JP4045253B2 - キャピラリー及び電気泳動装置 - Google Patents
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Description
蛍光の検出には、様々な方法があるが、特開平9―96623号(特許文献1)では,キャピラリー中を電気泳動するDNAにレーザビームを照射し,DNAから放射された蛍光を試料の泳動方向に直交する方向から検出している。本願明細書では、このように、試料の泳動方向に対して直交する方向から検出する蛍光検出方法を、「直交検出」と呼ぶ。
また、Analytical Chemistry 1998, vol.70, pp. 3996-4003(非特許文献2)やElectrophoresis 2001, vol.22, pp. 629-643(非特許文献3)では、内径が80μmより小さいキャピラリーの場合、分解能が良い旨記載されている。
また、末端検出では、キャピラリーの内径から蛍光検出しなければならないので、集光効率を下げることなく、良好な感度を維持することに留意しなければならない。
ジュール熱の影響が無視できる限り,電界強度が高いほど,分離能は向上し,分析時間は短縮される。つまり,より短時間で長塩基長まで解読できる。それゆえ最近のCEベースのDNAシーケンシングでは,非特許文献1の100V/cmよりも高い電界強度,150V/cm以上が一般的に用いられている。同時に,ジュール熱の増加による電気泳動的分離能の低下を避けるため,内径を小さくする。
上で述べたように,末端検出では内径から放射されて検出される蛍光のみが有効であり,この量が末端検出の集光効率を表す。この光量はビニング領域の直径d=D1としたときのSとして式(1)から求められ,
以上のように、本願第1の構成は、D1/D2≧0.34で20μm≦D1≦80μmとすることである。
ビーム照射点での蛍光の放射量とCCDのノイズの影響を計算に入れ,最終的に非特許文献1と同等以上のS/Nが得られる条件を検討する。ビームが十分に絞られている場合,蛍光の発光量は内径に比例する。CCDのノイズは図5と同一とする。内径がそれぞれ50,75,100μmである場合のガラス外径とS/Nの関係を図8に示す。図8が示すように,非特許文献1の内径100μm,ガラス外径345μmの場合と同等のS/Nを得るには,内径50及び75μmの場合には,ガラス外径をそれぞれ128μm以下及び247μmとしなければならないことがわかる。図9は80μm以下の内径と,非特許文献1と同等以上のS/Nが維持できるガラス外径の上限値の関係を示す。内径が20μm以下の場合は,ガラス外径を内径より小さくしなければならないので,キャピラリーが存在し得ない。図9の曲線は20≦D1≦80の範囲で,
D2=−0.000328D1 3+0.0604D1 2+0.716D1―15
でほぼ完全に近似される。したがって,同等のS/Nを得つつ,良好な電気泳動性能を達成しうる条件は
20≦D1≦80かつ
D2≦−0.000328D1 3+0.0604D1 2+0.716D1―15
と表すことができる。
20≦D1≦80 (7)
かつ
D1/D2≧0.34 (8)
を満たすキャピラリーを用いる。また,キャピラリーのガラス表面は屈折率が1.4(分離媒体の屈折率)より小さいポリマーで少なくとも1部をコーティングされていなければならない。本実施例におけるコーティングの素材は屈折率nc=1.31の無色透明のテフロン(テフロンは登録商標)AF1600(デュポン)である。もちろん屈折率nc=1.29のテフロンAF2400(デュポン)でコーティングされたキャピラリーも好適に用いることができる。図10は本実施例で用いたキャピラリーの断面図と要求仕様を示す。コーティングの厚さは末端検出の性能に関係無いが,キャピラリーの機械的強度を保つために10μm以上が好ましく,15μm以上がより好ましい。本実施例ではD1=75,D2=220,D3=250であり,式(7)と(8)は満たされている。その結果,良好な電気泳動性能と集光効率を同時に得ることができる。また,コーティングの厚さを15μmとした結果十分な強度を得ることができた。D1とD2のペアーとしては式(7)と式(8)を満たす任意の組合せを用いることができ,例えば,(D1,D2)=(40,110),(50,130),(60,175)などを好適に用いることができる。
D1/D2≧0.43 (10)
を満たさなければならない。本実施例ではF=1.2であるが,F=1.4やF=1.8の場合も式(10)を当然満たさなければならない。本実施例ではD1=50,D2=100,D3=130として式(10)が満たされるようにした。D1とD2のペアーとしては式(6)と式(10)を満たす任意の組合せを用いることができ,例えば,(D1,D2)=(40,85),(60,130),(75,165)などを好適に用いることができる。
本実施例では,内径を非特許文献1の半分とすることにより,3倍以上(320V/cm)の高電界を使用して安定なDNAシーケンシングができるようになった。本実施例では非特許文献1の4倍以上の384本のキャピラリーを集積化して,384試料の同時分析を可能とした。図13に,代表キャピラリー1−357で得られたシーケンシング波形を示す。試料は,ROXプライマーで標識された,M13mp18をテンプレートとする単色シーケンシング反応生成物である。529ベースまでの単一塩基分離が10分以内で達成された。つまり約500ベースを10分以内で解読できる。また,154ベースの平均泳動時間は6分であり,非特許文献1の6倍以上の高速分析が実現した。これらの性能は他の383本のキャピラリーでも同等であった。従ってトータルでは非特許文献1の25倍のスループットが,同等の集光効率を維持したまま実現された。
本実施例では終端部103から液槽4を介して蛍光を検出したが,始端部102から液槽5を介して検出することも可能である。
20≦D1≦80 (11)
かつ
(D1=75±3かつD2≦229)または
(D1=50±3かつD2≦156)または
(D1=40±3かつD2≦126)
となる。このようなキャピラリーを用いることにより,従来のCEシステムで最適化された電気泳動条件を容易に移植できるという固有の効果が得られる。
Claims (16)
- 内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリーと、
前記キャピラリーの一方の端部側に設けられた液槽と、
前記液槽を介して、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出器とを有し、
前記キャピラリーの内径をD1[μm],ガラス外径をD2[μm]とするとき,
20≦D1≦80 かつ D1/D2≧0.34
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。 - 前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのFナンバーが1.0以上であることを特徴とする請求項1記載のキャピラ
リー電気泳動装置。 - 前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのFナンバーが1.2以上であって,D1/D2≧0.43であることを特
徴とする請求項1記載のキャピラリー電気泳動装置。 - 前記分離媒体の屈折率は、1.36以上1.42以下であることを特徴とする請求項1
に記載のキャピラリー電気泳動装置。 - 前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記ガラス製キャピラリーの外表面の少なくとも一部は、ポリマーでコーティングされ
,前記ポリマーの屈折率をnc,前記分離媒体の屈折率をnp,前記レンズのFナンバー
をFとするとき,
0.5/(np 2−nc 2)0.5≦F
であることを特徴とする請求項1記載のキャピラリー電気泳動装置。 - npは、1.36以上1.42以下であることを特徴とする請求項5記載のキャピラリ
ー電気泳動装置。 - 前記コーティングの厚さは10μm以上であることを特徴とする請求項5記載のキャピ
ラリー電気泳動装置。 - 前記ポリマーの屈折率は、前記分離媒体の屈折率よりも小さいことを特徴とする請求項
5記載のキャピラリー電気泳動装置。 - 前記キャピラリーは複数設けられ、前記一方の端部は2次元的に配置されていることを
特徴とする請求項1記載のキャピラリー電気泳動装置。 - 前記キャピラリーは、複数組のキャピラリー配列が形成されるように設けられ、
前記キャピラリー配列毎に、前記キャピラリーの側面から光を照射する光源とを有する
ことを特徴とする請求項1記載のキャピラリー電気泳動装置。 - 前記キャピラリーは複数設けられ、前記複数のキャピラリーに光ビームを照射する光源
と、前記光源と前記キャピラリーとの間に、前記光ビームを前記キャピラリーが並ぶ方向
に広げるレンズとを有することを特徴とする請求項1記載のキャピラリー電気泳動装置。 - 内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリー
と、
前記キャピラリーを延長した方向から、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出
器とを有し、
前記キャピラリーの内径をD1[μm],ガラス外径をD2[μm]とするとき,
20≦D1≦80 かつ
D2≦−0.000328D1 3+0.0604D1 2+0.716D1―15
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。 - 前記分離媒体の屈折率は、1.36以上1.42以下であることを特徴とする請求項1
2に記載のキャピラリー電気泳動装置。 - 前記キャピラリーは、複数組のキャピラリー配列が形成されるように設けられ、
前記キャピラリー配列毎に、前記キャピラリーの側面から光を照射する光源とを有する
ことを特徴とする請求項12記載のキャピラリー電気泳動装置。 - 内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリーと、
前記キャピラリーの一方の端部側に設けられた液槽と、
前記液槽を介して、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出器とを有し、
前記キャピラリーの内径をD1[μm],ガラス外径をD2[μm]とするとき,
(D1=75±3かつD2≦229)または
(D1=50±3かつD2≦156)または
(D1=40±3かつD2≦126)
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。 - 前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのFナンバーが1.0以上であることを特徴とする請求項15記載のキャピ
ラリー電気泳動装置。
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