JP3216247B2 - 電気泳動分析方法 - Google Patents
電気泳動分析方法Info
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- fluorescent substance
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は基礎的な生化学の研究か
ら臨床検査などの応用に及ぶ生化学物質の超微量分析に
用いるのに適する電気泳動分析方法に関するものであ
る。
ら臨床検査などの応用に及ぶ生化学物質の超微量分析に
用いるのに適する電気泳動分析方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸などの生化学物質の分析では、
各種の色素を用いて目的物質を標識した後、高速液体ク
ロマトグラフィーなどの分離手段により分離し、検出位
置で吸光検出する方法がよく用いられている。最近で
は、高速液体クロマトグラフィーの代りに高速液体クロ
マトグラフィーよりも分離性能の優れたキャピラリー電
気泳動法が用いられることもある。キャピラリー電気泳
動法では注入する試料の量が１ｎｌ程度と小さいため、
高感度検出器が必要となる。そのため、試料を螢光物質
で標識した後、キセノンランプなどを光源に用いる蛍光
検出器を利用することが多い。最近では高輝度レーザを
光源とする蛍光検出器も研究レベルでは使用されてい
る。しかし、レーザを用いる方法は、レーザの価格が高
く、また維持や保守等にも問題があり、ほとんど実用化
されるには至っていない。
各種の色素を用いて目的物質を標識した後、高速液体ク
ロマトグラフィーなどの分離手段により分離し、検出位
置で吸光検出する方法がよく用いられている。最近で
は、高速液体クロマトグラフィーの代りに高速液体クロ
マトグラフィーよりも分離性能の優れたキャピラリー電
気泳動法が用いられることもある。キャピラリー電気泳
動法では注入する試料の量が１ｎｌ程度と小さいため、
高感度検出器が必要となる。そのため、試料を螢光物質
で標識した後、キセノンランプなどを光源に用いる蛍光
検出器を利用することが多い。最近では高輝度レーザを
光源とする蛍光検出器も研究レベルでは使用されてい
る。しかし、レーザを用いる方法は、レーザの価格が高
く、また維持や保守等にも問題があり、ほとんど実用化
されるには至っていない。
【０００３】本発明者らは、蛍光標識したアミノ酸をキ
ャピラリー電気泳動法により分離した後、６７０ｎｍで
発振する半導体レーザを光源とする蛍光法により検出す
る方法を提案している（Anal. Chem., 64, 711 (1992)
参照）。蛍光法の励起光源として半導体レーザを用いる
利点は、検出器を小型にすることができ、また耐久性も
優れているので１年以上に渡ってメンテナンスフリーが
達成できるなど、実用的な点にある。
ャピラリー電気泳動法により分離した後、６７０ｎｍで
発振する半導体レーザを光源とする蛍光法により検出す
る方法を提案している（Anal. Chem., 64, 711 (1992)
参照）。蛍光法の励起光源として半導体レーザを用いる
利点は、検出器を小型にすることができ、また耐久性も
優れているので１年以上に渡ってメンテナンスフリーが
達成できるなど、実用的な点にある。
【０００４】しかし、発表の時点ではまだ超微量分析を
達成するには至らなかった。それは、標識色素の反応効
率及び高純度化が不十分であり、標識効率が低かったか
らである。そこで、本発明は半導体レーザの深赤色域に
吸収をもつ螢光物質を標識試薬として利用し、電気泳動
法により超微量分析を可能にすることを目的とするもの
である。
達成するには至らなかった。それは、標識色素の反応効
率及び高純度化が不十分であり、標識効率が低かったか
らである。そこで、本発明は半導体レーザの深赤色域に
吸収をもつ螢光物質を標識試薬として利用し、電気泳動
法により超微量分析を可能にすることを目的とするもの
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明はアミノ基を有し
螢光物質で標識された試料をキャピラリー電気泳動法に
より分離し、検出位置で半導体レーザからの励起光を試
料に照射して励起し試料からの蛍光を検出する分析方法
において、螢光物質として６７０〜８５０ｎｍの深赤色
域に吸収を有し、アミノ基と結合する置換基を有する色
素を用いる。
螢光物質で標識された試料をキャピラリー電気泳動法に
より分離し、検出位置で半導体レーザからの励起光を試
料に照射して励起し試料からの蛍光を検出する分析方法
において、螢光物質として６７０〜８５０ｎｍの深赤色
域に吸収を有し、アミノ基と結合する置換基を有する色
素を用いる。
【０００６】励起光源としての半導体レーザーとしては
６７０ｎｍ、７８０ｎｍ、８２０ｎｍなど、深赤色域の
波長で発振するものを用いることができる。励起光源と
しての半導体レーザは、半導体レーザの他に、半導体レ
ーザ励起ＹＡＧレーザ、半導体レーザをポンピング光源
とするレーザなども含んでいる。
６７０ｎｍ、７８０ｎｍ、８２０ｎｍなど、深赤色域の
波長で発振するものを用いることができる。励起光源と
しての半導体レーザは、半導体レーザの他に、半導体レ
ーザ励起ＹＡＧレーザ、半導体レーザをポンピング光源
とするレーザなども含んでいる。
【０００７】標識試薬として用いる螢光物質は、深赤色
域に吸収をもつ螢光物質を基本骨格とし、アミノ基と結
合する活性置換基を備えた色素である。アミノ基と結合
する活性置換基はスクシンイミドやイソチオシアネート
などである。具体的な螢光物質としては、ピロニンスク
シンイミドエステルを挙げることができる。
域に吸収をもつ螢光物質を基本骨格とし、アミノ基と結
合する活性置換基を備えた色素である。アミノ基と結合
する活性置換基はスクシンイミドやイソチオシアネート
などである。具体的な螢光物質としては、ピロニンスク
シンイミドエステルを挙げることができる。
【０００８】
【化１】
【０００９】また、螢光物質は色素分子の水溶性を高め
るために、スルホン酸などの置換基をもっていてもよ
い。生化学物質のアミノ基以外の置換基、例えばフェニ
ール基やチオニル基などと結合する螢光物質を標識試薬
としてもよい。本発明で分析する対象は、アミノ基を有
する生化学物質であり、アミノ酸、核酸、核酸由来の生
化学物質、蛋白質などである。本発明はまた、ＤＮＡの
シーケンス決定にも利用することができる。
るために、スルホン酸などの置換基をもっていてもよ
い。生化学物質のアミノ基以外の置換基、例えばフェニ
ール基やチオニル基などと結合する螢光物質を標識試薬
としてもよい。本発明で分析する対象は、アミノ基を有
する生化学物質であり、アミノ酸、核酸、核酸由来の生
化学物質、蛋白質などである。本発明はまた、ＤＮＡの
シーケンス決定にも利用することができる。
【００１０】
【作用】アミノ酸などのアミノ基を有する生化学物質に
例えばスクシンイミド基を有するピロニン化合物を化学
結合させて蛍光標識する。これをキャピラリー電気泳動
により泳動させながら分離し、キャピラリーの出口の検
出器で例えば６７０ｎｍの半導体レーザ光を照射する。
蛍光標識された試料がその検出部に到達するとレーザ光
で励起されて蛍光を発する。その蛍光を光電子増倍管な
どの検出器で検出する。
例えばスクシンイミド基を有するピロニン化合物を化学
結合させて蛍光標識する。これをキャピラリー電気泳動
により泳動させながら分離し、キャピラリーの出口の検
出器で例えば６７０ｎｍの半導体レーザ光を照射する。
蛍光標識された試料がその検出部に到達するとレーザ光
で励起されて蛍光を発する。その蛍光を光電子増倍管な
どの検出器で検出する。
【００１１】
【実施例】図１は本発明が適用される一例としてのキャ
ピラリー電気泳動装置を示したものである。内径が約５
０μｍのキャピラリー２の一端（図では右端）にピロニ
ンスクシンイミドエステルで標識された試料が注入さ
れ、その試料注入端がリザーバ３のバッファ液に浸され
る。キャピラリー２の他端にはシースフローセル６が設
けられ、キャピラリー２を泳動し分離されて流出してき
た試料は、ポンプ８により送られる純水などのキャリア
でシースフローとなってリザーバ１２へ流される。キャ
ピラリー２の両端間には高電圧電源４によって泳動電圧
が印加される。
ピラリー電気泳動装置を示したものである。内径が約５
０μｍのキャピラリー２の一端（図では右端）にピロニ
ンスクシンイミドエステルで標識された試料が注入さ
れ、その試料注入端がリザーバ３のバッファ液に浸され
る。キャピラリー２の他端にはシースフローセル６が設
けられ、キャピラリー２を泳動し分離されて流出してき
た試料は、ポンプ８により送られる純水などのキャリア
でシースフローとなってリザーバ１２へ流される。キャ
ピラリー２の両端間には高電圧電源４によって泳動電圧
が印加される。
【００１２】シースフローセル６ではキャピラリー２の
出口近傍に励起光として発振波長６７０ｎｍの半導体レ
ーザ１４からの光がフィルタ１６及びレンズ１８を経て
集光されて照射される。半導体レーザ光で励起されて試
料から発生する蛍光を取り出すために、励起光入射方向
と直交する方向に集光レンズ２０が配置され、レンズ２
０で集光された光の光路上には蛍光成分を取り出すため
に、例えば７００ｎｍより長波長側に透過特性をもつフ
ィルタ２４が配置され、フィルタ２４を透過した蛍光を
受光するために蛍光光路上にはピンホール２６を経て光
電子増倍管２８が配置されている。３０は光電子増倍管
２８の負高圧電源、３１は光電子増倍管２８の検出信号
を記録する記録計である。
出口近傍に励起光として発振波長６７０ｎｍの半導体レ
ーザ１４からの光がフィルタ１６及びレンズ１８を経て
集光されて照射される。半導体レーザ光で励起されて試
料から発生する蛍光を取り出すために、励起光入射方向
と直交する方向に集光レンズ２０が配置され、レンズ２
０で集光された光の光路上には蛍光成分を取り出すため
に、例えば７００ｎｍより長波長側に透過特性をもつフ
ィルタ２４が配置され、フィルタ２４を透過した蛍光を
受光するために蛍光光路上にはピンホール２６を経て光
電子増倍管２８が配置されている。３０は光電子増倍管
２８の負高圧電源、３１は光電子増倍管２８の検出信号
を記録する記録計である。
【００１３】図１の装置を用いてピロニンスクシンイミ
ドエステルで標識したアミノ酸を分析した結果を図２に
示す。横軸は溶出時間、縦軸は蛍光強度を表わしてい
る。ピークの記号Argはアルギニン、Blankはブランク、
Alaはアラニン、Glyはグリシン、Gluはグルタミン酸、A
spはアスパラギン酸である。この測定で、グリシンにつ
いて検討したところ８００ｚmol（ｚmol＝１０-21mol）
の検出限界が得られ、本発明方法により超微量分析が可
能であることが確認された。実施例は本発明を高感度分
析の一例としての蛍光分析法に適用しているが、半導体
レーザを用いる他の分光分析法、例えば熱レンズ吸光分
析法などに本発明を適用してもよい。
ドエステルで標識したアミノ酸を分析した結果を図２に
示す。横軸は溶出時間、縦軸は蛍光強度を表わしてい
る。ピークの記号Argはアルギニン、Blankはブランク、
Alaはアラニン、Glyはグリシン、Gluはグルタミン酸、A
spはアスパラギン酸である。この測定で、グリシンにつ
いて検討したところ８００ｚmol（ｚmol＝１０-21mol）
の検出限界が得られ、本発明方法により超微量分析が可
能であることが確認された。実施例は本発明を高感度分
析の一例としての蛍光分析法に適用しているが、半導体
レーザを用いる他の分光分析法、例えば熱レンズ吸光分
析法などに本発明を適用してもよい。
【００１４】
【発明の効果】本発明では励起光源として半導体レーザ
を用いるので、検出器を小型化でき、耐久性が優れて１
年以上のメンテナンスフリーが達成でき、実用的な分析
方法となる。またレーザ光の集光性を利用して極微小・
超高感度分析が可能になる。半導体レーザの深赤色域で
は蛍光性の物質が少なく、分析に妨害を与える成分が少
ない。試料を標識する蛍光物質としてスクシンイミドエ
ステルを用いると、標識効率が高く、超微量分析が可能
になる。キャピラリー電気泳動の利点を活かして多数の
成分を高い分離効率で分析することができる。
を用いるので、検出器を小型化でき、耐久性が優れて１
年以上のメンテナンスフリーが達成でき、実用的な分析
方法となる。またレーザ光の集光性を利用して極微小・
超高感度分析が可能になる。半導体レーザの深赤色域で
は蛍光性の物質が少なく、分析に妨害を与える成分が少
ない。試料を標識する蛍光物質としてスクシンイミドエ
ステルを用いると、標識効率が高く、超微量分析が可能
になる。キャピラリー電気泳動の利点を活かして多数の
成分を高い分離効率で分析することができる。
【図１】本発明が適用される一例としてのキャピラリー
電気泳動装置を示す概略構成図である。
電気泳動装置を示す概略構成図である。
【図２】一実施例で得られたクロマトグラムを示す図で
ある。
ある。
２ キャピラリー ４ 泳動用高電圧電源 ６ シースフローセル １４ 半導体レーザ １８，２０ レンズ ２８ 光電子増倍管
Claims (2)
- 【請求項１】 アミノ基を有し螢光物質で標識された試
料をキャピラリー電気泳動法により分離し、検出位置で
半導体レーザからの励起光を試料に照射して励起し試料
からの蛍光を検出する分析方法において、 前記螢光物質として６７０〜８５０ｎｍの深赤色域に吸
収を有し、アミノ基と結合する置換基を有する色素を用
いることを特徴とする電気泳動分析方法。 - 【請求項２】 前記螢光物質がスクシンイミドエステル
である請求項１に記載の電気泳動分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20070692A JP3216247B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | 電気泳動分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20070692A JP3216247B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | 電気泳動分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07110297A JPH07110297A (ja) | 1995-04-25 |
| JP3216247B2 true JP3216247B2 (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=16428878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20070692A Expired - Fee Related JP3216247B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | 電気泳動分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3216247B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106568754A (zh) * | 2016-11-06 | 2017-04-19 | 浙江大学 | 一种用于测量液体样本多光子荧光光谱的光学系统 |
-
1992
- 1992-07-03 JP JP20070692A patent/JP3216247B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07110297A (ja) | 1995-04-25 |
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