JP4408906B2

JP4408906B2 - キャピラリ電気泳動装置

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Publication number: JP4408906B2
Application number: JP2007053660A
Authority: JP
Inventors: 良仁伊名波; 基博山▲崎▼; 智広庄司; 剛大浦; 誉人五味
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2007-03-05
Filing date: 2007-03-05
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2027-03-05
Also published as: US8262888B2; US20080217177A1; JP2008216029A

Description

本発明は、核酸やタンパク質等を電気泳動により分離分析する技術に関し、例えばキャピラリ電気泳動装置に関する。

特許文献１には、キャピラリ電気泳動装置が開示されている。このキャピラリ電気泳動装置では、ＤＮＡの塩基配列および塩基長の決定等と目的として、石英管およびそれを覆うポリマ被覆からなるキャピラリを用いた電気泳動法が用いられている。石英キャピラリ中のポリアクリルアミド等の分離媒体に測定対象であるＤＮＡを含む試料を注入して、キャピラリの両端部に電圧を印加する。試料中のＤＮＡ合成物はキャピラリ内を移動し、分子量の大きさ等によって分離されキャピラリ内にＤＮＡバンドを生じる。各ＤＮＡバンドには蛍光色素が加えられており、レーザ光の照射によって発色し、これを蛍光計測手段で読み取り、ＤＮＡの配列を決定する。蛋白質の分離・分析も同様に行って、蛋白質の構成を調べることができる。

特許文献１に開示されているキャピラリ電気泳動装置におけるサンプルへの光照射方式は以下のようなものである。すなわち、平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの一方あるいは両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、レーザ光が隣接するキャピラリに順次に伝搬してキャピラリアレイを横断するものである。また、蛍光検出方式は以下のようなものである。すなわち、キャピラリアレイ上のレーザ光照射部の像を、集光レンズ、透過型回折格子、結像レンズを通して、２次元ＣＣＤ上に結像する。

平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの一方あるいは両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、レーザ光が隣接するキャピラリに順次に伝搬してキャピラリアレイを横断する方式においては、レーザ光のフォーカスポイントを両端のキャピラリにあわせるとレーザ光を効率良くキャピラリアレイに結合できる。また、レーザ光が複数のキャピラリを伝搬する過程において、石英／空気の屈折率差に基づいてキャピラリ外径においてレーザ光の反射ロスが生じる。したがって、片側からレーザ光を照射する場合には、複数のキャピラリでの照射光強度は一様にはならない。キャピラリアレイ内の強度ばらつきを小さくするためには、一般的には、キャピラリアレイの両側からレーザ光が照射される。また、キャピラリ管内には分離媒体が存在するために、分離媒体の屈折率にあわせて、レーザ光がキャピラリからキャピラリに伝搬する効率を最大化するようにキャピラリの内径／外径などが定められる。

特開２００４−１４４４７９号公報

上記の従来のキャピラリ電気泳動装置には、以下に示す通り分離媒体であるゲルを無駄に消費してしまうという問題がある。例えば、１６本のキャピラリ電気泳動装置において、６個のサンプルを測定すると仮定する。キャピラリ内が空気で満たされていると、キャピラリ管内に分離媒体が満たされている場合に比べて、キャピラリ管内の屈折率が小さくなるために励起照射光がキャピラリからキャピラリへと伝搬する効率が低下する。そのために、サンプル数が６個であるにもかかわらず、１６本すべてのキャピラリに分離媒体を注入する必要があり、ランニングコストの上昇をもたらすという問題が存在する。

キャピラリが独立に脱着可能な２つのキャピラリアレイから構成され、それぞれが８本のキャピラリを有し、６個のサンプルを測定する場合には一方のキャピラリアレイを取り外すことができるシステムによって、分離媒体の消費量を浪費するという上記問題を解決することができる。しかしながら、この場合には、別の問題が発生する。２つのキャピラリアレイがともに片側照射である場合には、キャピラリ間の信号強度ばらつきが大きくなる。２つのキャピラリアレイの両側から励起照射光を照射する場合には、キャピラリアレイのいずれか一方を取り外した場合に、光のフォーカスポイントにキャピラリが存在しなくなるため、キャピラリアレイへの励起照射光の結合効率が低下するという問題が発生する。

本発明はこのような状況に鑑みてなされたもので、２^ｎ本（ｎは正の整数）のキャピラリアレイを装着可能なキャピラリ電気泳動装置であって、キャピラリアレイのいずれか一方を取り外した場合でもキャピラリアレイへの励起照射光の結合効率が低下しないキャピラリ電気泳動装置を提供することを目的とするものである。

本発明のキャピラリ電気泳動装置は、片側から励起光を照射する２^ｎ本（ｎは正の整数）のキャピラリアレイの各々のキャピラリアレイのキャピラリから発生する発光を、１つの検出光学系によって検出するようにした。

本発明によれば、２^ｎ本（ｎは正の整数）のキャピラリアレイを装着可能なキャピラリ電気泳動装置であって、キャピラリアレイのいずれか一方を取り外した場合でもキャピラリアレイへの励起照射光の結合効率が低下しないキャピラリ電気泳動装置が実現される。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と利益を、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

図１（ａ）に、本発明のキャピラリ電気泳動装置の概略図を示す。本実施例におけるキャピラリ電気泳動装置（以下、「本装置」）は、泳動媒体が充填された複数本のキャピラリを用い、各キャピラリに試料を導入し、試料中の試料成分を電気泳動分離し、分析する。本装置の基本的構成は、キャピラリアレイ、照射光学ユニット、検出光学ユニット、オートサンプラユニット、泳動媒体充填ユニット、電源ユニット、及び温度制御ユニットである。

キャピラリアレイ１０１は、複数本のキャピラリ１０２より構成される着脱可能な交換部材であり、所定回数の分析により品質が劣化し、分離能が低下した際に、新品に交換される。また、測定手法を変更する場合、キャピラリ１０２の長さが異なるキャピラリアレイ１０１に交換することにより、キャピラリ１０２の長さを調節できる。キャピラリアレイ１０１は、試料をキャピラリ１０２内に導入する試料導入部１０４、泳動分離された試料に励起光を照射する照射部１０３、キャピラリを束ねるキャピラリヘッド１０７を有する。

キャピラリ１０２は、内径数十〜数百ミクロン、外形数百ミクロンの細管であり、強度を向上させるために表面がコーティングされている。キャピラリ１０２の内部に泳動媒体を充填することにより、泳動路を形成する。泳動路の両端に電圧を印加することにより、試料を電気泳動分離できる。

本実施例では、外表面をポリイミドコーティングした、全長４７ｃｍ、外径３６３μｍ、内径５０μｍの石英バイプをキャピラリ１０２として用いる。尚、試料導入部１０４から約３６ｃｍ離れた照射部１０３では、キャピラリ１０２内の試料に、励起光を効率的に照射する為に、ポリイミド被膜が除去されている。このキャピラリ１０２を８本束ねて、キャピラリアレイ１０１を構成している。尚、キャピラリ１０２の本数は、８本に限定されず、例えば、２本、８本、１６本、９６本、１９２本、３８４本等でも良い。また、必要に応じ、キャピラリ１０２をポリイミド以外の樹脂によりコーティングしても良い。

試料導入部１０４は、キャピラリ１０２の試料導入端１０５を、サンプル容器のウェルに合わせて配置しており、各ウェルに保持された複数の試料を泳動路に導入できる。

本実施例では、キャピラリ１０２の先端を中空電極に挿入して試料導入端１０５を形成し、試料導入部１０４を構成している。試料導入端１０５において、キャピラリ１０２の先端は、中空電極から少し突出した状態となっている。ステンレス製パイプから構成される中空電極は、高圧電源に電気的に接続されている。試料導入端１０５を試料に浸し、電圧を印加することにより、試料を電気泳動し、キャピラリ内に導入できる。尚、試料導入の方法は、電気泳動に限定されず、圧力や分注により試料を泳動路に導入してもよい。

照射部１０３は、励起光を、キャピラリ１０２に充填された泳動媒体に照射する箇所であり、電気泳動分離された試料成分に励起光を照射することができる。試料成分に標識された蛍光体は、試料成分に依存した波長の光を放出する。

キャピラリ電気泳動装置の光学系は、光源と、光照射部１０３を含む検出部１１８と、検出部から生じる蛍光を検出する検出機構から構成される。光源は、コヒーレント光であるレーザ光１０９（アルゴンイオンレーザからの４８８.０ｎｍおよび５１４.５ｎｍの光）を発振する。検出部１１８には、レーザ光１０９がキャピラリを透過する個所である光照射部１０３が並列配置されている。そして、複数本のキャピラリの光照射部１０３を同時に貫くように、検出部１１８にレーザ光１０９が上下両方向から照射される。このレーザ光１０９が検査試料を励起して、検査試料から蛍光が放出される。この蛍光を、ＣＣＤ２０４を含む検出機構（図２）により検出して、ＤＮＡ分子配列等の検査試料に依存した情報を取得できる。

照射部１０３には、例えば、図１（ｂ）に示すような励起光照射手段によって励起光を照射する。レーザ光源１７０から発生されたレーザ光はビームスプリッタ１７１によって２分割され、２分割された２本のレーザ光１０９は反射ミラー１７２で反射されて、互いに逆方向から各々のキャピラリアレイに入射する。レーザ光１０９はレーザ集光レンズ１７３によって集光され、キャピラリアレイにおける照射部１０３に、各々のキャピラリアレイの片側から照射される。各々のキャピラリアレイを通過したレーザ光１０９は、レーザ光遮断部３１１に当たる。

[実施例１]
図２（ａ）に、実施例１におけるキャピラリアレイ中の検査試料からの蛍光の検出機構と、光照射部１０３を示す。検出機構は、蛍光集光レンズ２０１、光学フィルタ２０９、グレーティング２０２、フォーカスレンズ２０３、及びＣＣＤ２０４から構成される。光照射部１０３にレーザ光１０９が照射されることで生じる、キャピラリ１０２中の検査試料からの蛍光２０５は、光学フィルタ２０９を通過して励起光が除去された後、蛍光集光レンズ２０１によってほぼ平行光２０６となり、グレーティング２０２によって分光され、フォーカスレンズ２０３によってＣＣＤ２０４上に結像される。図２（ｂ）にＣＣＤ上の像の様子を示す。Ｙ軸方向に１６本のキャピラリ像が並び、Ｘ軸方向に各キャピラリからの発光２０８が分光される。

キャピラリヘッド１０７は、８本のキャピラリを束ねて保持し、装置本体と着脱することができる。キャピラリヘッド１０７は、ポリマ充填ブロック１５２に耐圧気密で接続できる。そして、泳動媒体充填ユニットにより、終端部１０８より、キャピラリ１０２内に、新しい泳動媒体を充填することができる。

オートサンプラユニットは、サンプル容器をはじめとする電気泳動分析に用いる各容器を、試料導入部１０４の直下等の所定位置に搬送し、保持する機構である。本実施例のオートサンプラユニットは、爪を備えたロボットアームにより、サンプル容器、バッファ容器、洗浄容器、及び廃液容器を搬送する。

ロボットアームは、各容器をその上に固定する爪を備え、３次元的に移動できる。これにより、所定の場所に保管されている各容器を、試料導入部１０４の直下に搬送し、その場所にて各容器を所定時間保持し、所定の場所に返却できる。

バッファ容器は、試料導入端１０５を浸す緩衝液を保持する容器である。泳動分析時、緩衝液が試料導入端１０５を浸すように、バッファ容器は試料導入部１０４の直下に搬送される。また、装置待機中も、泳動分析時と同様に搬送され、試料導入端１０５を緩衝液に浸し、キャピラリ１０２内の泳動媒体の乾燥を防止している。

洗浄容器は、試料導入端１０５を洗浄する洗浄液を保持する容器であり、泳動媒体充填、予備泳動、及び試料導入の後に試料導入部１０４の直下に搬送される。試料導入端１０５を、洗浄容器中の洗浄液に浸すことにより、試料導入端１０５を洗浄し、コンタミネーションを回避できる。

廃液容器は、使用済の泳動媒体を保持する容器であり、泳動媒体充填時に試料導入部１０４の直下に搬送され、泳動媒体充填時に試料導入端１０４から排出される使用済の泳動媒体を受け止める。

サンプル容器は、複数の微量試料を保持する容器であり、試料導入時に試料導入部１０４の直下に搬送される。本実施例では、数１０μｌの試料を保持できるウェルを２４行１６列備えたサンプルプレートに、樹脂製のシートであるセプタを乗せ、それをホルダとクリップで挟むことにより、サンプル容器を構成している。試料としては、例えば、４種類のヌクレオシド塩基分子を識別するように蛍光標識され、多数の適当な長さ（大きさ）の核酸を含む溶液である。セプタは、ウェルに対応する位置に通常は密閉状態の貫通孔を有しており、ウェル中の試料の蒸発を防止しつつ、試料導入時に試料導入端１０５と試料の接触を可能としている。また、セプタ上面に保護フィルムを貼り付け、試料蒸発を防止することもできる。また、ホルダとクリップは、その間にサンプルプレートやセプタを挟み、一体化することにより、ロボットアームにて搬送可能なサンプル容器を形成する。

泳動媒体充填ユニットは、泳動媒体であるポリマをキャピラリ１０２内に充填する機構である。本実施例の泳動媒体充填ユニットは、ポリマ充填ブロック１５２、シリンジ１５３、チューブ１５５、電磁弁１５６とを含み、分析開始前に新しい泳動媒体をキャピラリ１０２内に自動的に充填できる。

ポリマ充填ブロック１５２は、ポリマ流路１５４を有し、シリンジ１５３とチューブ１５５に接続し、キャピラリヘッド１０７を着脱できる。キャピラリヘッド１０７は、耐圧気密を維持しながらポリマ充填ブロック１５２に装着される。ポリマ流路１５４は、泳動媒体により満たされたシリンジ１５３と、電磁弁１５６を備えたチューブ１５５と連通している。チューブ１５５の他端は、陽極バッファ容器１６３に保持された緩衝液に浸されている。

キャピラリ１０２内に泳動媒体を充填する際には、試料導入部１０４の直下に廃液容器を配置し、電磁弁１５６を閉じ、シリンジ１５３のプランジャを押す。これにより、シリンジ１５３内の泳動媒体が、ポリマ流路１５４を経由して、終端部１０８からキャピラリ１０２内に流入する。また、キャピラリ１０２内の使用済泳動媒体は、試料導入端１０５から排出され、廃液容器にて受け止められる。

電源ユニットは、キャピラリ１０２内の泳動媒体から構成される泳動路に電圧を印加する機構であり、試料を電気泳動できる。本実施例の電源ユニットは、試料導入部１０４の中空電極と陽極電極１６４に電気的接続され、１５ｋＶ前後の高電圧を発生できる高圧電源を含む。

試料導入時は、キャピラリ１０２、ポリマ流路１５４及びチューブ１５５の内部を泳動媒体で満たし、サンプル容器のウェルに保持された試料に試料導入端１０５を浸し、電磁弁１５６を開く。これにより、試料導入部１０４の中空電極、ウェル中の試料、キャピラリ１０２、ポリマ流路１５４、チューブ１５５、陽極バッファ容器１６３内の緩衝液、及び陽極電極１６４からなる通電路が形成される。そして、試料導入部１０４の中空電極を負電位、陽極電極１６４を正電位として、この通電路にパルス電圧を印加する。これにより、ウェル内に存在する負に帯電する試料成分、例えばＤＮＡが、試料導入端１０５から泳動路に導入される。

また、泳動分析時は、試料導入時と異なり、バッファ容器に保持された緩衝液に試料導入端１０５を浸す。これにより、試料導入部１０４の中空電極、バッファ溶液中の緩衝液、キャピラリ１０２、ポリマ流路１５４、チューブ１５５、陽極バッファ容器１６３内の緩衝液、及び陽極電極１６４からなる通電路が形成される。そして、試料導入時と異なり、１５ｋＶ前後の高電圧を印加する。これにより、照射部１０３から試料導入部１０４の方向に電界が生じ、泳動路に導入された負に帯電する試料成分が、照射部１０３の方向に電気泳動する。

温度制御ユニットは、試料成分の泳動速度に影響を与える泳動路の温度を制御する機構である。本実施例における温度制御ユニットは、恒温槽１３０内にキャピラリ１０２を収容する。そして、ペルチェ等の温度制御機構により一定温度に保たれた空気を、ファン等の送風機構により恒温槽内を循環させ、キャピラリ１０２を所定温度に保つ。

以下、電気泳動分析の基本的手順について説明する。電気泳動分析の基本的手順は、事前準備、泳動媒体充填、予備泳動、試料導入、及び泳動分析に大別できる。本装置のオペレータは、分析開始前の事前準備として、試料や試薬を本装置にセットする。より具体的には、まず、バッファ容器と陽極バッファ容器１６３に、通電路の一部を形成する緩衝液を満たす。緩衝液は、例えば、各社から電気泳動用として市販されている電解質液であるである。

また、サンプル容器のウェル内に、分析対象である試料を分注する。試料は、例えば、ＤＮＡのＰＣＲ（Polymerase chain reaction）産物である。また、洗浄容器に、試料導入部１０４を洗浄する為の洗浄溶液を分注する。洗浄溶液は、例えば、純水である。また、シリンジ１５３内に、試料を電気泳動する為の分離媒体を注入する。泳動媒体は、例えば各社から電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲルであるである。さらに、キャピラリ１０２の劣化が予想される場合や、キャピラリ１０２の長さを変更する場合、キャピラリアレイ１０１を交換する。そして、事前準備が完了した後、オペレータは本装置を操作して、分析を開始する。

まず、泳動媒体充填を行う。これは、キャピラリ１０２内に新しい泳動媒体を充填し、泳動路を形成する手順である。本実施例における泳動媒体充填では、まず、オートサンプラユニットにより廃液溶液を試料導入部１０４の直下に運び、試料導入端１０５から排出される使用済の泳動媒体を受け止められるようにする。そして、シリンジ１５３を駆動して、キャピラリ１０２内に新しい泳動媒体を充填し、使用済の泳動媒体を廃棄する。最後に、洗浄容器内の洗浄溶液に試料導入端１０５を浸し、泳動媒体により汚れた試料導入端１０５を洗浄する。

次に予備泳動を行う。これは、泳動媒体に所定の電圧を印加し、泳動媒体を電気泳動に適した状態にする手順である。本実施例における予備泳動では、まず、オートサンプラユニットにより、バッファ容器内の緩衝液に試料導入端１０５を浸し、通電路を形成する。そして、電源ユニットにより、泳動媒体に数〜数十キロボルト程度の電圧を数〜数十分間加え、泳動媒体を電気泳動に適した状態とする。最後に、洗浄容器内の洗浄溶液に試料導入端１０５を浸し、緩衝液により汚れた試料導入端１０５を洗浄する。

次に試料導入を行う。これは、試料成分を泳動路に導入する手順である。本実施例における試料導入では、まず、オートサンプラユニットにより、サンプル容器のウェル内に保持された試料に試料導入端１０５を浸す。これにより、通電路が形成され、泳動路に試料成分を導入することが状態となる。そして、電源ユニットによりパルス電圧を通電路に印加し、泳動路に試料成分を導入する。最後に、洗浄容器内の洗浄溶液に試料導入端１０５を浸し、試料により汚れた試料導入端１０５を洗浄する。

次に泳動分析を行う。これは、電気泳動により、試料中に含まれる各試料成分を分離分析する手順である。本実施例における泳動分析では、まず、オートサンプラユニットにより、バッファ容器内の緩衝液に試料導入端１０５を浸し、通電路を形成する。そして、電源ユニットにより、通電路に１５ｋＶ前後の高電圧を印加し、泳動路に電界を発生させる。発生した電界により、泳動路内の各試料成分は、各試料成分の性質に依存した速度で照射部１０３へ移動する。つまり、試料成分は、その移動速度の差により分離される。そして、照射部１０３に到達した試料成分から順番に検出される。例えば、試料が、塩基長の異なるＤＮＡを多数含む場合は、その塩基長により移動速度に差が生じ、塩基長の短いＤＮＡから順に照射部１０３に到達する。各ＤＮＡに、その末端塩基配列に依存した蛍光物質を取り付けておけば、照射部１０３に到達した順に、その末端塩基配列を検出できる。そして、予定していたデータを取り終えたら電圧印加を停止し、泳動分析を終了する。
以上が、一連の分析手順である。さらに分析を実施する場合は、泳動媒体充填から分析手順を進める。

以下、図３を参照して、本実施例の特徴的機構である光照射・検出について説明する。図３（ａ）は光照射・検出機構を示す正面図、図３（ｂ）は側面図である。本実施例では、８本のキャピラリ３０１をガラス基板３０２上に配列する。ガラス基板３０２上では、ガラス基板３０２に実質的に平行に配列されている。また、各々のキャピラリ３０１におけるポリイミド皮膜３０３の除去部分３０４が、一直線上に配列されている。

キャピラリアレイＡ３０５は、集光レンズ光軸３０６に対して上に位置するように設置される。キャピラリアレイＢ３０７は、集光レンズ光軸３０６に対して下に位置するように設置される。２つのキャピラリアレイの位置関係は、本実施例に示すようにレンズ光軸３０６の上下に限定されるわけではなく、レンズ光軸３０６に対してほぼ対称の位置にあればよく、例えば、レンズ光軸３０６の左右に位置する関係であってもよい。

キャピラリアレイＡ３０５のキャピラリの上側の端のキャピラリ３０８にレーザ光３０９Ａを照射し、レーザ光３０９Ａは、隣接するキャピラリに順次に伝搬してキャピラリＡ３０５の８本のキャピラリアレイを横断する。８本目のキャピラリ３１０を横断したレーザ光３０９Ａはレーザ光遮断部３１１にあたり、レーザ光３０９ＡはキャピラリアレイＢ３０７のキャピラリには伝搬しない。

キャピラリアレイＢ３０７のキャピラリの下側の端のキャピラリ３１２にレーザ光３０９Ｂを照射し、レーザ光３０９Ｂは、隣接するキャピラリに順次に伝搬してキャピラリＢ３０７の８本のキャピラリアレイを横断する。８本目のキャピラリ３１３を横断したレーザ光３０９Ｂは同様にレーザ光遮断部３１１にあたり、レーザ光３０９ＢはキャピラリアレイＡ３０７のキャピラリには伝搬しない。

本実施例でのレーザ光遮断部３１１は、表面を黒化還元処理した銅を用いた。レーザ光遮断部３１１の材質・表面処理は、特にこれに限るわけではなく、ここに当たるレーザ光が検出系の迷光とならないように、レーザ光を吸収し、レーザ光の散乱を最小化することがレーザ光遮断部の材質・表面処理に求められる課題である。しかも、レーザ光の反射特性が経時変化しないことが望ましい。このような条件を満たすものが、レーザ光遮断部の材料として利用できる。例えば、表面を黒化処理した銅でもよいし、黒色アルマイト化したアルミニウムでもよい。また、図３（ｃ）に示した通り、レーザ光がキャピラリの方向に反射することを防止するために、レーザ光遮断部３１１にレーザ光が垂直にあたらないように、レーザ光遮断部に斜面を形成した。

キャピラリ外径３６３μｍ、石英外径３２３μｍ、石英内径５０μｍであり、管内には屈折率１．４１の分離媒体が注入されている。励起レーザ光がキャピラリを次から次へと伝搬する過程において、石英／空気の屈折率差に基づいてキャピラリ外径においてレーザ光の反射ロスが生じる。したがって、キャピラリアレイＡ３０５での８本のキャピラリの照射光強度分布は図４のようになる。片側照射なので照射光強度は一様ではない。キャピラリアレイの８本のキャピラリ内における信号強度ばらつき（標準偏差／平均値）は、０．１９であり、ばらつきが大きい。

図２に示した蛍光検出系におけるレンズ光軸２２０−キャピラリ間距離と集光効率の関係を図５に示す。このように、キャピラリとレンズ光軸２２０の距離が大きくなるに従って、光検出手段であるＣＣＤ２０４に到達する信号強度が小さくなる。キャピラリがレンズ光軸２２０から離れるに従って、蛍光のＣＣＤへの伝搬角度２２１が大きくなり、レンズ系における「ケラレ」となって、ＣＣＤに到達しないロスとなるためである。

ここで、２つのキャピラリアレイＡ、Ｂそれぞれのうち、もっともレンズ光軸３０６に近いキャピラリ３１０、３１３の間の距離をアレイ間距離と定義する（本実施例では、レンズ光軸３０６とレンズ光軸に最も近いキャピラリ３１０、３１３の距離の２倍になる）。

ＣＣＤ上に結像され、検出される各キャピラリの信号光強度は、励起光照射強度と集光効率の積であり、図５のようになる。図５（ａ）は、アレイ間距離が２ｍｍの場合である。キャピラリアレイＡの８本のキャピラリ内におけるｍｉｎ信号強度／ｍａｘ信号強度比は、０．７２であり、上記０．６１に比べて大幅に改善する。

図５（ｂ）は、キャピラリアレイＡ、Ｂそれぞれの、レンズ光軸にもっとも近いキャピラリとレンズ光軸の距離が２ｍｍの場合である。キャピラリアレイの１６本のキャピラリ内における信号強度ばらつき（標準偏差／平均値）は、０．１３であり、上記の場合に比べて大幅に改善する。

残りのもう一方のキャピラリについても信号強度は同様になる結果、キャピラリアレイ２本がセットされた状態での１６本のキャピラリの信号強度は、図４のようにほぼ一様になる。

図６に示したとおり、１６本キャピラリの信号強度のばらつき（標準偏差／平均値）については、アレイ間距離の最適値が存在し、アレイ間距離６ｍｍで最小値をとる。一方、１６本キャピラリの信号強度の平均値は、アレイ間距離が大きくなるに従って小さくなる。また、１つのＣＣＤで２つのアレイを同時検出する場合には、アレイ間距離が大きくなるに従って、大きなＣＣＤが必要となり、装置コストが大きくなるというデメリットが発生する。１６本キャピラリの信号強度のばらつき（標準偏差／平均値）、平均値、および装置コストを考慮して、アレイ間距離を決定する。本実施例においては、１６本キャピラリの信号強度のばらつき（標準偏差／平均値）が０．１以下であることを装置の仕様とし、アレイ間距離を４ｍｍとした。１６本のキャピラリ像は、キャピラリ配列方向で約１０ｍｍ（配列ピッチ３７０μｍ×１６＋４ｍｍ）となり、これをカバーするＣＣＤを用いる。

本実施例との比較例として、図７に示したように、それぞれ８本のキャピラリから構成されるキャピラリアレイＡ、Ｂが独立に脱着できるシステムにおいて、２本の励起照射光がキャピラリアレイＡ、Ｂを両側から照射し、それぞれの励起照射光が１６本のキャピラリを貫通するシステムを検討する（２アレイ両側貫通照射方式）。また、２つのレーザ光の一方が、キャピラリアレイＡを、もう一方のレーザ光が、キャピラリアレイＢをそれぞれ片側照射し、レンズ光軸とキャピラリアレイの位置関係を考慮したシステムを検討する。

第１のポイントは、信号強度である。２アレイ両側貫通照射は、レーザ光を１６本貫通させるので最も信号強度を大きくできる。第２のポイントは信号強度ばらつきである。片側照射では、キャピラリアレイとレンズ光軸の位置関係によっては、信号強度ばらつきが大きくなる。

第３のポイントは、１アレイ時の信号雑音比である。２アレイ両側貫通照射のキャピラリ断面における励起照射光のビーム幅について、図３と図８を使って詳細に説明する。特許文献１に記載されている通り、励起照射光を効率よくキャピラリアレイに伝搬させるためには、励起照射光３０９Ａをレンズで絞ってその焦点を第１キャピラリ３０８にあわせるのが望ましい（図８（ａ））。したがって、キャピラリアレイＡ３０５の第１キャピラリ３０８とキャピラリアレイＢ３０７の第１キャピラリ３１２にフォーカス位置を合わせる。キャピラリの断面を含む平面で見た場合に、キャピラリのレンズ効果によって励起照射光の幅は、収束・発散を繰り返しながら、キャピラリアレイを伝搬する。ここで、キャピラリアレイＢ３０７を装置から取り外すと（図８（ｂ））、キャピラリアレイＢ３０７のレンズ効果がなくなり、下からの励起照射光３０９Ｂのビーム径は、キャピラリアレイＡ３０５の第８キャピラリ３１０到達時点で大きくなってしまう。キャピラリ入射時に励起照射光が十分に絞られておらず、キャピラリの中心軸から離れた点に励起光が照射されると、その励起光はキャピラリ内径内を通りにくく、信号発生に大きくは寄与しない。その一方で、この励起光はノイズ発生源である散乱には寄与する。従って、１６本両側貫通照射では、一方のキャピラリアレイを取り外した場合に信号雑音比が低下するという問題が存在する。本発明においては、一方のキャピラリアレイを取り外しても、残りのキャピラリアレイの信号雑音比は低下しない。

第４のポイントは、擬似ピークである。キャピラリ軸方向における励起照射光のビーム幅について、図８（ｃ）をつかって詳細に説明する。キャピラリ軸方向についてはキャピラリのレンズ効果は無いので、図８（ｃ）に示すように、キャピラリアレイを伝搬するに従って、励起照射光の幅は大きくなる。図２に示す蛍光検出系においては、Ｙ軸上に複数のキャピラリの光照射部が配列され、回折格子の刻線はＹ軸に沿う方向であり、キャピラリからの発光はＸ軸方向に分光される。このような検出器の構成においては、図９（ａ）に示すように、電気泳動により長さごとに分離されたＤＮＡバンド９０１が、キャピラリ９０２に集光されたある幅を持った励起光９０３を通過する際に、発光点が励起光幅内を移動する効果により、発光の像がキャピラリ軸方向すなわち波長分散方向にＣＣＤ上を移動することにより、見かけ上、発光スペクトル９０４の波長が変化する。実効的に発光スペクトルの波長が励起光横断中に経時変化するのと同様の効果を与える。複数の蛍光色素を使用し、それぞれの蛍光色素が４種類の塩基と対応付けられるような電気泳動の用法においては、発光スペクトルが、見かけ上変化すると、観測した発光スペクトルを各種蛍光色素あるいは各種塩基に完全に対応させることが困難になる。すなわち、発光スペクトル成分を各種塩基に対応させる際に、対応させることができない残渣成分（擬似ピーク）を生じる。図８（ｃ）に示すように、本発明においては、両側貫通照射に比べてレーザビーム径を小さくすることができる。これにより、上記の擬似ピークを低減できる。

第５のポイントは、励起照射光の光源への戻り光問題である。特許文献１には、レーザ共振器へレーザ光が戻ることにより、レーザ光強度が不安定化する問題が提示されている。本発明は、実質的に片側照射であるから、このような問題が無いというメリットが存在する。

第６のポイントは、蛍光集光系の数である。２アレイ片側照射の構成では、２つのキャピラリアレイの像を１つの蛍光検出系で検出するようにキャピラリアレイを配置すると、２つのキャピラリアレイがメカニカルに干渉する。２つのアレイがぶつかり合わないようにするには、蛍光検出系を２つ設置せざるを得ない。

このように本実施例では、片側照射の８本キャピラリアレイを２本装着することにより、下記i〜ivを実現することができる。
i) １６キャピラリアレイシステムでありながら、８本単位でキャピラリを脱着できる。
ii) 一方のキャピラリアレイを取り外しても、残りのキャピラリアレイの信号雑音比は低下しない。
iii) 一方の８本キャピラリアレイに分離媒体を注入せず、キャピラリが空気であっても、残りの一方のキャピラリに適正に光を照射することができる。
iv) レーザ共振器へレーザ光が戻ることにより、レーザ光強度が不安定化するという問題が発生しない。
v) レーザビーム径が実質的に小さくなることにより、擬似ピークを低減できる。

以上説明したように、本発明のキャピラリ電気泳動装置では、複数の蛍光色素を各種塩基に対応させるなどの電気泳動であって、平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、レーザ光が隣接するキャピラリに次々と伝搬する光照射方式であるキャピラリ電気泳動装置において、サンプル数に応じて搭載キャピラリアレイ数を変更することができる。本発明でのレーザ照射は２ビームであるが、実質的にはキャピラリアレイへの片側照射である。一般的にレーザ光片側照射ではレーザ光の照射光強度がキャピラリアレイ内で大きくばらつくことが問題となる。レーザ光入射側で大きく、レーザ光出射側で小さくなる。２つのキャピラリアレイを別々に搭載できることと、照射強度むらの課題を同時に解決できる。また、実質的に片側照射であるから、レーザ共振器へレーザ光が戻ることによってレーザ光強度が不安定化するという問題も発生しない。

[実施例２]
別の実施例の形態を図１０（ａ）及び（ｂ）に示す。実施例２は、図２に示した実施例１の別の形態である。実施例１と異なる主な点は、i)蛍光検出系にハーフミラー１００１が存在する、ii)２つのキャピラリアレイが同一平面上になく、かつ、隣接していない、ことである。ハーフミラー１００１は、蛍光波長領域において、５０％透過、５０％反射の特性を持つ。このハーフミラー１００１は、キャピラリアレイＡ３０５から発せられる蛍光を反射してＣＣＤに導くと共に、キャピラリアレイＢ３０７から発せられる蛍光を透過してＣＣＤに導く。実施例２においては、蛍光集光レンズからＣＣＤまでの光学系は図２と同様なので、図１０では、蛍光集光レンズからＣＣＤに至る部分を省略した。また、図１０では、キャピラリアレイ取り付け部材の図示も省略した。

図１０（ｂ）において、破線楕円で示した部分は、キャピラリアレイＡ３０５のハーフミラー１００１に対する鏡像である。１００２は集光レンズ光軸のハーフミラーに対する鏡像を示し、１００３はキャピラリアレイＡのハーフミラーに対する鏡像を示し、１００４をキャピラリアレイＡに入射するレーザ光のハーフミラーに対する鏡像を示す。図１０（ｂ）からわかる通り、実施例２は、図２に示す光学系と実質的に同一である。実施例２においては、ハーフミラー１００１により、信号光である蛍光が５０％の強度に減少してしまうが、２つのキャピラリアレイを隣接して設置する必要がなく、スペース上の裕度をもって２つのキャピラリアレイ取付機構を配置することができる。また、図３にあるレーザ光遮断部を、隣接するキャピラリアレイ間の狭い場所に設置する必要がないという利点がある。この実施例２では、複数のハーフミラーを設置することにより、キャピラリアレイの数は２つに限定されず、≧３本にすることも可能である。

[実施例３]
別の実施の形態を図１１（ａ）に示す。実施例３は、図１０に示した実施例２の別の形態である。ハーフミラーではなく、回転する半円ミラーを用いる。この半円ミラーは、回転ミラー軸１１０２を回転軸として回転ミラー部１１０１が回転する構造になっている。図１１（ｂ）は、半円ミラーの平面図である。キャピラリアレイＡ３０５からの信号とキャピラリアレイＢ３０７からの信号を交互にＣＣＤ（図示せず）で取得する。その結果、信号取得時間が実施例２に比べて１／２程度になる一方で、ハーフミラーを用いないためハーフミラーによる信号蛍光の損失がないため、実施例２と同程度の信号強度を得ることができる。実施例２と同様に、２つのキャピラリアレイを隣接して設置する必要がなく、スペース上の裕度をもって２つのキャピラリアレイ取付機構を配置することができる。また、図３にあるレーザ光遮断部を、隣接するキャピラリアレイ間の狭い場所に設置する必要がないという利点がある。この実施例３では、複数の回転ミラーを設置することにより、キャピラリアレイの数は２つに限定されず、≧３本にすることも可能である。

本発明は、キャピラリ電気泳動装置に利用可能である。

（ａ）は本発明のキャピラリ電気泳動装置の概略図であり、（ｂ）は励起光照射手段の構成を示す図である。（ａ）はキャピラリアレイ中の検査試料からの蛍光の検出機構と光照射部を示す断面図であり、（ｂ）はＣＣＤ上の像の様子を示す図である。（ａ）は光照射・検出機構を示す正面図、（ｂ）は断面図、（ｃ）はレーザ光遮断部を示す断面図である。キャピラリの照射光強度分布を示すグラフである。（ａ）および（ｂ）は蛍光検出系におけるレンズ光軸−キャピラリ間距離と集光効率の関係を示すグラフである。１６本キャピラリの信号強度のばらつきおよび平均値と、アレイ間距離の関係を示すグラフである。本発明のキャピラリ電気泳動装置の実施例と比較例との比較を示す表である。（ａ）乃至（ｃ）は励起照射光のビーム幅を示す図である。（ａ）は擬似ピークを説明する図であり、（ｂ）の擬似ピークを示すグラフである。（ａ）は本発明のキャピラリ電気泳動装置の第２の実施形態の概略図であり、（ｂ）はキャピラリアレイＡのハーフミラーに対する鏡像を説明する図である。（ａ）は本発明のキャピラリ電気泳動装置の第３の実施形態の概略図であり、（ｂ）は半円ミラーを示す図である。

符号の説明

１０１キャピラリアレイ
１０２、３０１、３０８、３１０、３１２、３１３、９０２キャピラリ
１０３照射部
１０４試料導入部
１０５試料導入端
１０７キャピラリヘッド
１０８終端部
１０９レーザ光
１１８検出部
１３０恒温槽
１５２ポリマ充填ブロック
１５３シリンジ
１５４ポリマ流路
１５５チューブ
１５６電磁弁
１６３陽極バッファ容器
１６４陽極電極
１７０レーザ光源
１７１ビームスプリッタ
１７２反射ミラー
１７３レーザ集光レンズ
２０１蛍光集光レンズ
２０２グレーティング
２０３フォーカスレンズ
２０４ＣＣＤ
２０５蛍光
２０６平行光
２０８発光
２０９光学フィルタ
２２０レンズ光軸
２２１伝搬角度
３０２ガラス基板
３０３ポリイミド皮膜
３０５キャピラリアレイＡ
３０６集光レンズ光軸
３０７キャピラリアレイＢ
３０９Ａ、３０９Ｂレーザ光
３１１レーザ光遮断部
９０１ＤＮＡバンド
９０３励起光
９０４発光スペクトル
１００１ハーフミラー
１００２集光レンズ光軸のハーフミラーに対する鏡像
１００３キャピラリアレイＡのハーフミラーに対する鏡像
１００４キャピラリアレイＡに入射するレーザ光のハーフミラーに対する鏡像
１１０１回転ミラー部
１１０２回転ミラー軸

Claims

複数本のキャピラリから各々成る２^ｎ個（ｎは正の整数）のキャピラリアレイと、
前記２^ｎ個のキャピラリアレイそれぞれにおける一番端のキャピラリの照射部から該キャピラリアレイに含まれるすべてのキャピラリの照射部を通過するように励起光を照射する励起光照射手段と、
前記２^ｎ個のキャピラリアレイに含まれるキャピラリが発生する発光を検出する１個の検出光学系とを備えることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
励起光が照射される照射部が平面上に平行に配置された複数のキャピラリから各々成り、各々が含むキャピラリの照射部が平行且つ同一平面上に配置された２つのキャピラリアレイと、
前記２つのキャピラリアレイのキャピラリの照射部の間に配置された遮光手段と、
前記２つのキャピラリアレイの前記遮光手段と反対側の端に配置されたキャピラリの照射部から該キャピラリアレイに含まれるすべてのキャピラリの照射部を通過するように励起光を照射する励起光照射手段と、
前記２つのキャピラリアレイに含まれるキャピラリの照射部が配置される平面に対して垂直方向に配置され、前記２つのキャピラリアレイに含まれるキャピラリが発生する発光を検出する１個の検出光学系とを備えることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
前記遮光手段の励起光が当たる部分に斜面が形成されていることを特徴とする請求項２記載のキャピラリ電気泳動装置。
前記２つのキャピラリアレイの光照射部は、前記検出光学系の光軸を挟んで位置することを特徴とする請求項２記載のキャピラリ電気泳動装置。
複数本のキャピラリから各々成る２^ｎ個（ｎは正の整数）のキャピラリアレイを着脱可能なキャピラリ電気泳動装置であって、
該キャピラリ電気泳動装置に取り付けられた各々のキャピラリアレイの一番端に配置されたキャピラリの照射部から該キャピラリアレイに含まれるすべてのキャピラリの照射部を通過するように励起光を照射する励起光照射手段と、
該キャピラリ電気泳動装置に取り付けられるすべてのキャピラリアレイのキャピラリから発生する発光を検出する１個の検出光学系とを備えることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
励起光が照射される照射部が平面上に平行に配置された複数のキャピラリから各々成る２つのキャピラリアレイを、各々が含むキャピラリの照射部が平行且つ同一平面上に配置されるように独立に着脱可能なキャピラリ電気泳動装置であって、
前記２つのキャピラリアレイのキャピラリの照射部が平行且つ同一平面上に配置されるように取り付けられる取り付け面と、
前記取り付け面の２つのキャピラリアレイのキャピラリの照射部が取り付けられる位置の間に配置された遮光手段と、
該キャピラリ電気泳動装置に取り付けられた各々のキャピラリアレイの前記遮光手段と反対側の端に配置されたキャピラリの照射部から該キャピラリアレイに含まれるすべてのキャピラリの照射部を通過するように励起光を照射する励起光照射手段と、
前記２つのキャピラリアレイの取り付け面に対して垂直方向に配置され、該キャピラリ電気泳動装置に取り付けられる２つのキャピラリアレイのキャピラリから発生する発光を検出する１個の検出光学系とを備えることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
前記遮光手段の励起光が当たる部分に斜面が形成されていることを特徴とする請求項６記載のキャピラリ電気泳動装置。
前記２つのキャピラリアレイの光照射部が取り付けられる位置は、前記検出光学系の光軸を挟んで位置することを特徴とする請求項６記載のキャピラリ電気泳動装置。
励起光を照射する照射部が平面上に平行に配置された複数のキャピラリから各々成る２つのキャピラリアレイを、各々のキャピラリアレイのキャピラリの照射部が遮光手段を挟んで平行且つ同一平面上となるように配置し、
前記２つのキャピラリアレイの前記遮光手段と反対側の端に配置されたキャピラリの照射部から該キャピラリアレイに含まれるすべてのキャピラリの照射部を通過するように励起光を照射し、
前記２つのキャピラリアレイのキャピラリから発生する発光を、前記２つのキャピラリアレイのキャピラリの照射部が配置される平面に対して垂直方向に配置された１個の検出光学系によって検出することを特徴とする方法。