｓｈｉ、 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、 ２７、 ３７０３、 ２００６）。以下に具体的な方法を記述する。

電気泳動チップ１３０を温調部１５０に置き、温調部１５０の温度を測定時の温度（５０度）に設定する（２０１）。ガスタイトシリンジとフェラル、ナット、チューブを使用し、約０．５ＭＰａの圧力でウェルＤ（１３３ｄ）から電気泳動用ポリマを充填する（２０２）。本実施例では、ポリマとして４％ｗｔの直鎖状ポリアクリルアミド水溶液を使用した。

次に、ウェルＡ（１３３ａ）、ウェルＢ（１３３ｂ）、ウェルＤ（１３３ｄ）に、電気泳動用ポリマと同じ組成を持つバッファ溶液（１ｘＴＴＥ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ５０ｍＭ ＴＡＰＳ、 ２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を注入する（２０３）。次に、４種蛍光体で修飾されかつ異なる長さのＤＮＡ断片を含む溶液（ＤＮＡ試料）をウェルＣ（１３３ｃ）に注入する（２０４）。前記修飾は、例えば、市販されているキット（例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）を用いたサイクルシーケンスにより行われる。

次に、各ウェル１３３ａ−１３３ｄにそれぞれ電極１３２ａ−１３２ｄを挿し込み、電極１３２ａ−１３２ｄを溶液と電気的に接触させる（２０５）。ウェルＡ、Ｃ、Ｄ（１３３ａ、１３３ｃ、１３３ｄ）にＶａ＝０Ｖ、ウェルＢ（１３３ｂ）にＶｂ＝３００Ｖ印加し、１００秒間電気泳動してウェルＣ（１３３ｃ）とウェルＤ（１３３ｄ）間の流路Ｂ、Ｃ（１３４ｂ、１３４ｃ）に試料を注入する（２０６）。

続いて、ウェルＡ（１３３ａ）にＶｃ＝０Ｖ、ウェルＢ、Ｃ（１３３ｂ、１３３ｃ）にＶｄ＝２２０Ｖ、ウェルＤ（１３３ｄ）にＶｅ＝３３００Ｖを印加する。同時に、カラーカメラ１２０の受光素子１２１によるデータ検出を開始する（２０７）。データの取り込み間隔は１０Ｈｚ、露光時間は６０ｍ秒とし、スポット１２７に含まれる１０×１０画素の領域（各色２５画素）を積算する。取り込まれたデータの計算は制御部１４０によって行われる。

流路（１３４ａ−１３４ｄ）の交差部１３９にあるＤＮＡ試料のみが流路Ｄ（１３４ｄ）上で電気泳動され、塩基長の違いにより分離される。ウェルＤ（１３３ｄ）から５ｍｍ離れた検出点１３１で励起光１０２が照射され、検出点１３１で発せられる蛍光１０３の強度変化及び色の違いを測定して、ＤＮＡ断片の塩基配列を取得する（２０８）。

制御部１４０によって、スポット１２７に含まれる領域内に含まれる画素の信号強度を各色で積算し、基準マトリクスを参照することで、電気泳動時間毎に検出される蛍光体の色を判別する。基準マトリクスとは、各色が各種画素で検出される蛍光信号強度の比である。本実施例では、４種蛍光体を用いるので、基準マトリクスは４×４の行列となる。基準マトリクスの逆行列を用いて、各種画素で検出される蛍光信号強度比から、各蛍光体の蛍光信号強度に変換する。このような基準マトリクスは後述するキャリブレーションで取得される。本実施例では、５００塩基を２３分で解読した。一定の時間経過後に、装置は自動的に停止する。

分離を良くするために、電気泳動前にチップの流路１３４ａ−１３４ｄの内部をコーティング剤で処理しても良い。コーティング剤としては、ポリジメチルアクリルアミド／ジエチルアクリルアミド（Ｓｈｉ、 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、 ２７、 ３７０３、 ２００６）などがある。流路１３４ａ−１３４ｄ内に充填した電気泳動用ポリマをチップ内壁に馴染ませるため、一定時間放置してから電気泳動を開始してもよい。また、同様の効果を狙って、核酸を注入する前に電圧を印加して、予備電気泳動をしても良い。

キャリブレーションの手順
キャリブレーションでは、カラーカメラ１２０とピンホール１０４の位置合わせおよび基準マトリクスの作成を行う。これにより、安定した塩基種判定が可能となる。図５はキャリブレーションの手順を示したフローチャートである。

チップを温調部１５０にセットする。そして、検出点１３１の位置判定には水のラマン散乱光を使用するため、流路１３４ａ−１３４ｄ内に水を充填する（３０１）。充填する溶液は泳動用のポリマやバッファ等の水が含まれている溶液でも良い。次に、対物レンズ１１０の焦点を流路Ｄ（１３４ｄ）上の検出点１３１に合わせる（３０２）。

次に、ピンホール１０４を光路上に置き、カラーカメラ１２０をピンホール１０４の直後に置く（３０３）。ピンホール１０４とカラーカメラ１２０を、光軸方向に対して前後に動かして同時に微調整し、水のラマン散乱光強度が最も大きくなる位置でピンホール１０４を固定する（３０４）。

次いで、カラーカメラ１２０を前後に動かして位置を調節することで、所望のスポット１２７の大きさが得られる位置でカラーカメラ１２０の位置を固定する（３０５）。これにより、流路Ｄ（１３４ｄ）上の検出点１３１に相当する画素の積算範囲が決定される。ピンホール１０４とカラーカメラ１２０を固定した後に、標準試料を電気泳動して、基準マトリクスを作成する（３０６）。標準試料は、４色の蛍光体が異なる鎖長のＤＮＡに修飾されている試料である。電気泳動して検出される蛍光体の色の順番が既知なので、各蛍光体に関して、４色の画素（１２２−１２５）の蛍光信号強度の比が得られる。このような４つの信号強度比を４種蛍光体に関して並べた４×４の行列が基準マトリクスとなる。

なお、上述のピンホール１０４とカラーカメラ１２０の位置調整に関して、位置調整及び固定機構が設けられてもよい。以上のキャリブレーションは装置出荷前に行うが、チップ交換毎に行っても良い。流路Ｄ（１３４ｄ）上の位置とスポット１２７の直径は電気泳動チップ１３０の交換毎に確認することが望ましい。基準マトリクスの作成は、蛍光体の種類の変更時、光源１０５の交換時等に行う必要がある。

［第２実施例］
本実施例では、電気泳動チップ１３０に複数の流路が設けられていること特徴とする。これにより、サンプルの並列処理数を向上する効果がある。なお、図１Ａ−図１Ｃと同一の符号を付された構成については説明を省略する。

図６Ａは、４組のウェル１３３ａ−１３３ｄと流路１３４ａ−１３４ｄが設けられている電気泳動チップ１３０の例である。４組の流路１３４ａ−１３４ｄは、ウェル１３３ａおよび１３３ｄを共有する構成となっており、ウェル１３３ｂおよび１３３ｃについては、４組の流路１３４ａ−１３４ｄのそれぞれに設けられている。電気泳動チップ１３０では、各流路１３４ｄに対して検出点１３１が設けられている。図６Ｂは、本実施例におけるチップ電気泳動装置の光学系１０１の例である。本実施例では、検出点１３１と同数のピンホールを持つピンホールアレイ１０４１（例えば、複数のピンホールを有する遮光板）が設置される。

複数の検出点１３１からの蛍光１０３は、一つの対物レンズ１１０で平行光束化され、一つのチューブレンズ１０６でピンホールアレイ１０４１上に結像させる。ここで、４箇所の検出点１３１の結像点と各ピンホールの位置がそれぞれ一致するようにする。ピンホールアレイ１０４１の直後に受光素子１２１を設置することで、複数の検出点１３１からの蛍光信号を１つのカラーカメラ１２０で同時に検出できる。

図６Ｃは、カラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。受光素子１２１上での検出点１３１からの複数のスポット１２７は、一列に並んで配置される。本実施例の各スポット１２７の大きさは、第１実施例と同様に、光の均一性とＳＮ比を考慮する必要がある。さらに、隣り合う検出点１３１からのスポット１２７が互いに重ならないようにする必要がある。つまり、各流路１３４ｄ間の間隔は、スポット１２７の直径より大きくする必要がある。本実施例では、光学系１０１が等倍結像のため、各流路Ｄ（１３４ｄ）間の間隔をスポット１２７の直径よりも大きくする必要がある。また、全てのスポット１２７が受光素子１２１に内包されるようにする。本実施例の構成によれば、検出器やレンズ等の光学部品点数を増やす必要はなく、装置の小型化、低価格化が可能になり、光学系１０１の調整も簡単になる。

［第３実施例］
本実施例は、複数の検出点１３１を流路方向に交互にずらして配置することを特徴とする。これにより、電気泳動チップ１３０内の流路Ｄ（１３４ｄ）間の間隔を小さくでき、電気泳動チップ１３０の小型化が可能になるという効果がある。なお、図１Ａ−図１Ｃ及び図６Ａ−６Ｃと同一の符号を付された構成については説明を省略する。

図７Ａは、隣り合う流路Ｄ（１３４ｄ）上の検出点１３１を流路方向に交互にずらして配置した電気泳動チップ１３０の例である。ウェルＤ（１３３ｄ）から検出点１３１までの距離を流路Ｄ（１３４ｄ）毎に変えて複数の検出点１３１を配置する。流路１３４ａ−１３４ｄの交差部１３９から検出点１３１までの泳動距離は全ての流路で同一である。

図７Ｂは、本実施例におけるチップ電気泳動装置の光学系１０１の例である。ピンホールアレイ１０４１の各ピンホールの位置を検出点１３１に対応して配置する。図７Ｃは、カラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。受光素子１２１上での検出点１３１からの複数のスポット１２７は、２列に並んでかつ互いにずれるように配置される。

第２実施例では、隣り合うスポット１２７同士が重ならないために、流路Ｄ（１３４ｄ）間の距離は、スポット１２７の直径よりも大きい必要があったが、本実施例の検出点１３１の配置によれば、流路Ｄ（１３４ｄ）間の間隔をより近づけることが可能になり、電気泳動チップ１３０を小さくできる効果がある。さらに、隣り合う検出点１３１の距離を大きくできるので、スポット１２７の直径をより大きくできる効果もある。加えて、受光素子１２１の画素を有効に使える効果もある。

［第４実施例］
本実施例は、ピンホールアレイ１０４１の直後にマイクロレンズ１６１、またはマイクロシリンドリカルレンズ１６２を設置することを特徴とする。これにより、光束の広がりを抑えてスポット１２７の大きさの制御できる効果がある。なお、図１Ａ−図１Ｃ及び図６Ａ−６Ｃと同一の符号を付された構成については説明を省略する。

図８Ａは、ピンホールアレイ１０４１の直後にマイクロレンズ１６１を配置した光学系１０１の例である。図８Ｂは、図８Ａの構成におけるカラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。マイクロレンズ１６１を通った光の広がり角が小さくなるため、受光素子１２１上での検出点１３１からの複数のスポット１２７の大きさが調整可能となる。

マイクロレンズ１６１を通った光の広がり角が小さくなるため、ピンホールアレイ１０４１から受光素子１２１までの距離をとることができる。受光素子１２１上でスポット１２７の大きさの変化量が少なくなるため、スポット１２７の位置を確認するキャリブレーション（３０５）がより簡単になる。

図８Ｃは、ピンホールアレイ１０４１の直後にマイクロシリンドリカルレンズ１６２を配置した光学系１０１の例である。図８Ｄは、図８Ｃの構成におけるカラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。マイクロシリンドリカルレンズ１６２はピンホールアレイ１０４１の直後に設置される。マイクロシリンドリカルレンズ１６２を通った光が受光素子１２１上に形成するスポット１２７の形は楕円形となり、スポット１２７の長軸が互いに平行になるように配置する。この配置により、スポット１２７の大きさを確保しながら、スポット１２７の間隔を小さくでき、電気泳動チップ１３０の小型化が可能になる。なお、シリンドリカルレンズに代えて、細長いラインを照射するためにロッドレンズを使用してもよい。

［第５実施例］
本実施例では、２次元の格子状に設けられたピンホールアレイ１０４１を用いることを特徴とする。これにより、２次元に格子状に配置された（アレイ化された）試料の蛍光測定が可能となる効果がある。なお、図１Ａ−図１Ｃ及び図６Ａ−６Ｃと同一の符号を付された構成については説明を省略する。

図９Ａは、本実施例におけるチップ電気泳動装置の蛍光検出系の構成例である。図９Ｂは、本実施例における２次元に検出点が配置されたマイクロアレイの構成例である。マイクロアレイ１７１は、多数のＤＮＡ断片をプラスチックやガラス等の基板上に高密度に配置したものである。マイクロアレイ１７１では、複数の検出点１３１が２次元にアレイ化されている。各検出点１３１には、既知の塩基配列を持つ１本鎖ＤＮＡが固定化されており、検出点１３１ごとに異なる塩基配列を有している。一方、測定対象のＤＮＡを蛍光体で修飾しておく。複数の試料の場合には、異なる色の蛍光体を修飾する。試料をマイクロアレイ１７１上に流すと、各検出点１３１上のＤＮＡと相補的な塩基配列を持つ蛍光標識ＤＮＡがハイブリダイゼーションし、検出点１３１に固定化される。非特異吸着したＤＮＡを洗い流した後、励起光１０２をビームエキスパンダー１７２で光束を拡大し、複数の検出点１３１に照射し、蛍光１０３の色と蛍光信号をカラーカメラ１２０で検出する。ピンホールアレイ１０４１は、一度に測定する検出点１３１の結像位置にそれぞれ穴を有し、受光素子１２１の直前に設置する。

図９Ｃは、本実施例におけるカラーカメラ及びカラーカメラ上のスポットを示す図である。受光素子１２１上での複数のスポット１２７が互いに重ならないように配置されている。一度の測定で複数の検出点１３１が同時に測定できるため、スループットが向上する。複数の色の判別ができる複数の試料を同時に測定可能なため、試料間での定量的な比較ができるという効果もある。試料をＸＹステージ等の可動式の台に保持すれば、より多くの検出点１３１をスキャン可能になり、測定の効率が向上する。ＤＮＡマイクロアレイに限らず、２次元にアレイ化された試料で複数の蛍光を識別する用途であればよく、例えばサザンブロッティング法やリアルタイムシーケンサ（Ｅｉｄ ｅｔ． ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２３、１３３、２００９）などに応用が可能である。

［第６実施例］
本実施例ではカラーカメラ１２０にステージ（位置調整機構）４００を設けることを特徴とする。これにより、ピンホールアレイ１０４１とカラーカメラ１２０の位置合わせを簡便にするメリットがある。図１０は、本実施例の構成の例である。ステージ４００は、カラーカメラ１２０をＸＹＺ軸に動かすように構成されている。ステージ４００以外の構成は第２実施例と同じである。ＸＹＺ軸の定義は図１０に図示されている。Ｙ軸は紙面に垂直である。

以下、ステージ４００を用いたピンホールアレイ１０４１とカラーカメラ１２０の位置合わせ方法を説明する。ピンホールアレイ１０４１はチューブレンズ１０６の焦点位置に置かれ、カラーカメラ１２０は前記焦点位置から離れた位置にある。本実施例の位置調整では、まず、ピンホールアレイ１０４１を取り除いた状態で行う。検出点１３１からの蛍光１０３をカラーカメラ１２０で検出しながら、スポット１２７が最も小さくかつ信号強度の高い位置にステージ４００のＺ軸を動かしながら合わせる。このときの受光素子１２１の位置が前記焦点位置である。このとき、スポット１２７のサイズから光学系１０１の結像倍率が設計通りであることを確認する。本実施例では電気泳動チップ１３０の流路Ｄ（１３４ｄ）間の距離から規定されるスポット１２７間の距離を利用する。

本実施例では結像倍率は１倍なので、２つのスポット１２７間の距離が上記流路Ｄ（１３４ｄ）間の幅と同じになるまで、対物レンズ１１０の位置と上記カラーカメラ１２０位置の調整を繰り返す。その後、Ｚ軸でカラーカメラ１２０の位置を動かして受光素子１２１上のスポット１２７の大きさが第１実施例で規定する範囲に収まるように調整する。結像位置にはピンホールアレイ１０４１を置く。ピンホールアレイ１０４１の位置は、受光素子１２１上の水のラマン散乱光のスポット１２７の強度が最も大きくなるように調整して決められる。ピンホールアレイ１０４１の位置が決まったら、ステージ４００のＸＹ軸を動かして、ピンホールアレイ１０４１位置に対するカラーカメラ１２０の位置を調整し、カラーカメラ１２０の位置を決定する。ＸＹ軸の調整については機械精度で合わせることも可能であり、その場合はＸＹ軸のステージは不要である。特にカラーカメラ１２０のＸＹ軸方向の位置はスポット１２７が受光素子１２１に収まっていれば任意であり、微細な調整は不要である。これは本発明のその他の効果である。

上記の作業により、ピンホールアレイ１０４１とカラーカメラ１２０の位置を簡便に合わせることができる。検出点１３１からの光には、水のラマン散乱光を用いたが、蛍光体が含まれる標準試料やその他の発光試薬でも構わない。上記倍率調整には、予め距離や寸法の分かっている発光像であれば、何を用いても構わない。

以上のように、本発明は、共焦点光学系におけるピンホールを通った光を、焦点位置から外れた位置に設けられたカラーカメラで受光し、色毎の光量を測定することを特徴とする。共焦点光学系を採用することで、チップ材料からの自家蛍光を低減させ、かつ単板のカラーカメラで検出することによって安価で小型な蛍光検出装置を提供することができる。検出器上であえてぼかした像として蛍光を検出することで、各色の画素が複数含まれるようになり、色の判定精度が向上する。複数の検出点が存在する場合でも、光学系の構成を変えずに同時検出が可能になる。

なお、本発明は上述した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上述した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることがあり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

また、制御部１４０の各構成、機能、処理部等は、それらの一部や全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。また、制御部１４０の各構成、機能、処理部等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリやハードディスク、ＳＳＤ（Solid State Drive）等の記憶装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くことができる。

また、上述の実施例において制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には殆ど全ての構成が相互に接続されていると考えてもよい。

１０１…光学系、 １０２…励起光、 １０３…蛍光
１０４…ピンホール、 １０４１…ピンホールアレイ
１０５…光源、 １０６…チューブレンズ、 １０７…励起光用集光レンズ
１０８…励起光カットフィルタ、 １１０…対物レンズ、 １２０…カラーカメラ
１２１…受光素子、 １２２、１２３、１２４、１２５…画素
１２６…画素群、 １２７…スポット、 １３０…チップ、 １３１…検出点
１３２ａ、１３２ｂ、１３２ｃ、１３２ｄ…電極
１３３ａ、１３３ｂ、１３３ｃ、１３３ｄ…ウェル
１３４ａ、１３４ｂ、１３４ｃ、１３４ｄ…流路
１３５ａ…チップ本体、 １３５ｂ…チップフィルム、 １３６…電源
１３７…断熱シート、１３８…検出窪み、 １３９…交差部
１４０…制御部、 １５０…温調部
１６１…マイクロレンズ、 １６２…マイクロシリンドリカルレンズ
１７１…マイクロアレイ、 １７２…ビームエキスパンダー
４００…ステージ

Claims (13)

1. 基板に保持された少なくとも１つの測定対象からの光を集光するレンズと、
   前記光を測定する受光器と、
   前記受光器と前記レンズの間で前記受光素子に対面し、前記レンズの焦点位置に配置された遮光板と、を備え、
   前記遮光板は、少なくとも１つのピンホールを有し、前記受光器は、前記レンズの焦点から外れた位置に配置された単板の受光素子を備え、前記単板の受光素子には、複数の色の画素を１単位とする画素群が複数個配列されており、前記受光器は、前記ピンホールを通った前記光を前記受光素子によって受光することを特徴とする蛍光検出装置。
2. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
   前記受光素子上の光束の大きさが４×４画素以上であることを特徴とする蛍光検出装置。
3. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
   前記受光素子上の光束の大きさが８×８画素以上であることを特徴とする蛍光検出装置。
4. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
   前記受光素子上の光束の大きさが２０×２０画素以下であることを特徴とする蛍光検出装置。
5. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
   前記基板は、シクロオレフィン系樹脂またはポリメタクリルメタクリレート樹脂の本体と、前記樹脂のフィルムとから構成されていることを特徴とする蛍光検出装置。
6. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
   前記基板は、本体とフィルムとから構成され、前記本体は溝を有し、前記本体と前記フィルムとを張り合わせることにより少なくとも１つの流路が形成されていることを特徴とする蛍光検出装置。
7. 請求項６に記載の蛍光検出装置において、
   前記基板は複数の前記流路を備え、前記遮光板は複数の前記ピンホールを有し、前記複数の流路の間の間隔は前記受光器上の光束の直径より大きくなっており、前記受光器は、前記複数の流路上の複数の測定対象からの光を同時に測定することを特徴とする蛍光検出装置。
8. 請求項６に記載の蛍光検出装置において、
   前記基板は複数の前記流路を備え、前記遮光板は複数の前記ピンホールを有し、前記複数の流路の測定対象位置は、流路方向に交互にずらして配置されており、前記受光器は、前記複数の流路上の複数の測定対象からの光を同時に測定することを特徴とする蛍光検出装置。
9. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
   前記ピンホールと前記受光器との間にレンズ、シリンドリカルレンズまたはロッドレンズを更に備えること特徴とする蛍光検出装置。
10. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
    前記基板上に複数の測定対象が２次元に格子状に配置されており、前記遮光板は、２次元に格子状に配置された複数のピンホールを有すること特徴とする蛍光検出装置。
11. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
    前記受光素子上の光束に含まれる各色の画素の積算値または平均値を算出する制御部を更に備えることを特徴とする蛍光検出装置。
12. 請求項１に記載の蛍光検出装置において、
    前記受光器の位置を調整する位置調整機構を更に備えることを特徴とする蛍光検出装置。
13. レンズによって、基板に保持された少なくとも１つの測定対象からの光を集光するステップと、
    少なくとも１つのピンホールを有し、前記レンズの焦点位置に配置された遮光板によって、前記光を遮光するステップと、
    前記レンズの焦点から外れた位置に配置された単板の受光素子を備える受光器を用いて、前記ピンホールを通った前記光を前記受光素子によって受光するステップであって、前記単板の受光素子には、複数の色の画素を１単位とする画素群が複数個配列されている、ステップと、
    を含む蛍光検出方法。

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