JP2002139475A

JP2002139475A - 螢光検出及び界面動電分離の方法及び装置

Info

Publication number: JP2002139475A
Application number: JP2001269577A
Authority: JP
Inventors: Richard N Zare; エヌ．ザーレリチャード; Ernst Gassmann; ガスマンエルンスト
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1985-09-18
Filing date: 2001-09-05
Publication date: 2002-05-17
Also published as: DE3650483D1; JPH07111398B2; DE3650483T2; US4675300A; JPS6273138A; EP0216600A2; CA1309058C; EP0216600B1; EP0485370A3; EP0216600A3; EP0485370A2; JPH11326277A

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】界面導電分離プロセスとコヒーレント放射源と
の組み合わせにより、好感度の分析方法および装置を提
供する。【解決手段】液体試料中の螢光特性における変化を起こ
す分子の存在を示すための装置であって、(a)小径の、
両端開口の、壁を有する、少なくとも一部分が半透明で
ある、上記試料を収容するための通路、(b)上記試料に
充分な電場を印加し、上記試料をその分子に分離し、そ
してこれら分子を上記半透明部３２を超えて通路中を輸
送するための手段、(c)上記分子の存在下で、半透明部
で螢光特性を変化させる波長のコヒーレント放射を上記
半透明部に照射するための手段、及び(d)上記半透明部
で発せられる螢光を集めるための手段を備える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は電気泳動の分野に関
し、より詳細には、開口筒状キャピラリ(open-tubular
capillary)内での界面動電分離を行い及び検出するため
の改良された方法及び装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】プレトリウス(Pretorius)等は、接線方
向に印加された電界の影響下に固体面と接触した液の流
れであるという電気浸透の考えを1974年に示した(ジャ
ーナルオブクロマトグラフィ(J. Chromatogr.)、99、2
3)。表面の上のイオンの選択的吸着に基づき、電気浸透
流によって固液界面に於ける電気二重層が形成されると
考えられていた。この輸送プロセスを図１に示す。図１
には、小径の二重又は両端開口の管10の断面が示されて
いる。該管は、導電性の液11(本明細書に於いては「支
持電解質」と称することもある)によって充たされてい
る。管10の壁は選択的に吸着された陽イオン12を含んで
いる(管10の材質によっては、吸着される電荷は負の場
合もある)。陽イオン12は導電液11からアニオン13を吸
引し、電気二重層14を形成する。該壁へのアニオンのそ
の選択的吸引によって、液11の内部では正電荷が過剰と
なる。従って、管10内の液11の柱の両端に位置する電極
15、16間に、例えば30kVの電位差を与えて電界を印加す
ると、正に帯電している液は陰極の方に移動する。プレ
トリウス等はこのプロセスを、薄膜、高速の液クロマト
グラフィに用いることを提案している。

【０００３】ミッカーズ等は、小径(例えば、0.2〜0.35
mm)の管を高パーフォーマンスゾーン電気泳動に用いる
ことを1979年に示した(ジャーナルオブクロマトグラフ
ィ、169、11)。最近では、ジェー.ダブリュ.ジョルゲン
ソン(J. W. Jorgenson)及びケー.ディー.ルカクス(K.
D. Lukacs)は、そのような分離を行うために、75μｍの
ガラスキャピラリを用いることを報告している(ジャー
ナルオブクロマトグラフィ、218(1981)、209；アナリテ
ィカルケミストリ(Anal. Chem)、53(1981)、1298；及び
サイエンス(Science)、222(1983)、266)。ツダ(Tsuda)
等は同様のことを報告している(ジャーナルオブクロマ
トグラフィ、248(1982)、241及び264(1983)、385)。キ
ャピラリの通路を用いることの利点は、試料の流れを妨
げるジュール熱効果が少なくなることである。

【０００４】分離プロセスは、上述の電気浸透効果と、
液媒体内の溶質の電荷の陽、中性、陰に応じた溶質に対
する電界の差動(differential)効果とに依存する。これ
らの関連する効果を図２を用いて説明する。図２は図１
と同様のものであるが、液11中の各分子種の荷電分子(c
harged species)18、19が示されている。カチオン分子1
8は電気泳動的に陰極16の方に吸引される。アニオン分
子19は陰極16から反発される。図２に示されているよう
に、また、通常の場合そうであるように、液11の速度は
溶液中の分子の電気泳動速度よりも大きいので、全ての
分子は、速度は異なっているが同じ電気浸透流の方向に
移動しているように見える。電気浸透流と電気泳動との
組合せを、各文献及び本明細書では「界面動電(electro
kineticmovement)」と称している。また、これらの２効
果による分離を「界面動電分離(electrokinetic separa
tion)」と称している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】更に、電気浸透流は、
層流とは対照的なプラグ流の特性を有している。これに
より高分解能の分離となる。界面動電分離を溶液中の分
子の分離に用いることは理論的には可能であり、原理的
にはこれらの分離を検出することもできる。しかし、ジ
ョルゲンソン及びルカクスがサイエンス誌中の結論で述
べているように、「(そのような分離法に於ける)キャピ
ラリの更なる開発と利用に対する最大の障害は、極めて
高感度の検出が必要なことであり、より多くのタイプの
高感度検出法の出現が熱望されている」のである。界面
動電分離カラム中を運動している分子の存在を示すため
に従来用いられている検出器の種類には次のようなもの
がある。(1)ミッカーズ等により用いられた紫外線吸収
及び導電性；(2)ジョルゲンソン及びルカクスにより用
いられたランプ励起によるオンカラム(on-column)螢光
検出;(3)ツダ等により用いられた紫外線検出。ジオーク
リッジナショナルラボラトリ(the Oak Ridge National
Laboratory)のデイビッド等は、コントラクト(contrac
t)W-7405-eng-26に於ける研究報告 ORNL/TM-9141の中
で、オンカラムランプ励起螢光検出システム及びそれを
キャピラリ電気泳動システムで用いることを開示してい
る。適切な検出システムを選択することは、高電圧が用
いられる場合の操作者の安全性を実際に考慮するならば
より困難である。測定されている試料中に数十kV程度の
電位が存在する場合には、検出器は信頼性のあるもので
なければならず、しかも、操作者が試料自身又は直接そ
の周辺を操作するようなものであってはならない。

【０００６】本発明の目的のひとつは、従来より求めら
れている改良された方法及びシステムを提供することに
ある。また、本発明の他の目的は、その改良された方法
及びシステムを用いることによってより高感度の界面動
電アッセイ(assay)法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、液体試料中の
螢光特性における変化を起こす分子の存在を示すための
装置に関し、この装置は：(a)小径の、両端開口の、壁
を有する、少なくとも一部分が半透明である、上記試料
を収容するための通路、(b)上記試料に充分な電場を印
加し、該一部分が該半透明部を備え、上記試料をその分
子に分離し、そしてこれら分子を上記半透明部を超えて
通路中を輸送するための手段、(c)上記分子の存在下
で、半透明部で螢光特性を変化させる波長のコヒーレン
ト放射を上記半透明部に照射するための手段、及び(d)
上記半透明部で発せられる螢光を集めるための手段を備
える。

【０００８】上記通路は界面動電領域を形成する、管状
の、壁を有する通路であり得る。

【０００９】１つの実施態様では、上記螢光を集めるた
めの手段は、ファイバー光学装置を備え得る。

【００１０】１つの実施態様では、上記照射するための
手段は、ファイバー光学装置を備え得る。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の螢光アッセイ(fluoroass
ay)法は、電気浸透的に輸送可能(pumpable)であり螢光
特性が変化する液体試料中の標的分子の存在を検出する
ための螢光アッセイ法であって、(a)電気浸透的に輸送
可能な液で充たされた、細孔又は小径の、二重又は両端
開口の、壁を有し、少なくとも一部が半透明(transluce
nt) である、通路内に、該試料を配すること、(b)該輸
送可能な試料及び輸送可能な液に対して電気的輸送に有
効な電位を印加して、該試料が該通路内を移動するよう
にさせること、(c)該試料内に螢光を励起するのに有効
な波長のコヒーレント放射を該試料に照射すること、及
び(d)該標的分子が該半透明部を通過する際の該通路の
該半透明部を介して出される螢光中の変化を検出するこ
とを包含しており、そのことにより上記目的が達成され
る。

【００１２】また、本発明の検出方法は、電気浸透的に
輸送可能であり螢光特性が変化する液体試料中の、複数
の放射に反応して螢光を発する標的分子の存在を検出す
るための方法であって、(a)電気浸透的に輸送可能な液
で充たされた、細孔又は小径の、二重又は両端開口の、
壁を有し、該複数の分子の互いの界面動電分離がなされ
るのに充分な長さと、該長さ以降の少なくとも一部に半
透明部とを有する、通路内に、該試料を配すること、
(b)該輸送可能な試料及び輸送可能な液に対して電気的
輸送に有効な電気泳動分離電位を印加して、該試料が該
通路内を移動するようにさせ、該複数の標的分子を互い
に界面動電的に分離すること、(c)該標的分子が該半透
明部を通過する際に、該試料内に螢光を励起するのに有
効な波長のコヒーレント放射を該試料に照射すること、
及び(d)該個々の分離された標的分子が該半透明部を通
過する際の該通路の該半透明部を介して出される螢光中
の変化を検出することを包含しており、そのことにより
上記目的が達成される。

【００１３】本発明のキラル化合物を分離する方法は、
(a)界面動電領域内の、電気浸透的に輸送可能なキラル
支持電解質内に該化合物を配すること、及び(b)該キラ
ル化合物を分離するのに有効な期間、該領域内の該支持
電解質に有効界面動電電位を印加すること、を包含して
おり、そのことにより上記目的が達成される。

【００１４】本発明の検出器は、液体試料中の螢光分子
の存在を示すための検出器であって、(a)細孔又は小径
の、二重又は両端開口の、壁を有する、少なくとも一部
が半透明である、該試料を収容するための通路、(b)該
螢光分子内に螢光を励起するのに有効な波長のコヒーレ
ント放射を該試料に照射するための手段、及び(c)該螢
光分子によって出される螢光を該半透明部を介して集め
るための手段を備えており、そのことにより上記目的が
達成される。

【００１５】また、本発明の分離検出システムは、電気
浸透的に輸送可能な液を含む試料中の、複数の放射に反
応して螢光を発する標的分子を分離し、検出するための
システムであって、(a)電気浸透的に輸送可能な液を収
容するための、細孔又は小径の、二重又は両端開口の、
壁を有し、半透明検出部に接続され且つ連通されている
通路、(b)該試料を該通路内に供給するための手段、(c)
該試料が供給される前後に於いて該通路に電気浸透的に
輸送可能な液を供給するための手段、(d)該通路に沿っ
て且つ該検出領域を介して、有効界面動電電位を加える
ための手段、(e)該試料が該検出部を通過する際に、該
試料内に螢光を励起するのに有効な波長のコヒーレント
放射を該試料に与えるための手段、及び(f)該放射に反
応して螢光を発する分子が該検出部を通過する際に、出
された螢光中の変化を該半透明部を介して検出するため
の手段を備えており、そのことにより上記目的が達成さ
れる。

【００１６】検出ボリューム(detection volume)を介し
て支持電解質中を通過する際の界面動電的に輸送される
標的分子の検出を、該検出ボリュームを介しての該分子
の通過に関連する検出事象(detection event)が、コヒ
ーレント源によりオンカラムに供給された電磁放射のビ
ームによって発生された放出光(特に、螢光)の変化であ
る場合に於いて、高効率で行うことができることが見出
された。コヒーレント放射源を用いることは、よく規制
された波長の放射を、非コヒーレント光源と比較して、
危険なく、強度のかなりの損失もなく、更に散乱光によ
る望ましくない干渉もなく、オンカラムで試料に供給す
ることができる。コヒーレント放射を用いることによっ
て、ラマン及びレイリー散乱からの干渉が最小になるの
で、感度が増大する。この検出システムにより、化合物
の混合物の分析及び/又は分離が高い効率で可能とな
る。本発明の検出システムを用いて、フェムトモル(10
^-15モル)以下の範囲の標的の量を検出することができ
る。

【００１７】他の面では、本発明は、界面動電分離プロ
セスに用いる検出器を提供するものである。この検出器
は、螢光分析のためのオンカラムコヒーレント励起源を
備えている。

【００１８】本発明の更に他の面によって、光学的活性
の(即ち、キラル)支持液(support liquid)が界面動電分
離プロセスに用いられる場合に生ずる、ラセミ混合物の
光学的活性成分への界面動電分離が提供される。

【００１９】

【実施例】(実施例１)レーザ励起螢光検出器を備えた界
面動電分離系を構成した。図３および図４によりこの系
を説明する。この系には、全長75cm内径75μm の融解石
英キャピラリ30(ヒューレット−パッカード社製)が含ま
れる。キャピラリはその外面に不透明のポリイミド保護
コーティング31を有し、その一部は炎で除去され半透明
部32となる。キャピラリ30は、５mM l−ヒスチジン、2.
5mM CuSO₄・5H₂Oおよび10mM酢酸アンモニウムを含みNH₄O
Hを加えてpH７〜８に調整した支持電解質で液体封入さ
れる。供給容器34および流出容器35も同様に支持電解質
を含み、従って、液体封入キャピラリ30はそれら容器の
間に連続的な液体連結および電気的連結を形成する。電
極37と39との間にそれぞれ配線40および41を介して電源
36から-30kVの電位を印加し、完全な電気回路とする。
キャピラリ30の内面は陽イオンを選択的に吸着するよう
になっている。これにより電解質中のカチオンが優先的
にキャピラリ壁に二層として引きつけられ、キャピラリ
30内の支持電解質の本体に次々と正味陽電荷が付与され
る。流出容器35の液体に電極39により-30kVの電位をか
けると、この陽荷電液体はキャピラリ30から容器35へ電
気浸透的に引っぱられ、追加の電解質が容器34からキャ
ピラリ30へ導入される。電流は30〜33μAであった。キ
ャピラリ30中の液体の線速度は約１〜２mm/秒であっ
た。

【００２０】キャピラリ30はフローセル42を通り抜け、
継手44および45によりその半透明部32が、所定位置に支
持される。半透明部32はフローセル42の中央で検出ボリ
ュームを限定する。

【００２１】フローセル42には、オンカラム螢光検出器
が含まれ、この検出器は励起源として波長325nmで５mW
の連続波出力を有する He-Cdレーザ46(リコニクス、モ
デル4240B、サニーベール、CA)を使用する。レーザのフ
ィルタ出力はレンズ47を介して光ファイバ49(80μm、融
解石英材)上に集められ、レーザ光線は光ファイバ49に
よりフローセル42へ運ばれる。ファイバ49は、その出力
がキャピラリ30の半透明部32上に集められるように、３
軸位置決めヘッド50により所定位置に支持される。検出
ボリュームを介して輸送されている液体から発する螢光
は、0.6mm融解石英光ファイバ51により励起ビームに垂
直に集められる。ファイバ51は３軸位置決めヘッド52に
より所定位置に支持される。ファイバ51で集められた螢
光は高域カットオフフィルタ53、可変波長帯域を選択す
るよう働く高速モノクロメーター54(セントロニック
モデルＱ4249B)、および光電子増倍管55を通過する。光
電子増倍管55の出力は、キースリーインスツルメント
社製モデル480ピコアンメーター(図示せず)により増幅
され、配線56を介して帯形記録計57に送られる。

【００２２】使用に際し、試料がキャピラリ30に注入さ
れる。これは、キャピラリ30の陽極端を容器58に含まれ
る液体試料中に浸し、陽極リード40を電極59に連結し、
６kVの高圧を短期間(５〜10秒)かけることにより、行わ
れる。これにより、１から５mm長に限定された試料の
“プラグ”がカラム30に導入される。

【００２３】以下のダンシル化アミノ酸各10^-4Mで構成
される第１の試料を、支持電解質で用いたのと同じ液体
中で調製した。

【００２４】ｄ−Ｔｙｒｌ−Ｔｙｒｄ−Ｐｈｅｌ−Ｐｈｅｄ−Ａｓｐｌ−Ａｓｐｄ−Ｇｌｕｌ−Ｇｌｕ標識化アミノ酸はシグマケミカル社、セントルイス、
ＭＯから購入するか、またはTapuhi、et al.(I)、Anal.
Biochem.115、123(1981)、and Tapuhi、et al.(II)、
J.Chromatog.、205、325(1981)の方法で調製した。支持
電解質液はｌ−ヒスチジンの銅(II)錯体を含む。この錯
体は光学的に活性で、従って支持電解質はキラル支持電
解質である。４組の光学活性なペアはカラム30中を移動
するに従って互いに分離される。また、分離は各ペアの
光学異性体のメンバー間でも生じる。８個の分離分子そ
れぞれが検出ボリュームを通過するとそれらが検出され
る。この場合、それらのダンシル標識が螢光を発し、こ
れが検出される。結果を図５のａに通電クロマトグラフ
ィー(エレクトロフェログラム)として示す。ここではレ
ーザ励起螢光信号を時間に対しプロットしている。次
に、支持液中のｌ−ヒスチジンの1/2をｄ−ヒスチジン
で置き換え、前の実験で用いたのと等しい総濃度のｄ−
ヒスチジンとｌ−ヒスチジンとの１：１混合液を得る。
このキラリティーのない支持電解質を用いて実験を繰り
返したところ、ｄ異性体とｌ異性体の分離は観察されな
かった。図５のｂに示されるように、個々の４つのピー
ク、すなわち各アミノ酸に対し１つのピークが見られ
た。同様に、l−ヒスチジンをｄ−ヒスチジンで完全に
置き換えると、ダンシル化されたｄアミノ酸異性体とｌ
アミノ酸異性体の順序が逆になって分離が生じた。

【００２５】従って、これら３つの実験は、コヒーレン
ト(すなわち、レーザ)エネルギー源によりオンカラムで
励起された螢光の変化を測定することは、小径通路内の
電気浸透的に輸送可能な液体中の分離分子の存在を界面
動電プロセスにより検出するための有効かつ効率良い方
法である、という本発明の広い局面を説明するものであ
る。これら実験では約0.5 nlの検出ボリュームを用い
た。検出中の分子は、電気浸透的に輸送可能な支持電解
質１ｌあたり約10^-4モルの濃度であった。観察された信
号対雑音比は 100：１より大きかった。これらの要素を
結合すると、本検出系は５×10^-16モル(すなわち、フェ
ムトモルを下まわる)標的分子を検出できることがわか
る。

【００２６】これら実験はまた、界面動電分離プロセス
を用いて光学異性体を分離できる、という本発明の他の
局面をもしめしている。光学異性体のこの分離は、速度
および感度の両方の見地において先例がないと信じる。 (実施例２)より広範なアミノ酸を用いて実施例１の実験
を繰り返した。アミノ酸は様々な組み合わせで用いた。
その結果を表１に示す。表１は、本文で説明した条件
下、pH８で得られた、いくつかのｄ、ｌ−ダンシル−ア
ミノ酸に対する移動時間(ｔ_d、ｔ_l)、Δｔ値(式(1)参
照)および相対ピーク域(Ａｄ、Ａｌ)を示す。移動時間
の再現性は±３％相対標準偏差(R.S.D.)単位よりよく、
また相対ピーク域では約±５％R.S.D.である。

【００２７】

【表１】

【００２８】実施例１で観察され図５のａおよびｂで示
された優れた信号対雑音比が、このより広範な試料につ
いてもみられた。この信号対雑音比から、このより広範
な標識アミノ酸が簡便な現実験装置によりフェムトモル
(10^-15モル)あるいはそれより低いレベルで検出できる
ことが示された。次式で示される量の絶対等級Δｔが0.
01を越える場合、基線解像が可能であることがわかる： Δｔ＝(t_d−ｔ_l)／[1/2(t_d＋ t_l)] ・・・式(１) ここで、 t_dおよび t_lはｄ光学異性体およびｌ光学異性
体の移動時間である。支持電解質中のｌ−ヒスチジンを
ｄ−ヒスチジンで置き換えると、ｄアミノ酸とｌアミノ
酸の移動順序が逆になる。すなわち、Δｔの符号が変わ
る。図５のａはまた、同じダンシル−アミノ酸の２つの
光学異性体に対する螢光信号が異なることを示してい
る。表１では、10個の異なるｄ、ｌ−ダンシル−アミノ
酸に対する内部標準としてｌ−アルギニンを用い、それ
をもとに移動時間、Δｔ値および相対ピーク域が示され
ている。ｄ、ｌ−セリン以外の全ての場合において解像
が達成されているが、Δｔの符号はアミノ酸により異な
る。観察されたアミノ酸の移動順序はＨＰＬＣでみられ
たもの(Lam、et al.、J.Chromatog.、199、295(1980)、
and J.Chromatog.、239、451(1982)参照)と異なるが、
鏡像異性体の移動順序はΔｔの符号で示されるように同
じである。

【００２９】本発明がいかに作用するかのいかなる特別
な理論によっても制限されることは望まないが、Cu(II)
ｌ−ヒスチジン支持電解質によるキラリティーの認識
は、ジアステレオマーの三元錯体を形成するための混合
キレート錯体形式により説明することができる。以下の
説明は現データの全てと一致する。Cu(II)ｌ−ヒスチジ
ンに結合したアミノ酸は遊離アミノ酸より速く移動す
る。これは使用したpH条件下でCu(II)ｌ−ヒスチジンが
陽電荷を有するからである。しかし、Cu(II)ｌ−ヒスチ
ジンにより強く結合したアミノ酸はより弱い螢光信号を
示し、これは銅イオンとの結合による消滅で生じたもの
である。従って、より多く錯体が形成された鏡像異性体
は速く移動するが、銅イオンとの結合による消滅で生じ
る弱い螢光信号を示す(図５のａおよび表１を参照のこ
と)。 (実施例３)ウシインシュリンをフルオレスセインイソチ
オシアネイト(ＦＩＴＣ)で標識した。インシュリン(シ
グマケミカル社)10mgを 0.5Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液
(pH9.5)６mlに溶解させた。ＦＩＴＣ(シグマケミカル
社)1.5mgを添加後、混合液を４℃で一晩撹拌してインシ
ュリンにＦＩＴＣを連結した。

【００３０】反応混合液を 1.5×40cmセファデクス^TMＣ
−25シリカゲル濾過カラムに配し、0.01Ｍリン酸緩衝塩
溶液(pH 7.4)で流速約１ml/分にて溶出させた。未反応
ＦＩＴＣはシリカゲルに吸着された。ＦＩＴＣ−標識イ
ンシュリンを含む黄色のバンドをカラムから取り出し、
水５部にて希釈した。両性イオン緩衝液ＣＨＥＳ(２−
［Ｎ−シクロヘキシルアミノ]エタンスルフォン酸)を10
mMレベルまで加え、溶液のpHを９までもっていった。

【００３１】実施例１の装置で標識インシュリン溶液を
用いた。５kVの電位を13秒間印加することにより、キャ
ピラリカラムに試料を設置した。次いで30kVの電位をか
けて、試料をキャピラリ中を界面動電的に輸送した。電
流は 5.6mAであった。オンカラムのレーザ励起は325nm
であった。510nmにて放射をモニターした。 5.5分と 8.
0分の間に、ＦＩＴＣ標識インシュリンに相当する一連
のピークが示された。(実施例４および５)実施例３の実
験を変更を加えて２回繰り返す。実施例４では、標識イ
ンシュリンの代わりに、ＦＩＴＣ−標識コンカナバリン
Ａ(シグマケミカル社、あるいはフルカケミカル
社、Hauppauge、N.Y.から入手可能)の蛋白を用いる。キ
ャピラリカラムに設置される供給混合液には、0.5mg/ml
の蛋白と、pHを８に保つ20mM緩衝液とが含まれる。界面
動電電圧を印加すれば、界面動電的に標識された蛋白に
相当するピークが５から10分までに観察されるであろ
う。

【００３２】実施例５では、標識インシュリンの代わり
に、ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗ヒトガンマグロブリンをリン
酸緩衝塩溶液(pH 7.2)に溶かしたもの(シグマケミカ
ル社から入手可能)を用いる。ここでもまた、本発明の
オンカラムレーザ励起法を用いることにより、このイム
ノグロブリンを検出領域中を輸送させて生じた螢光ピー
クが観察されるであろう。

【００３３】本発明がここで述べた実施態様に限定され
ないことはいうまでもない。上述のキャピラリの代わり
に、小径の細長い、壁を有する、通路の形であればどん
なものでも使用できる。概括的な言葉でいえば、直径が
約 500μmを越えない通路を使うのが好ましい。より広
径の通路は、界面動電電位を印加した際に、過度の加熱
を起こす可能性がある。好ましい通路には、１本あるい
は複数本の通路が含まれ、それぞれの直径は約 500μm
まで、特に約５μmから約 350μmまでである。通路の断
面が小さいほど、検出領域のボリュームが小さくなり、
従って検出系の感度の必要性が大きくなることが認めら
れよう。その構造が簡単であることから、円形断面のキ
ャピラリが好ましい。

【００３４】通路は、界面動電的な力のもとで分子の分
離を行うのに有効な長さのものでなければならない。通
路が長いほど、試料が通路中を移動するのに要する時間
が長くなり、従って様々な分子が互いに分離されるであ
ろう距離が大きくなることが認められよう。同時に、バ
ンドの拡張が生じ、従って長さを増すことによっては解
像度は改善されない。これらの要素から、通路の長さに
は実用上の制限が示唆されるが、必要に応じてより長い
ものあるいはより短いものも使用できる。例えば、約５
cmという短い通路の長さで良好な結果が得られる。同様
に、数ｍより長い通路の長さによる多くの通常の分析用
セッティングでは、通路中の輸送時間が不便なことに長
くなる。一般に、約10cmから約200cmでの通路の長さ、
特に約40cmから150cmまでの通路の長さが好ましい。よ
り長い通路や短い通路、例えば４または５ｍまで長い通
路あるいは約５cmまで短い通路も使用でき、本発明の思
想に反しないことはいうまでもない。

【００３５】細長い通路は、耐久性を有し支持電解質と
接触しても物理的にもとの状態を保持し、また界面動電
電位を印加した際に伝導される電気が無視できまた生じ
る熱も無視できるように実質的に絶縁性であり、しかも
その内面に陽電荷あるいは陰電荷を帯びることができ
る、という性質を有する材料で構成される。適切な材料
としては、通路およびそれに含まれる電解質のコンダク
タンスの好ましくは少なくとも約95％が電解質によるよ
うなコンダクタンスを有するものであろう。さらに、検
出用に通路内に含まれる通過液体から螢光が放射され得
るように、通路の一部は半透明である必要がある。通路
の半透明部分はまた、必要に応じて、試料にコヒーレン
ト励起エネルギーをインプットするための入口として使
用することもできる。離れた半透明検出領域断片を用い
これに通路を連結することも可能であるが、この場合、
半透明断片への通路の連結は、連結を越えて界面動電電
圧を印加した時に過度の過熱あるいはアークが生じない
ように、または液体の流れに乱れが生じないように、行
う必要がある。本来その中に半透明部分を有する連続通
路を用いればこれらの問題は回避できる。石英、ガラス
および融解石英のような無機物質、およびテフロン（登
録商標）(ポリテトラフルオロエチレンおよびフッ化エ
チレン／プロピレン重合体)、ポリクロロトリフルオロ
エチレン、アラミド、ナイロン(ポリアミド)、ポリビニ
ルクロライド、ポリビニルフルオライド、ポリスチレ
ン、ポリエチレン等のような有機物質が使用できる。

【００３６】発明の背景の節で指摘したように、電気浸
透的な流動は、通路の内面が荷電分子を運んだり吸着し
たりすると達成される。この内面は、より多くの陽電荷
が付与されるようにその表面を酸性液に接触させたり、
より多くの陰電荷が付与されるようにその表面を塩基性
物質に接触させたり、あるいは電荷数を減らすためにそ
の表面をシリル化剤に接触させたりなどして、改変して
その電荷を変えることができる。(トリメチルシランを
使用して狭通路電気泳動領域壁上の電荷密度を減少さ
せ、これにより領域中の輸送を変化させることの記述に
ついては、Analytical Chemistry、53、No.8、July 198
1、1298を参照のこと)当業者に周知の他の表面改変技術
も同様に使用できる。

【００３７】試料を通じて印加される電圧は、過度に加
熱されることなく識別可能な界面動電的挙動が生じるの
に有効な電圧でなければならない。一般に約1000V より
低い電圧では小さすぎ、また約 100kVより高い電圧は従
来の高圧電源では一般的でない。これら実用上の制限に
基づけば、約３kVから約90kVまでの電圧、特に約５kVか
ら約60kVまでの電圧が好ましい。電位の極性により、電
気的に帯電された分子の移動方向が決定される。安全性
の理由から、接地電位での分析系をできるだけ多く持つ
ことが好ましい。

【００３８】通路には、電気浸透的に輸送可能な支持液
が充填される。液体が電解質であれば、すなわちそれが
電気的に帯電された分子を充分含むかあるいは運ぶかし
て電流を通すならば、液体は電気浸透的に輸送可能であ
る。典型的な電気浸透的輸送可能な支持液は、例えば１
ｌあたり少なくとも約0.0005モルのイオン性分子を、好
ましくは１ｌあたり約0.001から約10モルのイオン性分
子を含む。このようなレベルにより、高速度の界面動電
的輸送が得られる。最も一般的には、支持液は水をベー
スにしたものか、あるいは混合された水−有機液体系を
ベースにしたものである。混合系は、水だけでは溶解度
が限られている有機標的物質を可溶化あるいは懸濁する
のを助けるのに有用となり得る。電気を伝導し得る適切
な有機液体も使用できる。支持電解質で用いる代表的な
材料には、水、および水と混和可能な１つ以上の有機物
質を水に混合して成る混合溶媒がある。水と混和可能な
有機物質としては次のようなものがある：酢酸、プロピ
オン酸、クロル酢酸などの低級(例えば、１〜４炭素原
子)アルカン酸；メチルアミンのような一級および二級
の低級アルキルアミン；エタノール、メタノールおよび
プロパノールのような低級アルコール；低級アルカンジ
オールのような低級ポリオール；アセトニトリル、ピリ
ジン、ピペリジンおよびキノリンを含む含窒素液体；ア
セトンおよびメチルエチルケトンのような低級ケトン；
ＤＭＦ、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−エチルホルムア
ミド、Ｎ−エチルアセトアミドなどのような低級アルキ
ルアミド。これら物質は代表例にすぎない。実際には、
それ自身電解質であるかまたはイオン性分子を運んで導
電性となり得るどんな液体も使用できる。これら液体の
どれを用いても、支持液には、塩、キレートおよび他の
錯体のような付加イオン性物質、酸、塩基および緩衝液
などが含まれてよい。液体が界面動電通路中を通過する
際のpHで両性イオンである付加イオン性分子を用いるの
がしばしば好ましい。代表的な物質には、無機酸のアル
カリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびトランザクショ
ン金属塩；有機酸のその様な塩；その様な酸のアンモニ
ウム塩および有機塩基塩；ハロゲン酸、有機酸およびそ
の他の酸；金属酸、金属水酸化物、アミンおよび他の塩
基などがある。典型的な両性イオンには、アミノ酸、お
よびシグマケミカル社、セントルイス、ＭＯで市販され
ているGoodの緩衝液がある。これらの付加イオン性物質
あるいはイオン化可能な物質は、それらの主機能が支持
電解質の導電性を増すことにあるので、それらが試料お
よび支持電解質中の他の成分と和合可能である限り、一
般に以上の広範なクラスから随意に選んでよい。

【００３９】１つの応用として、本発明はキラル支持電
解質を用いて、混合キラル化合物を鏡像異性体へ分離し
またこの分離を検出する。キラル支持電解質は上述の基
準を満たす液体であるが、また、鏡像異性体の混合物の
１メンバーと選択的に相互作用してそれに混合物の他の
メンバーと異なる界面動電的移動度を優先的にもたらす
であろう１つ以上のキラル分子を含有するという性質を
も有する。界面動電的可動性の修飾は、１つの鏡像異性
体に荷電分子を選択的に結合させる形になり得る。また
それは、いくつかの荷電鏡像異性分子の１つの電荷密度
を、それに帯電していない嵩高い基を選択的に結合させ
ることによって、あるいは１鏡像異性体が支持電解質の
荷電分子に結合する能力あるいはそれを引きつける能力
を変えるような基を選択的に結合させることによって、
変える形になり得る。キラル支持電解質成分として有用
な様々な物質は、文献中の他のセッティングで記載され
ている。例えば、ここで引用文献として採用する Enant
iomers、Racemates、and Resolutions by J. Jacques、
et al.、John Wiley & Sons、New York、1981を参照の
こと。キラル支持電解質中の含有物に対する適当なキラ
ル分子には、例えば、以下のキラルアニオン、キラルカ
チオン、キラル錯体が包含される。このキラルアニオン
には、例えば、(＋)カンファー−10−スルホン酸のアニ
オン、(＋)ショウノウ酸、(−)ジベンゾイル酒石酸、
(＋)および(−)ｄ−(２、４、５、７−テトラニトロフ
ルオレニリデンアミノオキシ)プロピオン酸(ＴＡＰ
Ａ)、ジアセトンケログロン酸、(＋)および(−)マンデ
ル酸、(−)マレイン酸、(＋)および(−)酒石酸、(＋)お
よび(−)３−ブロモカムフォア−９−スルホン酸などの
アニオンがある。このキラルカチオンには、例えば、ブ
ルシン、キニン、ストリキニン、(＋)および(−)エフェ
ドリン、(−)−２−アミノ−１−ブタノール、(＋)およ
び(−)ｄ−メチルベンジルアミン、(＋)および(−)エフ
ェドリンなどのカチオンがある。キラル錯体には、例え
ば、１−アスパルチル−１−フェニルアラニンメチルエ
ーテルの銅(II)および亜鉛(II)錯体(市販の人工甘味
料、アスパルタミン)；１−プロリン、１−ヒスチジン
および１−ピペコン酸の銅(II)錯体；およびＬ−２−ア
ルキル−４−オクチルジエチレントリアミンの亜鉛(II)
錯体などがある。

【００４０】キラル支持電解質に包含されるキラル分子
の前述のリストは代表例にすぎない。分析しようとする
物質グループの１メンバーと選択的に相互作用すること
により物質グループのメンバーの界面動電的可動性を差
動的に変える、他のどんなキラル分子も同様に使用でき
る。包含されるキラル分子の選択にあたっては、鏡像異
性混合物の分解能に関する当分野の教示、特にジアステ
レオ異性体の形成によるそのような分解能に関する教示
に従うことがしばしば有利となり得る。

【００４１】本発明は、レーザ励起螢光の検出を用い
て、界面動電的に輸送される標的分子の存在を決定する
ものである。“螢光性”および“螢光”という用語はこ
こでは、長命および短命の光ルミネセント分子を含むよ
うに、すなわち“燐光性”あるいは“螢光性”と考えら
れるかもしれない物質を含むように、また“燐光”ある
いは“螢光”と考えられるかもしれない放射を含むよう
に、広く用いられる。

【００４２】検出される放射螢光の変化は、螢光標的分
子が検出領域を横切る場合は螢光の増加であり得る。こ
の変化は、消滅分子あるいは“透明”分子が螢光バック
グラウンド存在下で検出領域を横切る場合は、螢光の減
少であり得る(H. Small、etal.、Anal. Chem.、54(198
2)、462-469.参照)。それはまた、螢光分子のスペクト
ル特性あるいは一時特性の変化でもあり得る。検出され
る放射螢光スペクトルの変化は、特別なアクセプタンス
波長帯における螢光強度の変化であり得、これは標的分
子が検出領域を通過して、この特別なアクセプタンス波
長帯域内へあるいはその帯域外にシフトされた螢光を有
することにより生じる。このような波長のシフトは、標
的分子内での分子内会合などにより生じ得る。図３に示
されるように、このアクセプタンス帯は、高域カットオ
フフィルタおよび高速(ハイライトスループット high l
ight throughput)モノクロメーターのような波長帯域フ
ィルタにより容易に限定し得る。一時特性の変化は、例
えば螢光の寿命の増加或いは減少であり得る。それはま
た、螢光の偏極あるいは角分布の変化でもあり得、これ
は分析上重要な結果であることが M.Jolley、J.Anal.To
x.、５(Sept/Oct1981)、236.により示されている。

【００４３】螢光あるいはその等価物における上述の変
化はいずれも検出事象として使用し得るが、螢光におい
て最も一般的に研究される変化、従って本発明における
好ましい変化は、螢光分子が検出領域を横切る際に生じ
る螢光の増加である。測定されている標的分子が本来螢
光性のものであってよい場合もあるが、一般的には標的
分子に螢光標識を共有的に付けるかもしくは他の方法で
結合させる。螢光標識は、試料が界面動電通路内に置か
れた時に、標的分子に付けたり結合させたりすることが
できる。あるいは、界面動電通路中を分子が通過する間
に、螢光標識と標的分子は相互作用し得る。この通過中
の相互作用には、標的分子と支持液中あるいは界面動電
通路壁内の物質との反応が含まれ得る。それはまた、標
的分子を含む電気化学的反応によっても生じる。いずれ
にしても、標的が検出領域中を界面動電的に移動しそし
て検出事象がコヒーレント放射により励起された螢光の
変化にある限り、標的、標識および条件のいかなる組合
せを用いることも本発明の範囲内にある。

【００４４】広範囲の螢光標識が公知である。代表的な
通常の螢光標識には、以下のような主要な官能性物質を
含む物質が包含される。この官能性物質には、例えば、
１−および２−アミノナフタレン、p、p'−ジアミノス
チルベン、ピレン、四級フェナントリジン塩、９−アミ
ノアクリジン、アントラセン、オキサカルボシアニン、
メロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビス
−ベンゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼ
ン、１、２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３
−アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイ
クリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニ
ルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キ
サンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、
サリチル酸塩、ストロファンチジン、ポルフィリン、ト
リアリールメタン、希土類金属キレート、およびフラビ
ンがある。

【００４５】結合に対する官能性物質を有するか、ある
いはこのような官能性物質を含むべく調製され得る個々
の螢光化合物には、例えば、以下の化合物が包含され
る。この化合物には、ダンシルクロライド、フルオレセ
イン、フルオレセインイソチオシアネートのようなフル
オレセイン類、３、６−ジヒドロキシ−９−フェニルキ
サントヒドロール、ロ−ダミンイソチオシアネート、Ｎ
−フェニル−２−アミノ−６−スルホナトナフタレン、
４−アセトアミド−４−イソチオシアネートスチルベン
−２、２’−ジスルホン酸、ピレン−３−スルホン酸、
２−トルイジノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−フ
ェニル、Ｎ−メチル−２−アミノナフタレン−６−スル
ホネート、エチジウムブロマイド、アテブリン、オ−ラ
ミン−Ｏ、２−(９’−アントロリル)パルミチン酸塩、
ダンシルホスファチジル−エタノールアミン、Ｎ、Ｎ’
−ジオクタデシルオキサカルボシアニン、Ｎ、Ｎ’−ジ
ヘキシルオキサカルボシアニン、メロシアニン、４−
(３’−ピレニル)ブチレート、ｄ−３−アミノデスオキ
シエキレニン、12−(９’−アントロイル)ステアレー
ト、２−メチルアントラセン、９−ビニルアントラセ
ン、２、２’−(ビニレン−ｐ−フェニレン)−ビス−ベ
ンゾキサゾール、ｐ−ビス[２−(４−メチル−ｔ−フェ
ニルオキサゾリル)]ベンゼン、６−ジメチルアミノ−
１、２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス(３’−
アミノピリジニウム)−１、10−デカンジルジヨーダイ
ド、ヘレブリゲニンのスルファナフテイルヒドラゾン、
クロロテトラサイクリン、Ｎ−(７−ジメチルアミノ−
４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル)マレイミ
ド、Ｎ−［ｐ−(２−ベンズイミダゾリル)−フェニル]
マレイミド、Ｎ−(４−フルオラニチル)マレイミド、ビ
ス(ホモバニリン酸)、リザザリン、４−クロロ−７−ニ
トロ−２、１、３−ベンゾオキサジアゾール、メロシア
ニン540、レゾルフィン、ローズベンガル、ユウロピウ
ムおよびテルビウムのポリアミン−ポリ酸錯体、および
２、４−ジフェニル−３(２Ｈ)−フラノンがある。

【００４６】螢光分子は、約200nmを越える光を吸収す
べきことが望ましく、好ましくは約300nmを上まわる、
特に好ましくは約400nmを上まわる光を吸収すべきであ
り、通常、吸収されるコヒーレント光の波長より高い10
nmを上まわる波長で放射する。フルオロフォア(fluorop
hore)は標的に共有的あるいは非共有的に、また直接あ
るいは間接的に結合され得る。共有結合される場合は、
その特別な結合基は結合される２部分の性質およびそれ
ら個々の機能に依るであろう。多くの結合基および結合
法が文献中に教示されている。

【００４７】結合はまたレセプターを用いても達成され
得る。例えば、抗原のフルオロフォアは、抗原に対する
レセプター、例えば抗体の仲介により標的に結合されよ
う。レセプターは次々に共有的あるいは非共有的に、例
えば吸着により結合されよう。

【００４８】本発明を用いて分離され測定される標的分
子は、螢光標識できてしかも支持液中に懸濁あるいは溶
解させ得る物質から、実質的には制限なく、選択され得
る。最も一般的には、標的分子は生物学的に、生態学的
にあるいは化学的に興味深い物質であろう。

【００４９】標的分子は、ポリアミノ酸、すなわちポリ
ペプチドや蛋白；多糖類；ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＤＮＡ
断片のような核酸やオリゴヌクレオチド；およびそれら
を組み合わせたような巨大分子であり得る。このような
組合わせの集団には、細菌、ウイルス、染色体、遺伝
子、ミトコンドリア、核、細胞膜などがある。

【００５０】広範な蛋白およびポリペプチドは、構造上
の類似した特徴、特別な生物学的機能を有する蛋白、特
定の微生物、特に病因となる微生物に関連する蛋白、な
どにより分類される。

【００５１】以下に構造上関連のある蛋白のクラスを示
す：プロタミン、ヒストン、アルブミン、グロブリン、
硬蛋白、リン蛋白、ムコ蛋白、色素蛋白、リポ蛋白、核
蛋白、糖蛋白、プロテオグリカン、分類されない蛋白、
例えばソマトトロピン、プロラクチン、インシュリンお
よびペプシン。

【００５２】ヒト血漿中には多くの可能な標的蛋白が存
在することは言うまでもなく、これらは臨床的に重要で
以下のものが含まれる：プレアルブミン、アルブミン、
α₁−リポ蛋白、チロキシン結合グロブリン、Ｇ_c−グロ
ブリン(Ｇ_c1-1、Ｇ_c2-1、Ｇ_c2-2 )、コリンエステラ
ーゼ、ミオグロビン、トランスフェリン、フィブリノー
ゲン、イムノグロブリンＧ(IgＧ)、イムノグロブリンＡ
(IgＡ)、イムノグロブリンＭ(IgＭ)、イムノグロブリン
Ｅ(IgＥ)あるいはγＥ−グロブリン(γＥ)、補足因子、
血液凝固因子、例えば副甲状腺ホルモン(パラトルモ
ン)、インシュリン、グルカゴン、ソマトトロピン(成長
ホルモン)、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン(間細
胞刺激ホルモン)、ゴナドトロピン、セクレチンおよび
ガストリンを含むペプチドホルモンや蛋白ホルモン。

【００５３】他の興味深い巨大分子標的物質は、腸内細
菌、サルモネラ、シガエラ(赤痢菌)、プロテウス種、パ
ストゥーレラ、ブルセラ、好気性の胞子形成バチルス、
嫌気性の胞子形成バチルス、ミコバクテリア、放線菌類
(菌類様細菌)、スピロヘータ、マイコプラズマなどのよ
うな微生物に由来あるいは存在するムコ多糖類や多糖類
である。

【００５４】他の標的分子には次のものが含まれ得る：
リケッチア(細菌様寄生動物)、クラミディア、菌類およ
びウイルス(アデノウイルス、ポックスウイルス、ミク
ソウイルス、レオウイルスタイプ１−３、肝炎ウイルス
および癌ウイルスを含む)。

【００５５】単量体のあるいはより小さい標的物の分子
量は、通常約75から20,000、より一般には100から3,000
であろう。興味深い標的物としては、薬剤、代謝物、殺
虫剤、汚染物質などがある。モルフィンアルカロイド
(モルヒネ、コデイン、ヘロイン、コカイン、ベンゾイ
ルエクゴニン等)、エルゴットアルカロイド、ステロイ
ドアルカロイドなどのようなアルカロイドもこれらに含
まれる。

【００５６】他の興味深い薬剤には以下の物がある：エ
ストロゲンおよびアンドロゲンを含むステロイド；副腎
皮質ステロイド；胆汁酸；強心配糖体；ジゴキシンおよ
びジゴキシゲニンを含むアグリコン；バルビツル酸塩、
例えばフェノバルビタールおよびセコバルビタール；ア
ンフェタミンを含むアミノアルキルベンゼン；カンナビ
ノールおよびテトラヒドロカンナビノール、ビタミン、
プロスタグランディン、抗生物質、ヌクレオシドおよび
ヌクレオチド。

【００５７】他のグループの標的化合物はアミノ酸およ
び小ペプチドであり、これにはポリヨードチロニン、例
えばチロキシン、およびトリヨードチロニン、オキシト
シン、ＡＣＴＨ、アンジオテンシン、met-およびleu-エ
ンケファリン、それらの代謝物および誘導体が含まれ
る。

【００５８】フルオロフォアは、標的物上の水素あるい
は他の置換可能な官能性物質を結合手あるいは結合基で
置き換えることにより、標的分子に付けられ得る。標的
物上の基としては、水酸基、アミノ基、アリール基、チ
オ基、オレフィン基などがあり得る。結合基は通常は水
素以外に１から20原子を有するであろう。これら原子は
一般には、炭素、酸素、硫黄、窒素および原子番号17か
ら35のハロゲンである。結合基に存在する結合官能性物
質としては、カルボニル(オキソ型および非オキソ型の
両方)、活性ハロゲン、ジアゾ、メルカプト、エチレン
特に活性化エチレン、アミノなどが含まれる。ヘテロ原
子(すなわち水素原子や炭素原子でない)の数は通常約０
〜６の範囲、より一般には約１〜６、好ましくは約１〜
４の範囲であろう。

【００５９】たいていの場合、結合基は脂肪族であろう
が、ジアゾ基とともに、芳香族基も含まれる。一般に、
結合基は、その鎖中に約１〜10原子、より一般には約１
〜６原子を有する二価の鎖である。酸素は通常、炭素や
水素に結合して、好ましくは炭素のみに結合して、オキ
ソまたはオキシとして存在するであろう。これに対し窒
素は通常、炭素のみに結合してアミノとして、あるいは
アミドとして存在するであろう。また硫黄は酸素に類似
するであろう。

【００６０】結合基および結合される分子間の共有結合
形成における一般的な官能性物質はアルキルアミン、ア
ミド、アミジン、チオアミド、ウレア、チオウレア、グ
アニジンおよびジアゾである。

【００６１】ポリペプチドとの結合に特に適用される結
合基には、カルボン酸を含む結合基がある。このカルボ
ン酸は、ジイミドと結合して、または炭酸モノエステル
と混合した無水物として、または活性カルボン酸エステ
ル(例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはｐ−
ニトロフェニル)として用いられる得る。イミドエステ
ルとしては窒素類似物が使用され得る。還元的なアミノ
化条件下(例えば、水素化ホウ素の存在下)では、アルデ
ヒドは、イミンを形成してアルキルアミンを生成するべ
く用いられ得る。使用可能な他のオキソ型でないカルボ
ニル基には、イソシアネートやイソチオシアネートが含
まれる。さらに活性アシル基、特にブロモアセチル基も
使用され得る。

【００６２】たいていの場合には、標的には１つまたは
それ以上の官能基を有する。この官能基は結合基と結合
するための部位として作用し得る。特に、ヒドロキシル
基、アミノ基およびアリール基(とりわけ活性アリール
基)が使用に供される。また、オキソ官能性物質とヒド
ロキシル基(これは、カルボキシメチル基のような結合
基と結合するための部位として用いられる)とから、オ
キシムが調製され得る。

【００６３】結合基の選択は広範囲にわたって変えら
れ、これは、フルオロフォア中やこのフルオロフォアが
結合し得る化合物中に存在する官能性物質、所望の結合
基の性質や長さなどに依存している。

【００６４】本発明は、界面動電的場における分子の相
対的移動に基づいて、分子の分離を成すものである。支
持電解質(発明の背景を参照のこと)の正味過剰な電荷と
同じ電荷を有する分子は、支持電解質より速く移動する
傾向にあるだろう。帯電していない分子は支持電解質の
速度で移動するであろうし、また反対の電荷を有する物
質は支持電解質より遅く移動するであろう。

【００６５】分離の条件は非常に非回避的である。これ
により、分子の他の性質を使って分離を行うことが可能
となる。例えば、ある分子を他の荷電分子に選択的に結
合して、この最初の分子に電荷を付与することができ
る。

【００６６】これは、この２つの分子の疎水性を釣り合
わせることによって、例えば第１の荷電物質のミセル状
分散を作り次いで第２の帯電していない物質をこのミセ
ルに選択的に結合させることによって、行うことができ
る。これにより事実上第２の物質に電荷が付与されるで
あろう。他の技術としては、混合液のpHを変えて、混合
液中のある分子を選択的にプロトン化あるいは脱プロト
ン化することによりその界面動電的可動性を変えること
が可能である。

【００６７】本発明では、オンカラムに供給されたコヒ
ーレント放射源、すなわちレーザを使って螢光性分子を
励起している。連続レーザあるいはパルスされたレーザ
が使用できる。約20Ｗまでのような低パワーから中パワ
ーのレーザで良好な結果が得られる。必要に応じてより
高パワーのレーザも使用できるが、利益をもたらすこと
は見出されておらず、しかも試料を不必要に加熱すると
いう欠点を有する可能性がある。コヒーレント光源の波
長は、測定されている螢光分子の励起波長とマッチさせ
る必要がある。すなわち、それは螢光を励起するのに有
効な波長であるべきである。

【００６８】コヒーレント光を使うことは、それがレン
ズやミラーによって、より重要なことには、ファイバ光
学部品によっても同様に、直接試料通路に効率良く便利
に与えられるという重要な利点をもたらす。

【００６９】コヒーレント励起エネルギーのビームは、
試料の流れを横切るように試料に加えることができ、あ
るいは必要に応じて、液体の流れの方向と同軸に、ある
いは流れ方向に逆らって加えることもできる。螢光の測
定は従来の測定法を用いて行われる。これらは連続測
定、もしくは間欠測定すなわち時間ゲート測定であり得
る。これらの測定は螢光放射のある選択された波長で行
われる。測定は、試料通路上の励起が生じるのと同じ地
点で、あるいは励起地点より下流で、行なってよい。長
寿命のフルオロフォア(例えば、螢光性物質)の場合に
は、あるいは励起が流れとともに伝達されてあるいは流
れと逆に伝達されて供される場合は、下流で測定するの
が有利である。励起や検出のための角度は同平面でよ
く、あるいは必要に応じて変えることにより干渉、反射
などを除いてもよい。

【００７０】螢光検出器で生じた信号は記録され、また
/あるいはそれは制御信号として使用される。記録は標
準チャート式記録計などにより行い得る。制御信号は、
例えば予備環境中の螢光性分子を捕らえるあるいは集め
るようにバルブを開閉するために利用できる。

【００７１】

【発明の効果】界面動電分離プロセスとコヒーレント放
射源との組合せにより、高感度の分析方法および装置が
提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】電気浸透輸送のプロセスを説明するための液で
充たされた管の断面図である。

【図２】界面動電分離のプロセスを説明するための液で
充たされた管の断面図である。

【図３】本発明を実施するための装置の一例の一部をブ
ロックで示す説明図である。

【図４】本発明で用いられるオンカラム光学螢光測定セ
ルの一例の断面図である。

【図５】本発明を用いて得られ、検出された分離を示す
代表的な２例の通電クロマトグラフィ(エレクトロフェ
ログラム)を示す図である。

【符号の説明】

10 管 11 導電液 12 陽イオン 13 アニオン 14 電気二重層 15、16 電極 18、19 荷電分子 30 キャピラリ 32 半透明部 34 供給容器 35 流出容器 36 電源 37、39 電極 40、41、56 配線 42 フローセル 44、45 継手 46 レーザ 47 レンズ 49、51 ファイバ 50、52 位置決めヘッド 53 カットオフフィルタ 54 モノクロメーター 55 光電子増倍管 57 記録計 58 容器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者エルンストガスマンスイス連邦シーエイチ−4058 バーゼル，ペーテルロット−ストラーセ 102 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 DA05 EA01 EA02 GA03 GB03 GB09 GB19 HA01 HA05 JA01 JA02 JA03 KA02 KA03 KA09 LA02 2G057 AA04 AB03 AB04 AC01 BA05 BB02 BC05 CA01 DB03 DC06 DC07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電気的に輸送可能な液体試料の分子の存
在を検出するための蛍光アッセイ法であって、蛍光特性
が該分子の存在で変化し、該方法は以下の工程を包含す
る：（ａ）電解質を含む、小径の、両端開口の、壁を有する
通路の一端に、該試料を配する工程、ここで、該通路の
少なくとも一部が半透明であり、（ｂ）該試料に対して
充分な電位を印加し、それによって該試料が該通路内を
輸送されるようにする工程、（ｃ）該半透明部に、該分
子が存在するとき蛍光特性に変化を起こすのに有効な波
長のコヒーレント放射を照射する工程、及び（ｄ）該分
子が該半透明部を通過する際の該通路の該半透明部で発
せられる蛍光中の変化を検出する工程。