JPH07111398B2 - 螢光検出及び界面動電分離の方法及び装置 - Google Patents

螢光検出及び界面動電分離の方法及び装置

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JPH07111398B2
JPH07111398B2 JP61221736A JP22173686A JPH07111398B2 JP H07111398 B2 JPH07111398 B2 JP H07111398B2 JP 61221736 A JP61221736 A JP 61221736A JP 22173686 A JP22173686 A JP 22173686A JP H07111398 B2 JPH07111398 B2 JP H07111398B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は電気泳動の分野に関し，より詳細には，開口筒
状キャピラリ（open−tubular capillary）内での界面
動電分離を行い及び検出するための改良された方法及び
装置に関する。
（従来の技術） プレトリウス（Pretorius）等は，接線方向に印加され
た電界の影響下に固体面と接触した液の流れであるとい
う電気浸透の考えを1974年に示した（ジャーナルオブク
ロマトグラフィ（J.Chromatogr.），99,23）。表面の上
のイオンの選択的吸着に基づき，電気浸透流によって固
液界面に於ける電気二重層が形成されると考えられてい
た。この輸送プロセスを第１図に示す。第１図には，小
径の二重又は両端開口の管10の断面が示されている。該
管は，導電性の液11（本明細書に於いては「支持電解
質」と称することもある）によって充たされている。管
10の壁は選択的に吸着された陽イオン12を含んでいる
（管10の材質によっては，吸着される電荷は負の場合も
ある）。陽イオン12は導電液11からアニオン13を吸引
し，電気二重層14を形成する。該壁へのアニオンのその
選択的吸引によって，液11の内部では正電荷が過剰とな
る。従って，管10内の液11の柱の両端に位置する電極1
5,16間に，例えば30kVの電位差を与えて電界を印加する
と，正に帯電している液は陰極の方に移動する。プレト
リウム等はこのプロセスを，薄膜，高速の液クロマトグ
ラフィに用いることを提案している。
ミッカーズ等は，小径（例えば,0.2〜0.35mm）の管を高
パーフォーマンスゾーン電気泳動に用いることを1979年
に示した（ジャーナルオブクロマトグラフィ，169,1
1）。最近では，ジェー．ダブリュ．ジョルゲンソン
（J.W.Jorgenson）及びケー．ディー．ルカクス（K.D.L
ukacs）は，そのような分離を行うために,75μｍのガラ
スキャピラリを用いることを報告している（ジャーナル
オブクロマトグラフィ，218（1981）,209;アナリティカ
ルケミストリ（Anal.Chem），53（1981）,1298;及びサ
イエンス（Science）,222（1983）,266）。ツダ（Tsud
a）等は同様のことを報告している（ジャーナルオブク
ロマトグラフィ，248（1982）,241及び264（1983）,38
5）。キャピラリの通路を用いることの利点は，試料の
流れを妨げるジュール熱効果が少なくなることである。
分離プロセスは，上述の電気浸透効果と，液媒体内の溶
質の電荷の陽，中性，陰に応じた溶質に対する電界の差
動（differential）効果とに依存する。これらの関連す
る効果を第２図を用いて説明する。第２図は第１図と同
様のものであるが，液11中の各分子種の荷電分子（char
ged species）18,19が示されている。カチオン分子18は
電気泳動的に陰極16の方に吸引される。アニオン分子19
は陰極16から反発される。第２図に示されているよう
に，また，通常の場合そうであるように，液11の速度は
溶液中の分子の電気泳動速度よりも大きいので，全ての
スピシーズは，速度は異なっているが同じ電気浸透流の
方向に移動しているように見える。電気浸透液と電気泳
動との組合せを，各文献及び本明細書では「界面動電
（electrokinetic movement）」と称している。また，
これらの２効果による分離を「界面動電分離（electrok
inetic separation）」と称している。
（発明が解決しようとする問題点） 更に，電気浸透流は，層流とは対照的なプラグ流の特性
を有している。これにより高分解能の分離となる。界面
動電分離を溶液中の分子の分離に用いることは理論的に
は可能であり，原理的にはこれらの分離を検出すること
もできる。しかし，ジョルゲンソン及びルカクスがサイ
エンス誌中の結論で述べているように，「（そのような
分離法に於ける）キャピラリの更なる開発と利用に対す
る最大の障害は，極めて高感度の検出が必要なことであ
り，より多くのタイプの高感度検出法の出現が熱望され
ている」のである。界面動電分離カラム中を運動してい
る分子の存在を示すために従来用いられている検出器の
種類には次のようなものがある。（１）ミッカーズ等に
より用いられた紫外線吸収及び導電性；（２）ジョルゲ
ンソン及びルカクスにより用いられたランプ励起による
オンカラム（on−column）螢光検出；（３）ツダ等によ
り用いられた紫外線検出。ジオークリッジナショナルラ
ボラトリ（the Oak Ridge National Laboratory）のデ
イビッド等は，コントラクト（contract）Ｗ−7405−en
g−26に於ける研究報告ORNL/TM−9141の中で，オンカラ
ムランプ励起螢光検出システム及びそれをキャピラリ電
気泳動システムで用いることを開示している。適切な検
出システムを選択することは，高電圧が用いられる場合
の操作者の安全性を実際に考慮するならば，より困難で
ある。測定されている試料中に数十kV程度の電位が存在
する場合には，検出器は信頼性のあるものでなければな
らず，しかも，操作者が試料自身又は直接その周辺を操
作するようなものであってはならない。
本発明の目的のひとつは，従来より求められている改良
された方法及びシステムを提供することにある。また，
本発明の他の目的は，その改良された方法及びシステム
を用いることによってより高感度の界面動電アッセイ
（assay）法を提供することにある。
（問題点を解決するための手段） 本発明の螢光アッセイ（fluoroassay）法は，電気浸透
的に輸送可能（pumpable）であり蛍光特性から変化する
液体試料中の標的分子の存在を検出するための螢光アッ
セイ法であって，（ａ）電気浸透的に輸送可能な液で充
たされた，細孔又は小径の，二重又は両端開口の，壁を
有し，少なくとも一部が半透明（translucent）であ
る，通路内に，該試料を配すること，（ｂ）該輸送可能
な試料及び輸送可能な液に対して電気的輸送に有効なを
印加して，該試料が該通路内を移動するようにさせるこ
と，（ｃ）該試料内に螢光を励起するのに有効な波長の
コヒーレント放射を該試料に照射すること，及び（ｄ）
該標的スピシーズが該半透明部を通過する際の該通路の
該半透明部を介して出される螢光中の変化を検出するこ
とを包含しており，そのことにより上記目的が達成され
る。
また，本発明の検出方法は，電気浸透的に輸送可能であ
り蛍光特性が変化する液体試料中の，複数の放射に反応
して蛍光を発する標的分子の存在を検出するための方法
であって，（ａ）電気浸透的に輸送可能な液で充たされ
た，細孔又は小径の，二重又は両端開口の，壁を有し，
該複数のスピシーズの互いの界面動電分離がなされるの
に充分な長さと，該長さ以降の少なくとも一部に半透明
部とを有する，通路内に，該試料を配すること，（ｂ）
該輸送可能な試料及び輸送可能な液に対して電気的輸送
に有効な及び電気泳動分離電位を印加して，該試料が該
通路内を移動するようにさせ，該複数の標的分子を互い
に界面動電的に分離すること，（ｃ）該標的分子が該半
透明部を通過する際に，該試料内に螢光を励起するのに
有効な波長のコヒーレント放射を該試料に照射するこ
と，及び（ｄ）該個々の分離された標的分子が該半透明
部を通過する際の該通路の該半透明部を介して出される
螢光中の変化を検出することを包含しており，そのこと
により上記目的が達成される。
本発明のキラル化合物を分離する方法は，（ａ）界面動
電領域内の，電気浸透的に輸送可能なキラル支持電解質
内に該化合物を配すること，及び（ｂ）該キラル化合物
を分離するのに有効な期間，該領域内の該支持電解質に
有効界面動電電位を印加すること，を包含しており，そ
のことにより上記目的が達成される。
本発明の検出器は，液体試料中の螢光分子の存在を示す
ための検出器であって，（ａ）細孔又は小径の，二重又
は両端開口の，壁を有する，少なくとも一部が半透明で
ある，該試料を収容するための通路，（ｂ）該螢光分子
内に螢光を励起するのに有効な波長のコヒーレント放射
を該試料に照射するための手段，及び（ｃ）該螢光分子
によって出される螢光を該半透明部を介して集めるため
の手段を備えており，そのことにより上記目的が達成さ
れる。
また，本発明の分離検出システムは，電気浸透的に輸送
可能な液を含む試料中の，複数の放射に反応して蛍光を
発する標的分子を分離し，検出するためのシステムであ
って，（ａ）電気浸透的に輸送可能な液を収容するため
の，細孔又は小径の，二重又は両端開口の，壁を有し，
半透明検出部に接続され且つ連通されている通路，
（ｂ）該試料を該通路内に供給するための手段，（ｃ）
該試料が供給される前後に於いて該通路に電気浸透的に
輸送可能な液を供給するための手段，（ｄ）該通路に沿
って且つ該検出領域を介して，有効界面動電電位を加え
るための手段，（ｅ）該試料が該検出部を通過する際
に，該試料内に螢光を励起するのに有効な波長のコヒー
レント放射を該試料に与えるための手段，及び（ｆ）該
放射に反応して蛍光を発する分子が該検出部を通過する
際に，出された螢光中の変化を該半透明部を介して検出
するための手段を備えており，そのことにより上記目的
が達成される。
検出ボリューム（detection volume）を介して支持電解
質中を通過する際の界面動電的に輸送される標的分子の
検出を，該検出ボリュームを介しての該分子の通過に関
連する検出事象（detection event）が，コヒーレント
源によりオンカラムに供給された電磁放射のビームによ
って発生された放出光（特に，螢光）の変化である場合
に於いて，高効率で行うことができることが見出され
た。コヒーレント放射源を用いることは，よく規制され
た波長の放射を，非コヒーレント光源と比較して，危険
なく，強度のかなりの損失もなく，更に散乱光による望
ましくない干渉もなく，オンカラムで試料に供給するこ
とができる。コヒーレント放射を用いることによって，
ラマン及びレイリー散乱からの干渉が最小になるので，
感度が増大する。この検出システムにより，化合物の混
合物の分析及び／又は分離が高い効率で可能となる。本
発明の検出システムを用いて，フェムトモル（10-15モ
ル）以下の範囲の標的の量を検出することができる。
他の面では，本発明は，界面動電分離プロセスに用いる
検出器を提供するものである。この検出器は，螢光分析
のためのオンカラムコヒーレント励起源を備えている。
本発明の更に他の面によって，光学的活性の（即ち，キ
ラル）支持液（support liquid）が界面動電分離プロセ
スに用いられる場合に生ずる，ラセミ混合物の光学的活
性成分への界面動電分離が提供される。
実施例１ レーザ励起螢光検出器を備えた界面動電分離系を構成し
た。第３図および第４図によりこの系を説明する。この
系には，全長75cm,内径75μｍの融解石英キャピラリ30
（ヒューレット−パッカード社製）が含まれる。キャピ
ラリはその外面に不透明のポリイミド保護コーティング
31を有し，その一部は炎で除去され半透明部32となる。
キャピラリ30は,5mMl−ヒスチジン,2.5mM CuSO4・5H2O
および10mM酢酸アンモニウムを含みNH4OHを加えてpH7−
８に調整した支持電解質で液体封入される。供給容器34
および流出容器35も同様に支持電解質を含み、従って液
体封入キャピラリ30はそれら容器の間に連続的な液体連
結および電気的連結を形成する。電極37と39との間にそ
れぞれ配線40および41を介して電源36から−30kVの電位
を印加し，完全な電気回路とする。キャピラリ30の内面
は陽イオンを選択的に吸着するようになっている。これ
により電解質中のカチオンが優先的にキャピラリ壁に二
層として引きつけられ，キャピラリ30内の支持電解質の
本体に次々と正味陽電荷が付与される。流出容器35の液
体に電極39により−30kVの電位をかけると，この陽荷電
液体はキャピラリ30から容器35へ電気浸透的に引っぱら
れ，追加の電解質が容器34からキャピラリ30へ導入され
る。電流は30−33μＡであった。キャピラリ30中の液体
の線速度は約１−2mm/秒であった。
キャピラリ30はフローセル42を通り抜け，継手44および
45によりその半透明部32が，所定位置に支持される。半
透明部32はフローセル42の中央で検出ボリュームを限定
する。
フローセル42には，オンカラム螢光検出器が含まれ，こ
の検出器は励起源として波長325nmで5mWの連続波出力を
有するHe−Cdレーザ46（リコニクス，モデル4240B,サニ
ーベール,CA）を使用する。レーザのフィルタ出力はレ
ンズ47を介して光ファイバ49（80μm,融解石英材）上に
集められ，レーザ光線は光ファイバ49によりフローセル
42へ運ばれる。ファイバ49は，その出力がキャピラリ30
の半透明部32上に集められるように,3軸位置決めヘッド
50により所定位置に支持される。検出ボリュームを介し
て輸送されている液体から発する螢光は,0.6mmの融解石
英光ファイバ51により励起ビームに垂直に集められる。
ファイバ51は３軸位置決めヘッド52により所定位置に支
持される。ファイバ51で集められた螢光は高域カットオ
フフィルタ53,可変波長帯域を選択するよう働く高速モ
ノクロメーター54（セントロニック モデルQ4249B），
および光電子増倍管55を通過する。光電子増倍管55の出
力は，キースリー インスツルメント社製 モデル480
ピコアンメーター（図示せず）により増幅され，配線56
を介して帯形記録形57に送られる。
使用に際し，試料がキャピラリ30に注入される。これ
は，キャピラリ30の陽極端を容器58に含まれる液体試料
中に浸し，陽極リード40を電極59に連結し,6kVの高圧を
短期間（５−10秒）かけることにより，行われる。これ
により,1から5mm長に限定された試料の“プラグ”がカ
ラム30に導入される。
以下のダンシル化アミノ酸各10-4Mで構成される第１の
試料を，支持電解質で用いたのと同じ液体中で調製し
た。
ｄ−Tyr ｌ−Tyr ｄ−Phe ｌ−Phe ｄ−Asp ｌ−Asp ｄ−Glu ｌ−Glu 標識化アミノ酸はシグマ ケミカル社，セントルイス,M
Oから購入するか，またはTapuhi,et al.（Ｉ）,Anal.Bi
ochem.115,123（1981）,and Tapuhi,et al.（II）,J.Ch
romatog.,205,325（1981）の方法で調製した。支持電解
質液はｌ−ヒスチジンの銅（II）錯体を含む。この錯体
は光学的に活性で，従って支持電解質はキラル支持電解
質である。４組の光学活性なペアはカラム30中を移動す
るに従って互いに分離される。また，分離は各ペアの光
学異性体のメンバー間でも生じる。８個の分離分子それ
ぞれが検出ボリュームを通過するとそれらが検出され
る。この場合，それらのダンシル標識が螢光を発し，こ
れが検出される。結果を第５図ａに通電クロマトグラフ
ィー（エレクトロフェログラム）として示す。ここでは
レーザ励起螢光信号を時間に対しプロットしている。次
に，支持液中のｌ−ヒスチジンの1/2をｄ−ヒスチジン
で置き換え，前の実験で用いたのと等しい総濃度のｄ−
ヒスチジンとｌ−ヒスチジンとの1:1混合液を得る。こ
のキラリティーのない支持電解質を用いて実験を繰り返
したところ,d異性体をｌ異性体の分離は観察されなかっ
た。第５図ｂに示されるように，個々の４つのピーク，
すなわち各アミノ酸に対し１つのピークが見られた。同
様に,l−ヒスチジンをｄ−ヒスチジンで完全に置き換え
ると，ダンシル化されたｄアミノ酸異性体とｌアミノ酸
異性体の順序が逆になって分離が生じた。
従ってこれら３つの実験は，コヒーレント（すなわち，
レーザ）エネルギー源によりオンカラムで励起された螢
光の変化を測定することは，小径通路内の電気浸透的に
輸送可能な液体中の分離分子の存在を界面動電プロセス
により検出するための有効かつ効率良い方法である，と
いう本発明の広い局面を説明するものである。これら実
験では約0.5nlの検出ボリュームを用いた。検出中の分
子は，電気浸透的にポンプ可能な支持電解質１あたり
約10-4モルの濃度であった。観察された信号対雑音比は
100:1より大きかった。これらの要素を結合すると，本
検出系は５×10-16モル（すなわち，フェムトモルを下
まわる）標的分子を検出できることがわかる。
これら実験はまた，界面動電分離プロセスを用いて光学
異性体を分離できる，という本発明の他の局面をもしめ
している。光学異性体のこの分離は，速度および感度の
両方の見地において先例がないと信じる。
実施例２ より広範なアミノ酸を用いて実施例１の実験を繰り返し
た。アミノ酸は様々な組み合わせで用いた。その結果を
表１に示す。表１は，本文で説明した条件下,pH8で得ら
れた，いくつかのd,l−ダンシル−アミノ酸に対する移
動時間（td,tl），Δｔ値（式（１）参照）および相対
ピーク域（Ad,Al）を示す。移動時間の再現性は±３％
相対標準偏差（R.S.D.）単位よりよく，また相対ピーク
域では約±５％R.S.D.である。
実施例１で観察され第５図ａおよびｂで示された優れた
信号対雑音比が，このより広範な試料についてもみられ
た。この信号対雑音比から，このような広範な標識アミ
ノ酸が簡便な現実験装置によりフェムトモル（10-15モ
ル）あるいはそれより低いレベルで検出できることが示
された。次式で示される量の絶対等級Δｔが0.01を越え
る場合，基線解像が可能であることがわかる： Δｔ＝（td−tl）／〔1/2（td＋tl）〕 式（１） ここで,tdおよびtlはｄ光学異性体およびｌ光学異性体
の移動時間である。支持電解質中のｌ−ヒスチジンをｄ
−ヒスチジンで置き換えると,dアミノ酸とｌアミノ酸の
移動順序が逆になる。すなわち，Δｔの符号が変わる。
第５図ａはまた，同じダンシル−アミノ酸の２つの光学
異性体に対する螢光信号が異なることを示している。表
１では,10個の異なるd,l−ダンシル−アミノ酸に対する
内部標準としてｌ−アルギニンを用い，それをもとに移
動時間，Δｔ値および相対ピーク域が示されている。d,
l−セリン以外の全ての場合において解像が達成されて
いるが，Δｔの符号はアミノ酸により異なる。観察され
たアミノ酸の移動順序はHPLCでみられたもの（Lam,et a
l.,J.Chromatog.,199,295（1980）,and J.Chromatog.,2
39,451（1982）参照）と異なるが，鏡像異性体の移動順
序はΔｔの符号で示されるように同じである。
本発明がいかに作用するかのいかなる特別な理論によっ
ても制限されることは望まないが,Cu（II）ｌ−ヒスチ
ジン支持電解質によるキラリティーの認識は，ジアステ
レオマーの三元錯体を形成するための混合キレート錯体
形式により説明することができる。以下の説明は現デー
タの全てと一致する。Cu（II）ｌ−ヒスチジンに結合し
たアミノ酸は遊離アミノ酸より速く移動する。これは使
用したpH条件下でCu（II）ｌ−ヒスチジンが陽電荷を有
するからである。しかし,Cu（II）ｌ−ヒスチジンによ
り強く結合したアミノ酸はより弱い螢光信号を示し，こ
れは銅イオンとの結合による消滅で生じたものである。
従って，より多く錯体が形成された鏡像異性体は速く移
動するが，銅イオンとの結合による消滅で生じる弱い螢
光信号を示す（第５図ａおよび表１参照）。
実施例３ ウシ インシュリンをフルオレスセイン イソチオシア
ネイト（FITC）で標識した。インシュリン（シグマ ケ
ミカル社）10mgを0.5M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH9.
5）6mlに溶解させた。FITC（シグマ ケミカル社）1.5m
gを添加後，混合液で４℃で一晩撹拌してインシュリン
にFITCを連結した。
反応混合液を1.5×40cmセファデクスTMC−25シリカゲル
濾過カラムに配し,0.01Mリン酸緩衝塩溶液（pH7.4）で
流速約1ml/分にて溶出させた。未反応FITCはシリカゲル
に吸着された。FITC−標識インシュリンを含む黄色のバ
ンドをカラムから取り出し，水５部にて希釈した。両性
イオン緩衝液 CHES（２−〔Ｎ−シクロヘキシルアミ
ノ〕エタン スルフォン酸）を10mMレベルまで加え，溶
液のpHを９までもっていった。
実施例１の装置で標識インシュリン溶液を用いた。5kV
の電位を13秒間印加することにより，キャピラリカラム
に試料を設置した。次いで30kVの電位をかけて，試料を
キャピラル中を界面動電的に輸送した。電流は5.6mAで
あった。オンカラムのレーザ励起は325nmであった。510
nmにて放射をモニターした。5.5分と8.0分の間に,FITC
標識インシュリンに相当する一連のピークが示された。
実施例４および５ 実施例３の実験を変更を加えて２回繰り返す。実施例４
では，標識インシュリンの代わりに,FITC−標識コンカ
ナバリンＡ（シグマ ケミカル社，あるいはフルカ ケ
ミカル社,Hauppauge,N.Y.から入手可能）の蛋白を用い
る。キャピラリカラムに設置される供給混合液には,0.5
mg/mlの蛋白と,pHを８に保つ20mM緩衝液とが含まれる。
界面動電電圧を印加すれば，界面動電的に標識された蛋
白に相当するピークが５から10分までに観察されるであ
ろう。
実施例５では，標識インシュリンの代わりに,FITC−結
合ヤギ抗ヒトガンマグロブリンをリン酸緩衝塩溶液（pH
7.2）に溶かしたもの（シグマ ケミカル社から入手可
能）を用いる。ここでもまた，本発明のオンカラムレー
ザ励起法を用いることにより，このイムノグロブリンを
検出領域中を輸送させて生じた螢光ピークが観察される
であろう。
本発明がここで述べた実施態様に限定されないことはい
うまでもない。上述のキャピラリの代わりに，小径の細
長い，壁を有する，通路の形であればどんなものでも使
用できる。概括的な言葉でいえば，直径が約500μｍを
越えない通路を使うのが好ましい。より広径の通路は，
界面動電電位を印加した際に，過度の加熱を起こす可能
性がある。好ましい通路には,1本あるいは複数本の通路
が含まれ，それぞれの直径は約500μｍまで，特に約５
μｍから約350μｍまでである。通路の断面が小さいほ
ど，検出領域のボリュームが小さくなり，従って検出系
の感度の必要性が大きくなることが認められよう。その
構造が簡単であることから，円形断面のキャピラリが好
しい。
通路は，界面動電的な力のもとで分子の分離を行うのに
有効な長さのものでなければならない。通路が長いほ
ど，試料が通路中を移動するのに要する時間が長くな
り，従って様々な分子が互いに分離されるであろう距離
が大きくなることが認められよう。同時に，バンドの拡
張が生じ，従って長さを増すことによっては解像度は改
善されない。これらの要素から，通路の長さには実用上
の制限が示唆されるが，必要に応じてより長いものある
いはより短いものも使用できる。例えば，約5cmという
短い通路の長さで良好な結果が得られる。同様に，数ｍ
より長い通路の長さによる多くの通常の分析用セッティ
ングでは，通路中の輸送時間が不便なことに長くなる。
一般に，約10cmから約200cmまでの通路の長さ，特に約4
0cmから150cmまでの通路の長さが好ましい。より長い通
路や短い通路，例えば４または5mまで長い通路あるいは
約5cmまで短い通路も使用でき，本発明の思想に反しな
いことはいうまでもない。
細長い通路は，耐久性を有し支持電解質と接触しても物
理的にもとの状態を保持し，また界面動電電位を印加し
た際に伝導される電気が無視できまた生じる熱も無視で
きるように実質的に絶縁性であり，しかもその内面に陽
電荷あるいは陰電荷を帯びることができる，という性質
を有する材料で構成される。適切な材料としては，通路
およびそれに含まれる電解質のコンダクタンスの好まし
くは少なくとも約95％が電解質によるようなコンダクタ
ンスを有するものであろう。さらに，検出用に通路内に
含まれる通過液体から螢光が放射され得るように，通路
の一部は半透明である必要がある。通路の半透明部分は
また，必要に応じて，試料にコヒーレント励起エネルギ
ーをインプットするための入口として使用することもで
きる。離れた半透明検出領域断片を用いこれに通路を連
結することも可能であるが，この場合，半透明断片への
通路の連結は，連結を越えて界面動電電圧を印加した時
に過度の過熱あるいはアークが生じないように，または
液体の流れに乱れが生じないように，行う必要がある。
本来その中に半透明部分を有する連続通路を用いればこ
れらの問題は回避できる。石英，ガラスおよび融解石英
のような無機物質，およびテフロン（ポリテトラフルオ
ロエチレンおよびフッ化エチレン／プロピレン重合
体），ポリクロロトリフルオロエチレン，アラミド，ナ
イロン（ポリアミド），ポリビニルクロライド，ポリビ
ニルフルオライド，ポリスチレン，ポリエチレン等のよ
うな有機物質が使用できる。
発明の背景の節で指摘したように，電気浸透的な流動
は，通路の内面が荷電分子を運んだり吸着したりすると
達成される。この内面は，より多くの陽電荷が付与され
るようにその表面を酸性液に接触させたり，より多くの
陰電荷が付与されるようにその表面を塩基性物質に接触
させたり，あるいは電荷数を減らすためにその表面をシ
リル化剤に接触させたりなどして，改変してその電荷を
変えることができる。（トリメチルシランを使用して狭
通路電気泳動領域壁上の電荷密度を減少させ，これによ
り領域中の輸送を変化させることの記述については,Ana
lytical Chemistry,53,No.8,July 1981,1298を参照せ
よ。）当業者に周知の他の表面改変技術も同様に使用で
きる。
試料を通じて印加される電圧は，過度に加熱されること
なく識別可能な界面動電的挙動が生じるのに有効な電圧
でなければならない。一般に約1000Vより低い電圧では
小さすぎ，また約100kVより高い電圧は従来の高圧電源
では一般的でない。これら実用上の制限に基づけば，約
3kVから約90kVまでの電圧，特に約5kVから約60kVまでの
電圧が好ましい。電位の極性により，電気的に帯電され
た分子の移動方向が決定される。安全性の理由から，接
地電位での分析系をできるだけ多く持つことが好まし
い。
通路には，電気浸透的に輸送可能な支持液が充填され
る。液体が電解質であれば，すなわちそれが電気的に帯
電された分子を充分含むかあるいは運ぶかして電流を通
すならば，液体は電気浸透的に輸送可能である。典型的
な電気浸透的に輸送可能な支持液は，例えば１あたり
少なくとも約0.0005モルのイオン性分子を，好ましくは
１あたり約0.001から約10モルのイオン性分子を含
む。このようなレベルにより，高速度の界面動電的輸送
が得られる。最も一般的には，支持液は水をベースにし
たものか，あるいは混合された水−有機液体系をベース
にしたものである。混合系は，水だけでは溶解度が限ら
れている有機標的物質を可溶化あるいは懸濁するのを助
けるのに有用となり得る。電気を伝導し得る適切な有機
液体も使用できる。支持電解質で用いる代表的な材料に
は，水，および水と混和可能な１つ以上の有機物質を水
に混合して成る混合溶媒がある。水と混和可能な有機物
質としては次のようなものがある：酢酸，プロピオン
酸，クロル酢酸などの低級（例えば,1〜４炭素原子）ア
ルカン酸；メチルアミンのような一級および二級の低級
アルキルアミン；エタノール，メタノールおよびプロパ
ノールのような低級アルコール；低級アルカンジオール
のような低級ポリオール；アセトニトリル，ピリジン，
ピペリジンおよびキノリンを含む含窒素液体；アセトン
およびメチルエチルケトンのような低級ケトン;DMF,N−
メチルホルムアミド,N−エチルホルムアミド,N−エチル
アセトアミドなどのような低級アルキルアミド。これら
物質は代表例にすぎない。実際には，それ自身電解質で
あるかまたはイオン性分子を運んで導電性となり得るど
んな液体も使用できる。これら液体のどれを用いても，
支持液には，塩，キレートおよび他の錯体のような付加
イオン性物質，酸，塩基および緩衝液などが含まれてよ
い。液体が界面動電通路中を通過する際のpHで両性イオ
ンである付加イオン性分子を用いるのがしばしば好まし
い。代表的な物質には，無機酸のアルカリ金属塩，アル
カリ土類金属塩およびトランザクション金属塩；有機酸
のその様な塩；その様な酸のアンモニウム塩および有機
塩基塩；ハロゲン酸，有機酸およびその他の酸；金属
酸，金属水酸化物，アミンおよび他の塩基などがある。
典型的な両性イオンには，アミノ酸，およびシグマケミ
カル社，セントルイス,MOで市販されているGoodの緩衝
液がある。これらの付加イオン性物質あるいはイオン化
可能な物質は，それらの主機能が支持電解質の導電性を
増すことにあるので，それらが試料および支持電解質中
の他の成分と和合可能である限り，一般に以上の広範な
クラスから随意に選んでよい。
１つの応用として，本発明はキラル支持電解質を用い
て，混合キラル化合物を鏡像異性体へ分離しまたこの分
離を検出する。キラル支持電解質は上述の基準を満たす
液体であるが，また鏡像異性体の混合物の１メンバーと
選択的に相互作用してそれに混合物の他のメンバーと異
なる界面動電的移動度を優先的にもたらすであろう１つ
以上のキラルスピシーズを含有するという性質をも有す
る。界面動電的可動性の修飾は,1つの鏡像異性体に荷電
分子を選択的に結合させる形になり得る。またそれは，
いくつかの荷電鏡像異性分子の１つの電荷密度を，それ
に帯電していない嵩高い基を選択的に結合させることに
よって，あるいは１鏡像異性体が支持電解質の荷電分子
に結合する能力あるいはそれを引きつける能力を変える
ような基を選択的に結合させることによって，変える形
になり得る。キラル支持電解質成分として有用な様々な
物質は，文献中の他のセッティングで記載されている。
例えば，ここで引用文献として採用するEnantiomers,Ra
cemates,and Resolutions by J.Jacques,et al.,John W
iley ＆ Sons,New York,1981を参照せよ。キラル支持電
解質中の含有物に対する適当なキラル分子には，例え
ば，以下のキラルアニオン，キラルカチオン，キラル錯
体が包含される。このキラルアニオンには，例えば，
（＋）カンファー−10−スルホン酸のアニオン，（＋）
ショウノウ酸，（−）ジベンゾイル酒石酸，（＋）およ
び（−）ｄ−（2,4,5,7−テトラニトロフルオレニリデ
ンアミノオキシ）プロピオン酸（TAPA），ジアセトンケ
ログロン酸，（＋）および（−）マンデル酸，（−）マ
レイン酸，（＋）および（−）酒石酸，（＋）および
（−）３−ブロモカムフォア−９−スルホン酸などのア
ニオンがある。このキラルカチオンには，例えば，ブル
シン，キニン，ストリキニン，（＋）および（−）エフ
ェドリン，（−）−２−アミノ−１−ブタノール，
（＋）および（−）ｄ−メチルベンジルアミン，（＋）
および（−）エフェドリンなどのカチオンがある。キラ
ル錯体には，例えば,1−アスパルチル−１−フェニルア
ラニン メチルエーテルの銅（II）および亜鉛（II）錯
体（市販の人工甘味料，アスパルタミン）;1−プロリ
ン,1−ヒスチジンおよび１−ピペコン酸の銅（II）錯
体；およびＬ−２−アルキル−４−オクチルジエチレン
トリアミンの亜鉛（II）錯体などがある。
キラル支持電解質に包含されるキラル分子の前述のリス
トは代表例にすぎない。分析しようとする物質グループ
の１メンバーと選択的に相互作用することにより物質グ
ループのメンバーの界面動電的可動性を差動的に変え
る，他のどんなキラル分子も同様に使用できる。包含さ
れるキラル分子の選択にあたっては，鏡像異性混合物の
分解能に関する当分野の教示，特にジアステレオ異性体
の形成によるそのような分解能に関する教示に従うこと
がしばしば有利となり得る。
本発明は，レーザ励起螢光の検出を用いて，界面動電的
に輸送される標的分子の存在を決定するものである。
“螢光性”および“螢光”という用語はここでは，長命
および短命の光ルミネセント分子を含むように，すなわ
ち“燐光性”あるいは“螢光性”と考えられるかもしれ
ない物質を含むように，また“燐光”あるいは“螢光”
と考えられるかもしれない放射を含むように，広く用い
られる。
検出される放射螢光の変化は，螢光標的分子が検出領域
を横切る場合は螢光の増加であり得る。この変化は，消
滅分子あるいは“透明”分子が螢光バックグラウンド存
在下で検出領域を横切る場合は，螢光の減少であり得る
（H.Small,et al.,Anal.Chem.,54（1982）,462−469,参
照）。それはまた，螢光分子のスペクトル特性あるいは
一時特性の変化でもあり得る。検出される放射螢光スペ
クトルの変化は，特別なアクセプタンス波長帯における
螢光強度の変化であり得，これは標的分子が検出領域を
通過して，この特別なアクセプタンス波長帯域内へある
いはその帯域外にシフトされた螢光を有することにより
生じる。このような波長のシフトは，標的分子内での分
子内会合などにより生じ得る。第３図に示されるよう
に，このアクセプタンス帯は，高域カットオフフィルタ
および高速（ハイライトスループットhigh light throu
ghput）モノクロメーターのような波長帯域フィルタに
より容易に限定し得る。一時特性の変化は，例えば螢光
の寿命の増加或いは減少であり得る。それはまた，螢光
の偏極あるいは角分布の変化でもあり得，これは分析上
重要な結果であることがM.Jolley,J.Anal.Tox.,５（Sep
t/Oct 1981）,236.により示されている。
螢光あるいはその等価物における上述の変化はいずれも
検出事象として使用し得るが，螢光において最も一般的
に研究される変化，従って本発明における好ましい変化
は，螢光分子が検出領域を横切る際に生じる螢光の増加
である。測定されている標的分子が本来螢光性のもので
あってよい場合もあるが，一般的には標的分子に螢光標
識を共有的に付けるかもしくは他の方法で結合させる。
螢光標識は，試料が界面動電通路内に置かれた時に，標
的分子に付けたり結合させたりすることができる。ある
いは，界面動電通路中を分子が通過する間に，螢光標識
と標的分子は相互作用し得る。この通過中の相互作用に
は，標的分子と支持液中あるいは界面動電通路壁内の物
質との反応が含まれ得る。それはまた，標的分子を含む
電気化学的反応によっても生じる。いずれにしても，標
的が検出領域中を界面動電的に移動してそして検出事象
がコヒーレント放射により励起された螢光の変化にある
限り，標的，標識および条件のいかなる組合せを用いる
ことも本発明の範囲内にある。
広範囲の螢光標識が公知である。代表的な通常の螢光標
識には，以下のような主要な官能性物質を含む物質が包
含される。この官能性物質には，例えば,1−および２−
アミノナフタレン,p,p′−ジアミノスチルベン，ピレ
ン，四級フェナントリジン塩,9−アミノアクリジン，ア
ントラセン，オキサカルボシアニン，メロシアニン,3−
アミノエキレニン，ペリレン，ビス−ベンゾキサゾー
ル，ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン,1,2−ベンゾフェ
ナジン，レチノール，ビス−３−アミノピリジニウム
塩，ヘレブリゲニン，テトラサイクリン，ステロフェノ
ール，ベンズイミダゾリルフェニルアミン,2−オキソ−
３−クロメン，インドール，キサンテン,7−ヒドロキシ
クマリン，フェノキサジン，サリチル酸塩，ストロファ
ンチジン，ポルフィリン，トリアリ−ルメタン，希土類
金属キレート，およびフラビンがある。
結合に対する官能性物質を有するか，あるいはこのよう
な官能性物質を含むべく調製され得る個々の螢光化合物
には，例えば，以下の化合物が包含される。この化合物
には，ダンシルクロライド，フルオレセイン，フルオレ
セインイソチオシアネートのようなフルオレセイン類,
3,6−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロー
ル，ローダミンイソチオシアネート,N−フェニル−２−
アミノ−６−スルホナトナフタレン,4−アセトアミド−
４−イソチオシアネートスチルベン−2,2′−ジスルホ
ン酸，ピレン−３−スルホン酸,2−トルイジノナフタレ
ン−６−スルホネート,N−フェニル,N−メチル−２−ア
ミノナフタレン−６−スルホネート，エチジウムブロマ
イド，アテブリン，オーラミン−O,2−（９′−アント
ロリル）パルミチン酸塩，ダンシルホスファチジル−エ
タノールアミン,N,N′−ジオクタデシルオキサカルボシ
アニン,N,N′−ジヘキシルオキサカルボシアニン，メロ
シアニン,4−（３′−ピレニル）ブチレート,d−３−ア
ミノデスオキシエキレニン,12−（９′−アントロイ
ル）ステアレート,2−メチルアントラセン,9−ビニルア
ントラセン,2,2′−（ビニレン−ｐ−フェニレン）−ビ
ス−ベンゾキサゾール,p−ビス〔２−（４−メチル−ｔ
−フェニルオキサゾリル）〕ベンゼン,6−ジメチルアミ
ノ−1,2−ベンゾフェナジン，レチノール，ビス（３′
−アミノピリジニウム）−1,10−デカンジルジヨーダイ
ド，ヘレブリゲニンのスルファナフテイルヒドラゾン，
クロロテトラサイクリン,N−（７−ジメチルアミノ−４
−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド,N
−〔ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）−フェニル〕マレ
イミド,N−（４−フルオラニチル）マレイミド，ビス
（ホモバニリン酸），リザザリン,4−クロロ−７−ニト
ロ−2,1,3−ベンゾオキサジアゾール，メロシアニン54
0,レゾルフィン，ローズベンガル，ユウロピウムおよび
テルビウムのポリアミン−ポリ酸錯体，および2,4−ジ
フェニル−３（2H）−フラノンがある。
螢光分子は，約200nmを越える光を吸収すべきことが望
ましく，好ましくは約300nmを上まわる，特に好ましく
は約400nmを上まわる光を吸収すべきであり，通常，吸
収されるコヒーレント光の波長より高い10nmを上まわる
波長で放射する。フルオロフォア（fluorophore）は標
的に共有的あるいは非共有的に，また直接あるいは間接
的に結合され得る。共有結合される場合は，その特別な
結合基は結合される２部分の性質およびそれら個々の機
能に依るであろう。多くの結合基および結合法が文献中
に教示されている。
結合はまたレセプターを用いても達成され得る。例え
ば，抗原のフルオロフォアは，抗原に対するレセプタ
ー，例えば抗体の仲介により標的に結合されよう。レセ
プターは次々に共有的あるいは非共有的に，例えば吸着
により結合されよう。
本発明を用いて分離され測定される標的分子は，螢光標
識できてしかも支持液中に懸濁あるいは溶解させ得る物
質から，実質的には制限なく，選択され得る。最も一般
的には，標的分子は生物学的に，生態学的にあるいは化
学的に興味深い物質であろう。
標的分子は，ポリアミノ酸，すなわちポリペプチドや蛋
白；多糖類;RNA,DNAおよびDNA断片のような核酸やオリ
ゴヌクレオチド；およびそれらを組み合わせたような巨
大分子であり得る。このような組合わせの集団には，細
菌，ウイルス，染色体，遺伝子，ミトコンドリア，核，
細胞膜などがある。
広範な蛋白およびポリペプチドは，構造上の類似した特
徴，特別な生物学的機能を有する蛋白，特定の微生物，
特に病因となる微生物に関連する蛋白，などにより分類
される。
以下に構造上関連のある蛋白のクラスを示す：プロタミ
ン，ヒストン，アルブミン，グロブリン，硬蛋白，リン
蛋白，ムコ蛋白，色素蛋白，リポ蛋白，核蛋白，糖蛋
白，プロテオグリカン，分類されない蛋白，例えばソマ
トトロピン，プロラクチン，インシュリンおよびペプシ
ン。
ヒト血漿中には多くの可能な標的蛋白が存在することは
言うまでもなく，これらは臨床的に重要で以下のものが
含まれる：プレアルブミン，アルブミン，α１−リポ蛋
白，チロキシン結合グロブリン,GC−グロブリン（GC−
１−1,GC2−1,GC2−２），コリンエステラーゼ，ミオグ
ロビン，トランスフェリン，フィブリノーゲン，イムノ
グロブリンＧ（IgG），イムノグロブリンＡ（IgA），イ
ムノグロブリンＭ（IgM），イムノグロブリンＥ（IgE）
あるいはγＥ−グロブリン（γＥ），補足因子，血液凝
固因子，例えば副甲状腺ホルモン（パラトルモン），イ
ンシュリン，グルカゴン，ソマトトロピン（成長ホルモ
ン），卵胞刺激ホルモン，黄体形成ホルモン（間細胞刺
激ホルモン），ゴナドトロピン，セクレチンおよびガス
トリンを含むペプチドホルモンや蛋白ホルモン。
他の興味深い巨大分子標的物質は，腸内細菌，サルモネ
ラ，シガエラ（赤痢菌），プロテウス種，パストゥーレ
ラ，ブルセラ，好気性の胞子形成バチルス，嫌気性の胞
子形成バチルス，ミコバクテリア，放線菌類（菌類様細
菌），スピロヘータ，マイコプラズマなどのような微生
物に由来あるいは存在するムコ多糖類や多糖類である。
他の標的分子には次のものが含まれ得る：リケッチア
（細菌様寄生動物），クラミディア，菌類およびウイル
ス（アデノウイルス，ポックスウイルス，ミクソウイル
ス，レオウイルスタイプ１−3,肝炎ウイルスおよび癌ウ
イルスを含む）。
単量体のあるいはより小さい標的物の分子量は，通常約
75から20,000,より一般には100〜3,000であろう。興味
深い標的物としては，薬剤，代謝物，殺虫剤，汚染物質
などがある。モルフィンアルカロイド（モルヒネ，コデ
イン，ヘロイン，コカイン，ベンゾイルエクゴニン
等），エルゴットアルカロイド，ステロイドアルカロイ
ドなどのようなアルカロイドもこれらに含まれる。
他の興味深い薬剤には以下の物がある：エストロゲンお
よびアンドロゲンを含むステロイド；副賢皮質ステロイ
ド；胆汁酸；強心配糖体；ジゴキシンおよびジゴキシゲ
ニンを含むアグリコン；バルビツル酸塩，例えばフェノ
バルビタールおよびセコバルビタール；アンフェタミン
を含むアミノアルキルベンゼン；カンナビノールおよび
テトラヒドロカンナビノール，ビタミン，プロスタグラ
ンディン，抗生物質，ヌクレオシドおよびヌクレオチ
ド。
他のグループの標的化合物はアミノ酸および小ペプチド
であり，これにはポリヨードチロニン，例えばチロキシ
ン，およびトリヨードチロニン，オキシトシン,ACTH,ア
ンジオテンシン,met−およびleu−エンケファリン，そ
れらの代謝物および誘導体が含まれる。
フルオロフォアは，標的物上の水素あるいは他の置換可
能な官能性物質を結合手あるいは結合基で置き換えるこ
とにより，標的分子に付けられ得る。標的物上の基とし
ては，水酸基，アミノ基，アリール基，チオ基，オレフ
ィン基などがあり得る。結合基は通常は水素以外に１か
ら20原子を有するであろう。これら原子は一般には，炭
素，酸素，硫黄，窒素および原子番号17から35のハロゲ
ンである。結合基に存在する結合官能性物質としては，
カルボニル（オキソ型および非オキソ型の両方），活性
ハロゲン，ジアゾ，メルカプト，エチレン特に活性化エ
チレン，アミノなどが含まれる。ヘテロ原子（すなわち
水素原子や炭素原子でない）の数は通常約０〜６の範
囲，より一般には約１〜6,好ましくは約１〜４の範囲で
あろう。
たいていの場合，結合基は脂肪族であろうが，ジアゾ基
とともに，芳香族基も含まれる。一般に，結合基は，そ
の鎖中に約１〜10原子，より一般には約１〜６原子を有
する二価の鎖である。酸素は通常，炭素や水素に結合し
て，好ましくは炭素のみに結合して，オキソまたはオキ
シとして存在するであろう。これに対し窒素は通常，炭
素のみに結合してアミノとして，あるいはアミドとして
存在するであろう。また硫黄は酸素に類似するであろ
う。
結合基および結合される分子間の共有結合形成における
一般的な官能性物質はアルキルアミン，アミド，アミジ
ン，チオアミド，ウレア，チオウレア，グアニジンおよ
びジアゾである。
ポリペプチドとの結合に特に適用される結合基には，カ
ルボン酸を含む結合基がある。このカルボン酸は，ジイ
ミドと結合して，または炭酸モノエステルと混合した無
水物として，または活性カルボン酸エステル（例えば,N
−ヒドロキシコハク酸イミドまたはｐ−ニトロフェニ
ル）として用いられ得る。イミドエステルとしては窒素
類似物が使用され得る。還元的なアミノ化条件下（例え
ば，水素化ホウ素の存在下）では，アルデヒドは，イミ
ンを形成してアルキルアミンを生成するべく用いられ得
る。使用可能な他のオキソ型でないカルボニル基には，
イソシアネートやイソチオシアネートが含まれる。さら
に活性アシル基，特にブロモアセチル基も使用され得
る。
たいていの場合には，標的には１つまたはそれ以上の官
能基を有する。この官能基は結合基と結合するための部
位として作用し得る。特に，ヒドロキシル基，アミノ基
およびアリール基（とりわけ活性アリール基）が使用に
供される。また，オキソ官能性物質とヒドロキシル基
（これは，カルボキシメチル基のような結合基と結合す
るための部位として用いられる）とから，オキシムが調
製され得る。
結合基の選択は広範囲にわたって変えられ，これは，フ
ルオロフォア中やこのフルオロフォアが結合し得る化合
物中に存在する官能性物質，所望の結合基の性質や長さ
などに依存している。
本発明は，界面動電的場における分子の相対的移動に基
づいて，分子の分離を成すものである。支持電解質（発
明の背景を参照のこと）の正味過剰な電荷と同じ電荷を
有する分子は，支持電解質より速く移動する傾向にある
だろう。帯電していない分子は支持電解質の速度で移動
するであろうし，また反対の電荷を有する物質は支持電
解質より遅く移動するであろう。
分離の条件は非常に非回避的である。これにより，分子
の他の性質を使って分離を行うことが可能となる。例え
ば，ある分子を他の荷電分子に選択的に結合して，この
最初の分子に電荷を付与することができる。
これは，こと２つの分子の疎水性を釣り合わせることに
よって，例えば第１の荷電物質のミセル状分散を作り次
いで第２の帯電していない物質をこのミセルに選択的に
結合させることによって，行うことができる。これによ
り事実上第２の物質に電荷が付与されるであろう。他の
技術としては，混合液pHを変えて，混合液中のある分子
を選択的にプロトン化あるいは脱プロトン化することに
よりその界面動電的可動性を変えることが可能である。
本発明では，オンカラムに供給されたコヒーレント放射
源，すなわちレーザを使って螢光性スピシーズを励起し
ている。連続レーザあるいはパルスされたレーザが使用
できる。約20wまでのような低パワーから中パワーのレ
ーザで良好な結果が得られる。必要に応じてより高いパ
ワーのレーザも使用できるが，利益をもたらすことは見
出されておらず，しかも試料を不必要に加熱するという
欠点を有する可能性がある。コヒーレント光源の波長
は，測定されている螢光分子の励起波長とマッチさせる
必要がある。すなわち，それは螢光を例示するのに有効
な波長であるべきである。
コヒーレント光を使うことは，それがレンズやミラーに
よって，より重要なことには，ファイバ光学部品によっ
ても同様に，直接試料通路に効率良く便利に与えられる
という重要な利点をもたらす。
コヒーレント励起エネルギーのビームは，試料の流れを
横切るように試料に加えることができ，あるいは必要に
応じて，液体の流れの方向と同軸に，あるいは流れ方向
に逆らって加えることもできる。螢光の測定は従来の測
定法を用いて行われる。これらは連続測定，もしくは間
欠測定すなわち時間ゲート測定であり得る。これらの測
定は螢光放射のある選択された波長で行われる。測定
は，試料通路上の励起が生じるのと同じ地点で，あるい
は励起地点より下流で，行なってよい。長寿命のフルオ
ロフォア（例えば，螢光性物質）の場合には，あるいは
励起が流れとともに伝達されてあるいは流れと逆に伝達
されて供される場合は，下流で測定するのが有利であ
る。励起や検出のための角度は同平面でよく，あるいは
必要に応じて変えることにより干渉，反射などを除いて
もよい。
螢光検出器で生じた信号は記録され，また／あるいはそ
れは制御信号として使用される。記録は標準チャート式
記録計などにより行い得る。制御信号は，例えば予備環
境中の螢光性スピシーズを捕らえるあるいは集めるよう
にバルブを開閉するために利用できる。
【図面の簡単な説明】
第１図は電気浸透輸送のプロセスを説明するための液で
充たされた管の断面図，第２図は界面動電分離のプロセ
スを説明するための液で充たされた管の断面図，第３図
は本発明を実施するための装置の一例の一部をブロック
で示す説明図，第４図は本発明で用いられるオンカラム
光学螢光測定セルの一例の断面図，第５図は本発明を用
いて得られ，検出された分離を示す代表的な２例の通電
クロマトグラフィ（エレクトロフェログラム）を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−94246（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−242368（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−220860（ＪＰ，Ａ)

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】電気的に輸送可能な液体試料中の分子の存
    在を検出するための蛍光アッセイ法であって、蛍光特性
    が該分子の存在で変化し、該方法は以下の工程を包含す
    る： （ａ）電解質を含む、小径の、両端開口の、壁を有する
    通路の一端に、該試料を配する工程、ここで、該通路の
    少なくとも一部が半透明であり、 （ｂ）該試料に対して充分な電位を印加して、それによ
    って該試料が該通路内を輸送されるようにする工程、 （ｃ）該半透明部に、該分子が存在するとき蛍光特性に
    変化を起こすのに有効な波長のコヒーレント放射を照射
    する工程、及び （ｄ）該分子が該半透明部を通過する際の該通路の該半
    透明部で発せられる蛍光中の変化を検出する工程。
  2. 【請求項２】前記コヒーレント照射が、ファイバー光学
    装置によってビームとして前記試料に加えられる特許請
    求の範囲第１項に記載の蛍光アッセイ法。
  3. 【請求項３】前記通路が水性液体電解質を含む、特許請
    求の範囲第１項または第２項に記載の蛍光アッセイ法。
  4. 【請求項４】前記壁を有する通路が管状である特許請求
    の範囲第１項、第２項または第３項に記載の蛍光アッセ
    イ法。
  5. 【請求項５】前記分子が放射に反応して蛍光を発し、前
    記検出される変化が蛍光の増加である、特許請求の範囲
    第１項から第４項のいずれかに記載の蛍光アッセイ法。
  6. 【請求項６】前記電解質が放射に反応して蛍光を発し、
    前記検出される変化が蛍光の減少である特許請求の範囲
    第１項から第４項のいずれかに記載の蛍光アッセイ法。
  7. 【請求項７】前記試料中の、複数の分子の各々の存在を
    検出するための、特許請求の範囲第１項から第６項のい
    ずれかに記載の方法であって、該分子の存在下で蛍光特
    性が変化し、該方法は以下の工程を包含する： （ａ）小径の、両端開口の、壁を有し、該複数の分子の
    互いの界面動電分離がなされるのに充分な長さと、該長
    さ以降の少なくとも一部に半透明部とを有する通路の一
    端に、該試料を配する工程、 （ｂ）該試料に対して有効な電気的輸送及び電気泳動分
    離電位を印加し、それによって該試料が該通路内を輸送
    されるようにし、該複数の分子を互いに界面動電的に分
    離する工程、 （ｃ）該試料が該半透明部を通過する際に、該半透明部
    に該分子が存在するとき蛍光特性に変化を起こすのに有
    効な波長のコヒーレント放射を照射する工程、及び （ｄ）該個々の分離された分子が該通路の該半透明分を
    通過する際に、該半透明部で発せられる蛍光中の変化を
    検出する工程。
  8. 【請求項８】前記通路が500ミクロンを超えない断面長
    さを有する、特許請求の範囲第１項から第７項のいずれ
    かに記載の蛍光アッセイ法。
  9. 【請求項９】キラル化合物を分離するためのプロセスで
    あって、該プロセスは以下の工程を包含する： （ａ）該化合物を、界面動電領域中の、電気的に輸送可
    能なキラル支持電解質中に配する工程；及び （ｂ）該領域中の支持電解質に、有効な界面動電的電位
    を、該キラル化合物を分離するのに有効な期間印加する
    工程。
  10. 【請求項１０】前記キラル支持電解質が、分離されるキ
    ラル化合物と差動的に反応するキラル分子を含み、それ
    によって分離される化合物に異なる界面動電的移動度を
    与える、特許請求の範囲第９項に記載のプロセス。
  11. 【請求項１１】前記界面動電的領域が、小径の、両端開
    口の、壁を有する通路中の電気的に輸送可能な媒体であ
    る、特許請求の範囲９または10に記載のプロセス。
  12. 【請求項１２】液体試料中の蛍光特性における変化を起
    こす分子の存在を示すための装置であって、該装置は以
    下の手段を備える： （ａ）小径の、両端開口の、壁を有する、少なくとも一
    部分が半透明である、該試料を収容するための通路、 （ｂ）該試料に充分な電場を印加し、該試料をその分子
    に分離し、そして該分子を該半透明部を超えて通路中を
    輸送するための手段、 （ｃ）該分子の存在下で、半透明部で蛍光特性を変化さ
    せる波長のコヒーレント放射を該半透明部に照射するた
    めの手段、及び （ｄ）該半透明部で発せられる蛍光を集めるための手
    段。
  13. 【請求項１３】前記通路が界面動電領域を形成してい
    る、特許請求の範囲第12項に記載の装置。
  14. 【請求項１４】前記通路が、管状の、壁を有する通路で
    ある、特許請求の範囲第12項または第13項に記載の装
    置。
  15. 【請求項１５】液体電解質により支持された試料中の、
    複数の分子を分離し、検出するためのシステムであっ
    て、ここで該分子の存在下で蛍光が変化し、該システム
    は以下の（ａ）から（ｄ）の手段を備えた装置を有し： （ａ）小径の、両端開口の、壁を有する、少なくとも一
    部分が半透明である、該試料を収容するための通路、 （ｂ）該試料に充分な電場を印加し、該試料をその分子
    に分離し、そして該分子を該半透明部を超えて通路中を
    輸送するための手段、 （ｃ）該分子の存在下で、半透明部で蛍光特性を変化さ
    せる波長のコヒーレント放射を該半透明部に照射するた
    めの手段、及び （ｄ）該半透明部で発せられる蛍光を集めるための手
    段、 ここで、該通路は該複数の分子の互いの界面動電分離が
    なされるのに充分な長さであり、そして半透明検出部に
    接続され且つ連通されている；そして該システムは以下
    の手段を有する； （ｅ）該試料を該通路内に供給するための手段、 （ｆ）該試料が供給される前後に於いて該通路に該電解
    質を供給するための手段、 （ｇ）該試料が該通路内を輸送させるようにしそして該
    複数の標的分子を互いに界面動電的に分離するために、
    該通路に沿って且つ該検出部を通じて、有効界面動電電
    位を印加するための手段、 （ｈ）該試料が該検出部を通過する際に、該半透明部に
    コヒーレント放射の波長を与え、該半透明部で発せられ
    た蛍光が変化するようにする手段、および （ｉ）該検出領域で発せられた蛍光中の変化を該半透明
    部を介して検出するための手段。
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