JP4901475B2 - 電気泳動用担体 - Google Patents

Description

本発明は、電気泳動法、特に蛍光標識生体分子の分離に使用されるヒドロゲル用の低蛍光性電気泳動用担体に関する。さらに詳しくは、本発明は、特定のポリマーフィルムのこの目的での使用に関する。

電気泳動は、長い間、荷電分子を電場の影響下で泳動速度の違いに従って分離させるために使用されてきた。

通常、分子は、電気泳動後のゲル中で、多かれ少なかれ選択的色素染色によって、又はコロイド金属粒子の沈殿によって染色される。分離対象の分子は、電気泳動後の検出のため、例えば放射活性標識又は蛍光標識を付けることもできる。今日では、放射活性の使用を避けて、蛍光標識を使用するのが最も一般的である。しかし、電気泳動用スラブゲルを担持するために使用される電気泳動用担体は、多くの場合本質的に検出手順を乱す蛍光体である。

ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）など一般に使用される電気泳動用担体フィルムは、相対的に多量の蛍光標識生体分子の場合には十分に機能するが、スラブゲル電気泳動後の少量の生体分子の場合には検出を混乱させ、妨害する。これは、例えば診断アッセイにおいて偽陰性結果を招く恐れがあるので、例えば生体試料中の非常に少量の生体分子を検出できることは極めて重要である。別の事例は、アルブミンなど極めて豊富に存在するタンパク質に比べて、薬理学的に興味深いタンパク質の多くが非常に低濃度で存在する薬剤研究に見られる。

この問題を解決するために、ガラスの電気泳動用担体が使用されている。ガラスによって、少量の蛍光標識試料の画像形成が可能となる。しかし、電気泳動用担体としてのガラスは、スペース、重量、安全性の理由で望ましくない。さらに、電気泳動用ガラス担体は、予め膨潤させてすぐに使用できるゲルを多量に生成するには適していない。脆弱でなく、少量の試料の蛍光検出を可能にし、最低限のスペースしか占有しない、予め膨潤させてすぐに使用できるゲルを有することは望ましいはずである。

したがって、スラブゲル電気泳動後の蛍光標識生体分子の検出における蛍光バックグランドの問題は、依然として解決する必要がある。

米国特許第４４１５４２８号では、例えばポリプロピレンのプラスチックフィルムを含む電気泳動用媒体向けの担体が記述されている。この担体フィルムは、生体分子の蛍光検出のためのものではなく、このような検出に適応していない。

国際公開第９８２３９５０号では、電気泳動用担体ポリアクリルアミドゲルが記述されている。この担体は、蛍光標識の検出に関して干渉しないことが好ましい。ガラスはプラスチックとは違って、蛍光画像形成を損なうか妨害するスペクトル活性がないので、ガラス担体は、この目的に適していることが述べられている。

米国特許出願公開第２００２／００５６６３９Ａ１号では、キャピラリー電気泳動を実施するための方法及び装置が記述されている。キャピラリー電気泳動は、電気浸透流を回避するためにノルボルネン系ポリマー表面を有するマイクロチャネルで実施する。キャピラリー電気泳動では、キャピラリー表面への付着は必要でない。
米国特許第４４１５４２８号公報 国際公開第９８２３９５０号パンフレット 米国特許出願公開第２００２／００５６６３９号明細書

本発明の一目的は、バックグラウンド蛍光がまったくないか又は極めて少ししかない低蛍光性電気泳動用スラブゲル担体を提供することであった。

別の目的は、ガラスが脆弱で、重く、生産経済上の欠点が多数あるので、ガラスのこの目的での使用を回避することであった。

別の目的は、低蛍光性電気泳動用スラブゲル担体及びヒドロゲルを含む、すぐに使用できる複合材料を提供することであった。

第１の態様では、本発明は、次式を有するポリマーのスラブゲル電気泳動向けの電気泳動用ヒドロゲルの低蛍光性担体フィルムとしての使用に関する。

式中、
ｎ＝０〜１０００００
ｍ＝０〜１０００００であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４＝水素、ハロゲン、メチル基、又は（枝分れ又は環状構造を含んでいてもよい）非芳香族炭化水素鎖であり、
Ｘ、Ｙ＝メチレン基、又は（枝分れ又は環状構造を含んでいてもよい）非芳香族炭化水素鎖であり、
Ｙは、存在しなくてもよい。

好ましい使用は、２Ｄ電気泳動の二次元目であり、ヒドロゲルは、予め膨潤させてすぐに使用できるヒドロゲルであることが好ましい。

上記の式の好ましいプラスチックフィルムは、
ポリプロピレン：Ｒ１＝ＣＨ３、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり、二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）が最も好ましい。

ポリプロピレンを使用する場合、その光学的透明性が蛍光検出中の光散乱効果（ヘイズ）を回避するほど十分に高くなるように、ポリプロピレンを延伸しなければならない。延伸（好ましくは、二軸）によって、フィルムの剛性も増大し、酸素バリア性も向上する。延伸度は、例えば、複屈折、二色性、振動分光法、又はＸ線散乱法によって測定することができる。

他の代替ポリマーは、
ポリクロロトリフルオロエチレン（Ａｃｌａｒ（商標）とも呼ばれるＰＣＴＦＥ）：Ｒ１＝Ｃｌ、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｆ、
ポリシクロオレフィン：

例えば、
Ｚｅｏｎｅｘ（商標）：ｎ＝０、Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ
Ｚｅｏｎｏｒ（商標）、ＴＯＰＡＳ（商標）：Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈである。

本発明によれば、プラスチックフィルムは、上記のポリマーのうちの１種、好ましくはＢＯＰＰで作製される。フィルムは、透明であり、ヘイズ値は３％未満である。フィルムは、適切な柔軟性、すなわち、曲げ弾性率１３００〜２５００ＭＰａを有している。

フィルムは、バリア（非蛍光性）層で被覆され、得られた積層物は酸素透過性が非常に低い。これによって、酸素のフィルムからモノマー溶液への拡散によるアクリルアミド重合阻害がなくなる。バリア層は、ゲル接着性であることも好ましい。良好なバリア特性、及びゲル接着特性を有するアリルグリシジルアガロースが好ましい。

或いは、別々のバリア層及び接着層、例えば酸素バリア層として働くガラスコーティング、及びゲル接着層として働くシランコーティングを使用する。

この積層物は、ゲルとの直接接着を可能にする炭素−炭素二重結合が、バリア層材料に本来存在する、又は層表面での化学反応に起因することによってバリア層表面に存在していることが好ましい。

酸素に対する特に良好なバリア特性は、ポリ塩化ビニリデン、アクリロニトリルコポリマー、芳香族ポリアミド、ポリエチレンナフタレナート、エチレン−ビニル−アルコールコポリマーなどのポリマーのフィルムから得られる。また、金属、金属酸化物、ダイヤモンドライクカーボンなどの無機材料の緻密な極薄フィルムは、極めて良好な酸素バリア性を有する。

ヒドロゲル（例えば、ポリアクリルアミドゲル）は、バリア／接着層表面に対して良好に接着して、表面に重合する。ヒドロゲルは、アガロースゲルでも、アクリルアミド誘導体ゲルでもよい。

第２の態様では、本発明は、上記に記載するポリマーフィルム及びヒドロゲルの複合材料に関する。

この複合材料は、二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）の担体ポリマーフィルム、アリルグリシジルアガロースのバリア／接着層、及びポリアクリルアミドのヒドロゲルを含むことが好ましい。

取扱いを容易にするためには、ＢＯＰＰフィルムの厚さは、９０μｍなど８５μｍを超えるものであることが好ましい。第３の態様では、本発明は、二次元目用として上記に記載する複合材料、及び一次元目用としてＩｍｍｏｂｉｌｉｂｅ Ｄｒｙ ｓｔｒｉｐ（商標）を含む２Ｄ電気泳動用キットに関する。二次元目を行う場合には、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ Ｄｒｙ ｓｔｒｉｐを適切な密封剤で複合材料に密封する。

このヒドロゲルは、予め膨潤させておき、キットは、さらにゲル貯蔵を、膨潤させた状態で安定に維持するＮ−ピペリジノ（又は、Ｎ−ピロリジノ）プロピオンアミド（ＰＰＡ）緩衝剤を含むことが好ましい。

本発明は、また２層（酸素バリア層とゲル接着層）を積層したポリマーフィルム、及びヒドロゲルの複合材料にも関する。

このフィルム−ヒドロゲル複合材料を、生体分子（特に、タンパク質、ペプチド、及びヌクレオチド）の電気泳動分離、その後の蛍光検出に使用する。

実験の部
１．遮断／ゲル接着材料（アリルグリシジルアガロース）の合成：
アガロース（１０グラム）を、沸騰水４９０ｍｌに溶解する。溶液を８０℃に維持する。１．６７ｇの水素化ホウ素ナトリウムを、１４Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍｌに添加し、次いで絶えず撹拌しながら、アガロース溶液に添加した。１０分後に、１０％水酸化ナトリウム溶液１００ｍｌを添加し、続いてアリルグリシジルエーテル２５ｍｌを１５分間かけて滴下する。１時間後に、さらにアリルグリシジルエーテル２５ｍｌを以前と同じようにして加え、さらに１時間反応させる。反応混合物を６０℃に冷却し、次いで４Ｍ酢酸を添加して中和する。

この溶液を、３倍容のアセトンに撹拌しながら徐々に添加して、白色沈殿物を得る。溶媒をデカンテーションで除去し、沈殿物を水に溶解し、溶液をアセトン中で再び沈殿させた。この手順を５回繰返し、最終沈殿物をろ紙を用いてろ過することによって回収した。生成物を６０℃でオーブン乾燥し、粉末に粉砕した。

２ａ．遮断／ゲル接着層のプラスチックフィルムへのコーティング：
二軸延伸ポリプロピレン（ＯＰＰ Ｃ５８、ＵＣＢフィルム）（ガラスコーティング付きと無しの両方）、ＰＥＴ、Ａｃｌａｒ １１Ｃ（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ）、及びＺｅｏｎｏｒ １４２０Ｒ（Ｚｅｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にコーティングを行った。上記に述べたプラスチックのシートを、Ｐｌａｓｍａ ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃのＰＩＣＣＯＬＯ ＲＦ駆動反応器を用いて、以下の条件下でプラズマ処理した：ＲＦ電力２４０ワット、酸素流量１８０ｓｃｃｍ、３分。プラズマ処理に続いて、フィルムを、１−％アリルグリシジルアガロース水溶液でコーティングした。コーティングは、渦巻形ロッドアプリケータを使用して、湿潤厚３６μｍに調製した。

次いで、フィルムを温度１００℃のオーブン中に２０分維持して、水を蒸発させる。コーティングを加熱処理した後、冷凍機に入れて、強制的にアリルグリシジルアガロースのコーティングをゲル化する。

２ｂ．プラズマ反応によるガラスコーティング
コーティングプロセスを、４つのパラメータを用いた要因実験として行った。テトラメチルジシロキサン（ＴＭＤＳＯ）流量、酸素流量、時間。低から高まで変えて評価した。ＴＭＤＳＯ流量は、１５から２０ｓｃｃｍの範囲であり、酸素流量は１８から２６ｓｃｃｍであり、電力は２５０から３００Ｗであり、時間は１０から３０秒であった。

プラズマ処理
表面の親水性を増大させるために、フィルムをプラズマ反応器中で酸素を流しながら処理して、シラン化用の活性ヒドロキシ部位を実現させた。プラスチックフィルムを、Ｐｌａｓｍａ ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃのＰＩＣＣＯＬＯ ＲＦ駆動反応器を用いて、以下の条件下でプラズマ処理した：ＲＦ電力２４０ワット、酸素流量１８０ｓｃｃｍ、３分。

接触角測定
プラズマ処理した後、表面の清浄さの指標である水接触角を測定して、表面が所望どおりに親水性であることを確認した。測定は、Ｒａｍｅ−Ｈａｒｔの手動接触角ゴニオメーターを用いて行った。

この角度の測定は、各フィルムの処理側面に３滴塗布し、液滴の右左両側の角度を測定し、その表面の平均値を算出することによって実施した。

シラン化
シラン溶液は、エタノール（３２ｍｌ）、酢酸（４．８ｍｌ）、及びＢｉｎｄ Ｓｉｌａｎｅ（γ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（２４０μｌ）をビーカー中で混合することによって調製した。シラン溶液は、使用前の約５分間撹拌したままにした。プラズマ処理前のガラスコーティング付きプラスチックフィルムは、ガラスコーティング付き表面にＢｉｎｄ Ｓｉｌａｎｅ溶液を１枚あたり約１ｍｌで添加し、それを表面全体にＫｌｅｅｎｅｘティッシュペーパーで塗布することによって、シラン溶液で処理した。表面を放置して、過剰のエタノールを約２０分間蒸発させ、最後に表面をエタノールで湿らせたＫｌｅｅｎｅｘティッシュペーパーで磨いて、表面に共有結合しなかった過剰のＢｉｎｄ Ｓｉｌａｎｅを除去した。

シラン化した後、フィルムの接触角を測定して、以前の親水性表面からより疎水性の高い表面へと、表面が十分に改質されたかどうかを確認した。

３．接着試験のためのポリアクリルアミドゲルのキャスティング
キャスティング装置は、ガラス板（８．５×８．５ｃｍ）からなる。コーティング付きのプラスチックは、アリルグリシジル−アガロースフィルムを含む親水性側面を外側に向けて、ガラス板の上に載せた。１ｍｍ厚のＵ字型スペーサを、ガラスを担体とするアリルグリシジルアガロースコーティング付きプラスチックと、別のガラス板の間に配置した。このカセットを４個のクランプで適切な位置に保持し、垂直な位置に配置した。

過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、及びテトラメチルエチレンジアミン（Ｔｅｍｅｄ）の溶液は、１．０ｇのＡＰＳを１００ｍｌの蒸留水に溶解、７５０μｌのＴｅｍｅｄを１００ｍｌの蒸留水に溶解することによって使用前に調製した。

キャスティングする直前に、９０ｍｌのアクリルアミド溶液を、ＡＰＳ溶液及びＴｅｍｅｄ溶液のそれぞれ５ｍｌと混合した。

このキャスティング溶液を、垂直キャスティングカセットにその上部から注射器で注入した。キャスティング溶液上に、数滴のイソプロパノールを添加して、酸素による重合阻害を防止した。

接着試験
スパチュラ試験
スパチュラ試験は、支持体に対するゲルの接着を評価する第１の試験であった。この試験は、ゲルをスパチュラで引っ掻き、ゲルが表面に接着したかどうかを目視で判断することによって実施した。接着が良好に見える場合、フィルムはこの試験を通過して、さらに真空試験に進んだ。

真空試験
真空試験では、真空装置を使用して、吸引による支持体を評価することによって、ゲルの支持体への接着を評価した。吸引ノズルは、ゲルにノズルを突き通すことによって支持体上に配置し、圧力を２０〜３０ｍｂａｒにまで下げ、次いでノズルを表面からまっすぐに引き抜くことによって慎重に外した。

１つのゲルに付き５か所を、上記に述べた方式で調査した。結果を０から５の段階で表した。０は、どのゲルプラグも表面に接着しない最悪の場合であり、５は、接着が非常に良好な場合である（ゲルプラグの５個全部が表面にしっかりと接着している）。

接着試験の結果
シラン化表面
ガラスコーティングしシラン化したＵＣＢ社製ＯＰＰフィルムは、良好な接着を示し、５か所のうちの４か所の平均値は、表面にしっかりと接着していた。
アリルグリシジルアガロースコーティングした表面
ガラスコーティングしていないＯＰＰ、Ａｃｌａｒ、及びＺｅｏｎｏｒ上のアリルグリシジルコーティングはそれぞれすべて、参照として使用したＧｅｌＢｏｎｄ ＰＡＧ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＰＥＴ系支持体フィルム）に比べて、真空試験で良好な接着結果を示した。

４．アリルグリシジルアガロースコーティング付きフィルムでのポリアクリルアミドゲル電気泳動
本発明によるコーティング付きフィルムは、特に２Ｄ電気泳動の二次元目に適している。この実施例では、一次元目、すなわち等電点電気泳動を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ Ｄｒｙ Ｓｔｒｉｐ（商標）で行う。二次元目では、ストリップを、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で平衡にし、ゲルの上に載せ、封入溶液で封入した。タンパク質を、一定電力（２．５Ｗ／ゲル）で１５〜３０分間ゲルに入らせ、次いで分離を１７Ｗ／ゲル（最大２００Ｗ）で、色素先端がゲルの底部に到達するまで行った。温度は、２５℃に設定した。

本発明によるゲル（表１を参照）では、５０μｌのＣｙ５（商標）標識マウス肝臓タンパク質を使用し、ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００を用いて、解像度２００ミクロン、ｐｍｔ５００Ｖ、Ｃｙ５の波長、通常の感度で走査した。

従来のＧｅｌＢｏｎｄゲルでは、同じ試料を２００μｌ使用しなければならなかった。

この結果から、本発明によるゲルは、従来のゲルより良好な電気泳動マップを示すことが判明する。蛍光、ヘイズ、及び曲げ弾性率の値を表１に示す。

Claims (13)

1. スラブゲル電気泳動向けの電気泳動用ヒドロゲルの低蛍光性担体フィルムであって、ヘイズ値が３％未満の二軸延伸ポリプロピレン、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）又は次式のポリシクロオレフィンから選択されるポリマーを含む低蛍光性担体フィルム。
   式中、
   ｎ＝０、０＜ｍ＜１０００００であって、Ｒ５及びＲ６がＨであるか、
   或いは
   ０＜ｎ≦１０００００、０＜ｍ≦１０００００であって、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６がＨである。
2. 前記ヒドロゲルが、電気泳動用のアガロース、アクリルアミド又はアクリルアミド誘導体である、請求項１記載の低蛍光性担体フィルム。
3. ２Ｄ電気泳動の二次元目のための、請求項１又は請求項２記載の低蛍光性担体フィルム。
4. 低蛍光性担体フィルムに、酸素バリア層及びゲル接着剤として機能する材料の上層が設けられているか、又は積層されており、該上層がフィルムとヒドロゲルの間に設けられている、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の低蛍光性担体フィルム。
5. 前記材料がアリルグリシジルアガロースである、請求項４記載の低蛍光性担体フィルム。
6. 前記担体に２層が設けられ又は積層されており、該２層がフィルムとヒドロゲルの間にあり、そのうち一方の層が酸素バリア材料であり、他方の層がゲル接着材料である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の低蛍光性担体フィルム。
7. 前記２層がそれぞれガラス及びシランからなる、請求項６記載の低蛍光性担体フィルム。
8. 前記ポリマーが二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）であり、前記上層がアリルグリシジルアガロースであり、前記ヒドロゲルがアクリルアミドである、請求項４記載の低蛍光性担体フィルム。
9. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の担体フィルムとヒドロゲルとを含む複合材料。
10. 二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）の担体ポリマーフィルムと、アリルグリシジルアガロースのバリア層／接着層と、ポリアクリルアミドのヒドロゲルとを含んでいて、前記バリア層／接着層が前記担体ポリマーフィルムと前記ヒドロゲルとの間に設けられている、請求項９記載の複合材料。
11. ＢＯＰＰフィルムの厚さが８５μｍを超える、請求項１０記載の複合材料。
12. ２Ｄ電気泳動用のキットであって、二次元目用の請求項１０又は請求項１１記載の複合材料と、一次元目用のＩｍｍｏｂｉｌｉｂｅ Ｄｒｙ ｓｔｒｉｐ（商標）とを含む２Ｄ電気泳動用キット。
13. 前記ヒドロゲルが予め膨潤されており、当該キットがＰＰＡ緩衝剤をさらに含む、請求項１２記載のキット。