JP2007163488A

JP2007163488A - 多重キャピラリー電気泳動蛍光システム

Info

Publication number: JP2007163488A
Application number: JP2006333878A
Authority: JP
Inventors: Ho-Ming Pang; パンホー−ミン; Wei Wei; ウェイウェイ
Original assignee: Combisep Inc
Current assignee: Combisep Inc
Priority date: 2005-12-12
Filing date: 2006-12-11
Publication date: 2007-06-28
Also published as: DE102006058575B4; DE102006058575A1; US20070131870A1

Abstract

【課題】多重キャピラリー電気泳動(ＣＥ)蛍光検出システムおよび方法を提供すること。
【解決手段】複数のサンプルに対して蛍光検出を使用する多重キャピラリー電気泳動(ＣＥ)方法は、チャネルのすべてに対する励起光源として単一の非コヒーレント光源で複数のサンプルを照射することにより、経済的見地から、また機器の複雑さに関して改善される。好ましい光源は、発光ダイオード(ＬＥＤ)である。
【選択図】図１

Description

本発明は、たとえば、蛍光標識された２本鎖ＤＮＡ、アミノ酸、炭水化物、脂肪酸、タンパク質など、蛍光特性を有する物質を分離および検出するために使用できる、多重キャピラリー電気泳動(ＣＥ)蛍光検出システムおよび方法に関する。

ＤＮＡサンプルを分析するために電気泳動を使用する様々な市販機器がある。こうしたタイプの１つとして、マルチレーンスラブゲル電気泳動機器があり、その名前が示すように、各ＤＮＡサンプルが置かれるゲルのスラブを使用する。ゲルスラブの両端に電圧が加えられ、それにより、荷電ＤＮＡサンプルの移動が起きる。ゲルは、サイズベースのふるい分け母体(sieving matrix)の役割を果たし、その結果ＤＮＡサンプルは、様々な大きさのＤＮＡ断片に分離される。

他のタイプの電気泳動機器は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)機器である。ＣＥは、非常に強い電界を使用して、狭い口径のキャピラリー(通常は内径が２０〜１００μｍ)内で分子を分離する、一群の関係する分析技法を指す。ＣＥ技法は、産業界および学界両方において、数多くの用途で利用される。ゲルベースおよびポリマーネットワーク(polymer network)ベースのＣＥは、核酸の研究に革命をもたらし、用途には、ＤＮＡ塩基配列決定、ヌクレオチドの定量化、および変異／多型性(mutation/polymorphism)分析が含まれる。緩衝液が入っている直径の小さい溶融石英キャピラリーカラム内で電気泳動を行うことにより、サンプルサイズの要求は、著しく小さくなり、分離および分解の速度を、スラブゲル電気泳動法と比較して何倍にも増大させることができる。蛍光物質を付着されたサンプルから分離される各成分に対して、キャピラリー壁を通して光を向けること、および入射光によって誘起される蛍光放射を検出することにより、ＣＥによって分析されるＤＮＡ断片がしばしば検出される。放射の強度は、サンプルの各成分の濃度、量および／またはサイズを表す。

ＣＥベースの機器を設計することおよびＣＥ分析プロトコルを実行することにおける課題のいくつかは、サンプル検出技法に関する。蛍光検出の場合、たとえば、放射源、光検出、検出の感度および信頼性、ならびに検出光学系の構造の費用および信頼性に、かなりの設計配慮がなされてきた。

蛍光検出とともにＣＥを使用することにより、ＤＮＡ分析において高い検出感度が得られる。他の検出方法と比較して、その感度が優れていることにより、蛍光検出は、しばしばゲノミクスおよびプロテオミクスの分野で最適な検出方法である。

複数のキャピラリーまたはチャネルを使用して、分離を並列して実行したほとんどの多重ＣＥシステムは、蛍光検出用の励起光源としてレーザ(コヒーレンス光源)を使用する(米国特許第５,５８２,７０５号参照)。ある特許(米国特許第６,８２８,５６７号)には、各分離チャネルに関連する発光ダイオード(ＬＥＤ)を備えるシステムが示してある。他の公報では、複数カラム検出ではなく単一カラム検出を取り扱う。

レーザ、あるいは各チャネルおよび／またはキャピラリーに関連する単一の発光ダイオードを使用することにより、機器は複雑になり、それにともなって費用が増大する。従来、単一ＬＥＤでは十分な出力が得られず、キャピラリーおよび／またはチャネルのアレイ全体の検出窓を一度に照射するのに十分な高いパワーにならないために、チャネルおよび／またはキャピラリーのアレイ用に単一ＬＥＤを使用することはできないと考えられてきた。

キャピラリー電気泳動(ＣＥ)での蛍光検出は、標準の紫外線吸収検出と比較して優れた感度を実現する。蛍光検出器の信号は、励起サンプルの体積および光源の特定の波長での出力パワーに関係がある。ＣＥは、狭い口径のキャピラリー(通常は内径が２０〜１００μｍ)を使用して、ナノリットルのサンプル体積を検出する。したがって、光源の出力パワーは、低い検出限界(ＬＯＤ：a limit of detection)を得るのに重要であり、ほとんどのサンプル分子を励起するために、高出力の光源がしばしば使用される。蛍光励起光源は、ガス放電ランプ(水銀またはキセノン)、レーザ(ガス、固体、色素、または半導体)あるいは発光ダイオード(ＬＥＤ)とすることができる。蛍光励起源としてガス放電ランプが使用されたとき、ＬＯＤは紫外線吸収検出器の１０分の１しかなかった。ＣＥ蛍光検出でのブレークスルーは、光源としてレーザを導入することによるものであった。レーザのコヒーレントな特性により、ＣＥ内に存在する小さな検出窓に焦点を合わせることが容易になる。この焦点合わせ能力および特定の波長での高いパワー出力の結果、光学パワー密度は、選択された波長での従来型ランプの光学パワー密度よりもはるかに高い。レーザ誘起蛍光(ＬＩＦ：laser-induced fluorescence)検出器を利用するＣＥを用いて、単一分子検出が実証されてきた。多重キャピラリーシステムに関しては、いくつかの蛍光検出モードが開発されてきた。それらのほとんどが、共焦点走査レーザ誘起蛍光(confocal scanning laser induced fluorescence)(たとえば米国特許第６,２７０,６４４号)、シースフロー(sheath flow)検出器(たとえば米国特許第５,４６８,３６４号および第６,０４８,４４４号)およびサイドエントリ光励起幾可学的形状(side-entry optical excitation geometry)(たとえば、米国特許第５,５８２,７０５号および第５,７４１,４１１号)などといったように、光源としてレーザを使用していた。

シースフロー検出器の主な欠点は、高信頼のシースフローを確実にするのに必要となる非常に精巧なフローシステムである。エンドユーザの頑強性に対する要求を満たすために、光学的および機械的な構成部品の許容範囲には極端な要求がなされる。

走査共焦点検出器は、光学システムを走査することに基づく。機器の簡潔さ、頑強性およびより低いコストを考慮するとき、可動部品を使用することは理想的ではない。光学的な走査原理はまた、キャピラリーごとのデューティサイクルを短縮させ、それにより、非常に高いスループット目的のために機器をさらに基準化するときに、感度を損なうことがある。

サイドエントリ光励起幾可学法は、複数のキャピラリーの内部を同時に照射し、それらから放射される光を集める。米国特許第５,７９０,７２７号にあるように、平行なアレイ内のキャピラリーは、光学的な導波管を形成し、円筒形の表面での屈折により、アレイの平面内でアレイ内の隣接した各キャピラリーのコアに送られる照射光が閉じ込められる。光散乱を低減させるために、光導波路が使用された。複数のチャネルを照射するためにレーザ光線は広げられたので、さらに、高出力レーザ光源が必要とされた。

単一チャネルＣＥでは、蛍光励起光源としてＬＥＤが使用されてきた。さらに、光源としてＬＥＤを使用する蛍光検出を有する多重ＣＥが、米国特許第６,８２８,５６７号に開示された。このシステムは、複数の放射源／共通の検出器、の構成に基づき、検出は、各チャネルに対して、時間スタガ(time-staggered)検出および／または時間多重検出で行われる。各キャピラリーは、光ファイバを介してＬＥＤによって照射された。各光源からの入射光は、光ファイバを使用して、複数チャネル検出ゾーンに別々に送られる。複数チャネル検出ゾーンから放射される光はまた、光ファイバを使用して、１つまたは複数の共通の検出器に送られる。検出システム全体には、複数の光源とともに２つ以上の検出器があってもよく、各々は複数の放射源を受け持つ。この方式の制限は、サンプリングレートの制限のために、時間スタガ方式および検出サイクルによって複数チャネルの数が制限されたことである。したがって、１２チャネルまでのシステムのみが商用化された。

近年に至って、ＬＥＤの技法は急激に発展してきた。低コストの高出力ＬＥＤ光源が、多くの商業的供給源から入手可能である。ＬＥＤ光の特性は、レーザまたは従来型のランプとは異なる。ＬＥＤの出力は、レーザ光源のようにコヒーレントではないが、ＬＥＤは、光スペクトルが狭く、光学的出力は、特定の波長において従来型のランプよりもはるかに高い。

したがって、多重ＣＥシステムの継続的な改良において、設計においてより低コスト、かつより単純で、低コストの操作で正確な分離、高解像度および高感度な検出を効率的に実証するシステムが必要となることが分かる。本発明は、その主要目的として、この必要性を達成する。

本発明は、すべてのチャネルに対する励起光源として単一の非コヒーレント光源からなる、簡略化された、低コスト、高感度、および高スループットの多重キャピラリー電気泳動蛍光検出システムを提供する。光ファイババンドルは、ＬＥＤから放射される光を、キャピラリーアレイホルダに対してある角度、好ましくは約４５°でキャピラリーアレイ検出窓に送る。検出窓での各サンプルからの放射出力は、カメラレンズによって集められ、電荷結合検出器(ＣＣＤ)など２次元のイメージング検出器に登録される。

本発明の具体的な一実施形態を、図１とともに説明する。しかし、図１は例示的なものに過ぎず、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、システムの他の物理的な実施形態を利用してもよいことを理解されたい。

前述の通り、本発明は、全体的に１０で表される、簡略で、低コストで、効率的で、感度が非常に高く、またスループットが高い検出システムを提供する。このシステムは、マルチチャネル検出システムでの高価な高出力レーザの代わりに、単一のＬＥＤ光源１４を、窓１６を介して、好ましくは鋭角、もっとも好ましくは４５°で引き渡すのに使用される光ファイババンドル１２に基づいている。このシステムの角度は１６に、窓は１８に、また１つのキャピラリーは２０に示してある。光学カメラレンズ２２は、蛍光信号を集めるために使用され、電荷結合デバイス(ＣＣＤ)検出器２４などの２次元のイメージングアレイ(imaging array)検出器上に記録される。さらに、検出窓信号に沿った検出器からのピクセルビニング(pixel binning)を使用して、分離分解能を失うことなく信号対雑音比を改善する。キャピラリーアレイの検出窓からの蛍光信号をＣＣＤ検出器に投影するとき、各キャピラリー放射信号は、ＣＣＤ検出器上の２つ以上のピクセルをカバーすることになる。たとえば、図２は、検出窓蛍光信号を監視しているときの、ＣＣＤ検出器からの２Ｄ画像出力を示す。検出窓からの蛍光は、ＣＣＤ検出器の複数のピクセル上に照射される。対応する各信号を(水平および垂直に)一緒に組み合わせることにより、検出信号のより高い信号対雑音比を得ることができる。

システムのある種の限界およびパラメータは、言及するに値する。発光ダイオード(ＬＥＤ)の放射束は、一般的に１００ｍＷから１０００ｍＷとすることができ、約７００ｍＷであることが好ましい。さらにいっそう高い放射束を励起用に使用して信号を増大させることもできるが、キャピラリー検出表面上の光散乱が増大することに起因する、より高い背景雑音が、利得を相殺することになる。したがって、より大きい光散乱を低減することができる場合には、より高い放射束を使用することもできる。ダイオードからの光は集められ、検出窓１６上に角度をつけて、好ましくは２０°から９０°の角度で、より好ましくは３０°から６０°の角度で、またもっとも好ましくは約４５°の角度で照射される。ＬＥＤ光は、平行にし、検出窓全体上に焦点を合わせることができ、または光ファイババンドルを使用して、光出力をＬＥＤ光源から検出窓に直接集めることができる。ＬＥＤからの光出力を再整形して、検出窓の形に合わせることは難しいので、光ファイババンドルを使用することが好ましい。しかし、光収集効率を最大化するために、入力端がＬＥＤ光源と同様の収集領域を有するように、また照射効率を最大化するために、出力端が検出窓と同様の形状を有するように、光ファイババンドルを製造することができる。光ファイババンドルを使用するとき、レンズを使用して、光ファイババンドルから検出窓への光出力を平行にすることができる。レンズを使用しない場合、発散出力光を最小限に抑えるために、光ファイババンドルの出力端は、可能な限り検出窓の近くに配置される。デザインが単純なので、後者の方法が好ましい方法である。

分離チャネルは、図１に示すようにキャピラリーアレイ２８でもよく、事実上、ブロック(図示せず)内に組み立てられる単なるチャネルでもよい。首尾よく使用されてきたシステムは、たとえば、Yeung、米国特許第６,７８８,４１４号、２００４年９月７日に示してある、９６キャピラリーアレイのタイプを用いる。

例として、図１のシステムは、分離された２本鎖ＤＮＡサンプルの蛍光検出用に利用された。ふるい分け母体は、２本鎖ＤＮＡに結合し光源によって励起されるときに蛍光発光する臭化エチジウムなどの色素を含んだ。ＣＣＤ検出器は、検出窓からの蛍光出力を記録した。信号出力を抽出し、電気泳動図として再構成するために、ソフトウェアアルゴリズムが使用された。図３は、４８０ｎｍでのＬＥＤ励起および５２０ｎｍでの蛍光検出を用いた、2本鎖ＤＮＡの多重ＣＥ分離である。図３には、１００塩基対の２本鎖ＤＮＡラダーの分離が示してある。このシステムは、コストが同程度である紫外線吸収検出システムの感度よりも、少なくとも２０倍から１００倍よい感度を示した。

したがって、本発明は、その述べられた目的の少なくともすべてをやりとげることが分かる。

分離チャネル用の励起光源として角度をつけて配置される単一ＬＥＤ光源を用いて蛍光検出を使用する、本発明の多重電気泳動システムの概略図である。キャピラリーアレイからの蛍光信号を監視しているときの、ＣＣＤ検出器からの２Ｄ画像出力を示す図である。図１のシステムを使用して分離および検出が成功したことを示す、電気泳動図の結果である。

符号の説明

１０検出システム
１２光ファイババンドル
１４単一のＬＥＤ光源
１６検出窓
２２光学カメラレンズ
２４電荷結合デバイス(ＣＣＤ)検出器
２８キャピラリーアレイ

Claims

複数の分離チャネル内に配置される複数のサンプルに対して蛍光検出を使用する、多重キャピラリー電気泳動方法において、
前記チャネルのすべてに対する励起光源として、角度をつけた単一の非コヒーレント光源で前記複数のサンプルを照射することを含む、改良型の方法。
前記光源は発光ダイオード(ＬＥＤ)である、請求項１に記載の方法。
前記LEDのパワー出力は、１００ｍＷよりも大きい、請求項２に記載の方法。
別々の分析サンプルに対する複数の分離チャネルと、前記分離チャネルの各々に関連する検出システムと、前記サンプルのすべてを同時に照射するための単一の非コヒーレント励起光源と、前記サンプルのすべてからの放射放出を検出するための検出器とを備え、前記分離チャネルの前記平面アレイ内の前記サンプルによる蛍光の検出は、前記サンプル内に蛍光種(fluorescent species)が存在することを示す、多重キャピラリー電気泳動検出システム。
分離チャネルはキャピラリーである、請求項１０に記載の検出システム。
単一の非コヒーレント励起光源は発光ダイオード(ＬＥＤ)である、請求項１１に記載の検出システム。
前記単一の非コヒーレント励起光源と前記複数の分離チャネルとの間に光送出窓を有する、請求項１０に記載の検出システム。
前記光源は、前記ＬＥＤに関連する光ファイババンドル、または前記ＬＥＤに関連するコリメートレンズにより前記検出窓まで引き渡される、請求項１３に記載のシステム。
前記光ファイババンドルは、前記検出窓に対して４５°の角度で前記光を引き渡すように配置される、請求項１４に記載のシステム。