JPS6273138A - 螢光検出及び界面動電分離の方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は電気泳動の分野に関し、より詳細には。

１１８０筒状キヤピラリ（ｏｐｅｎ４ｕｂｕｌａｒ　ｃ
ａｐｉｌｌａｒｙ）内ての界面動電分離を行い及び検出
するだめの改良された方法及び装置に関する。

（従来の技術） プレトリウス（Ｐｒｅｔｏｒｉｕｓ）等は３接線方向に
印加された電界の影宮下に固体面と接触した液の流れで
あるという電気浸透の考えを１９７４年に示した（ジャ
ーナルオブクロマトグラフィ（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒ、）。

９９、２３　＞。表面の上のイオンの選択的吸着に基づ
き、電気浸透流によって固液界面に於ける電気二重層が
形成されると考えられていた。この輸送プロセスを第１
図に示す。第１図には、小径のる二重又は両端間ｌ］の
管ＩＯの断面が示されている。連管は、専電性の液１１
　（本明細書に於いては「支持電解質」と称することも
ある）によって充たされている。管１０の壁は選択的に
吸着された陽イオン１２を含んでいる（管１０の材質に
よっては、吸着される電荷は負の場合もある）。陽イオ
ン１２は導電液１１からアニオン１３を吸引し、電気二
重層１４を形成する。連壁へのアニオンのその選択的吸
引によって、液１１の内部では正電荷が過剰となる。従
って、管１０内の液１１の柱の両端に位置する電極１５
゜１６間に２例えば３０ｋＶの電位差を与えて電界を印
加すると、正に帯電している液は陰極の力に移動する。

プレトリウス等はこのプロセスを５薄膜、高速の液クロ
マＩ・グラフィに用いるごとを提案している。　　　　
− ミソカーズ等は、小径（例えば、０．２〜０．３５ｍｍ
）の管を高パーフォーマンスゾーン電気泳動に用いるこ
とを１９７９年に示した（ジャーナルオブクロマトグラ
フィ、υ３９　、１１　）。最近では、ジエー、ダブリ
ュ、ジョルゲンソン（Ｊ、　Ｗ、　Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ
）及びチー。ディー、ルカクス（Ｋ、　Ｄ、　Ｌｕｋａ
ｃｓ）は、そのような分離を行うために、７５μｍのガ
ラスキャピラリを用いることをｔｇ＝している（ジャー
ナルオブクロマトグラフィ、肢（１９８１）、　２０９
　　；　　アナリティカルケミストリ（八ｎａ１．　Ｃ
ｈｅｍ）、、　５，４（１９８１）。

１２９８　；及びサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　
２２２（１９８３）　。

２６６）。ラダ（Ｔｓｕｒｊ、］）等は同様のことを報
告している（ジャーナルオブクロマトグラフィ、　２４
８　（１９８２）。

２４１及びηＩユ（１９８３）、　３８５）。キャピラ
リの通路を用いることの利点は、試料の流れを妨げるジ
ュール熱〃ノ果が少なくなることである。

分離プロセスは、上述の電気浸透効果と、　？ｒｊ、媒
体内の溶質の電荷の陽、中性、陰に応した溶質に対する
電界の差動（ｄｉｆＩｅｒｅｎｔｉａｌ）効果とに依存
する。これらの関連する効果を第２図を用いて説明する
。第２図は第１図と同様のものであるが、液１１中の各
スビシーズの荷電スピシーズ（ｃｈａｒｇｅｄｓｐｅｃ
ｉｅｓＨ８、１９が示されている。カチオンスピシーズ
１８は電気泳動的に陰極１６の方に吸引される。

アニオンスピシーズＩ９は陰極１６から反発される。

第２図に示されているように、また１通常の場合そうで
あるように、液１１の速度は？容液中のスビシーズの電
気泳動速度よりも大きいので、全てのスビシーズは、速
度は異なっているが同し電気浸透流の方向に移動してい
るように見える。電気浸透流と電気泳動との組合せを、
各文献及び本明細書では「界面動電（ｅｌｅｃｔｒｏｋ
ｉｎａｔｉｃ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ）　Ｊと弥している。

また、これらの２効果による分、２ｉ１ｔを「界面動電
分離（ｃｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ　５ｅｐａｒａｔ
ｉｏｎ）　　ｊと称している。

（発明が解決しようとする問題点） 更に、電気浸透流は３層流とは対照的なプラグ流の特性
を有している。これにより高分解能の分角１１となる。

界面動電分離を溶液中のスピシーズの分離に用いること
は理論的には可能であり、原理的にはこれらの分離を検
出することもできる。しかし、ジョルゲンソン及びルカ
クスがサイエンス話中の結論で述べているように、［（
そのような分離法に於ける）キャピラリの更なる開発と
利用に対する最大の障害は、極めて高感度の検出が必要
なことであり、より多くのタイプの高感度検出法の出現
が熱望されている」のである。界面動電分ｉ’ｉ’ｆｌ
柱中を運動しているスピシーズの存在を示すために従来
用いられている検出器のスピソーズ類には次のようなも
のがある。（１）ミソカーズ等により用いられた紫外線
吸収及び導電性；（２）ジョルゲンソン及びルカクスに
より用いられたランプ励起によるオンカラム（ｏｎ−ｃ
ｏｌｕｍｎ）螢光検出：（３）ラダ等により用いられた
紫外線検出。ジオ−クリ、ンナソヨナルラボラトリ（Ｌ
Ｌ＋ｃ　Ｏａｋ　Ｒｉｄｇｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌｌ、ａ
ｈｏｒａ　ｔｏｒｙ）のディピッド等は、コントラクト
（ｃｏｎＬｒａｃｔ）Ｗ−７４０５−ｅｎｇ−２６に於
ける研究報告０ＲＮＬ／ＴＭ−９１４１の中で、オンカ
ラムランプ励起螢光検出システ１、及びそれをキャピラ
リ電気泳動システムで用いることを開示している。適切
な検出システムを１′Ａ訳することは、高電圧が用いら
れる場合の操作杆の安全性を実際に考慮するならば、よ
り困難である。測定されている試料中に数＋ｋＶ程度の
電位が存在する場合には、検出器は信φｎ性のあるもの
でなければならず、しかも、操作者が試料自重又は直接
その周辺を掻作するようなものであってはならない。

本発明の目的のひとつは、従来より求められている改良
された方法及びシステムを提供するごとにある。また１
本発明の他の目的は、その改良された方法及びシステム
を用い２ことによってより高感度の界面動電アッセイ（
ａｓｓａｙ）法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の螢光アッセイ（ｆ　１ｕｏｒｏａｓｓａｙ）法
は、電気浸透的にポンプ可能（ｐｕｍｐａｂｌｅ）であ
り螢光可能（ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｉｂｌｅ）である液体
試料中の標的スピシーズの存在を検出するだめの螢光ア
ッセイ法であって５（ａ）電気浸透的にポンプ可能な液
で充たされた。

細孔又は小径−の、二重又は両端開口の、壁を有し。

少なくとも一部が半透明（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）で
ある。

通路内に、該試料を配すること、（ｂ）該ポンプ可能な
試料及びポンプ可能な液に対して有効電気浸透ボンピン
グ電位を印加して、該試料が該通路内を移動するようろ
こさせること、（Ｃ）該試料内に螢光を励起するのに有
効な波長のコヒーレント放射を該試料に照射すること、
及び（ｄｌ該標的スピシーズが該半透明部を通過する際
の該通路の該半透明部を介して出される螢光中の変化を
検出することを包含しており、そのことにより上記目的
が達成される。

また１本発明の検出方法は、電気浸透的にポンプ可能で
あり螢光可能である液体試料中の、複数の螢光変化３Ａ
ａ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｃｈａｎｇｅ−ｉｎｄ
ｕｃｉｎｇ）標的スビシースの存在を検出するだめの方
法であって、（ａ）電気浸透的にポンプ可能な液で充た
された。細孔又は小径の、二重又は両端開口の、壁を有
し、咳複数のスピシーズの互いの界面動電分離がなされ
るのに充分な長さと、該長さ以降の少なくとも一部に半
透明部とを有する１通路内に、該試料を配すること、（
ｂ）該ポンプ可能な試料及びポンプ可能な液に対して有
効電気浸透ボンピング及び電気泳動分離電位を印加して
、該試料が該通路内を移動するようにさせ、該複数の標
的スピシーズを互いに界面動電的に分離すること、（Ｃ
）該標的スビシーズが該半透明部を通過する際に、該試
料内に螢光を励起するのに有効な波長のコヒーレント放
射を該試料に照射すること、及び（ｄｌ該個々の分離さ
れた標的スピシーズが該半透明部を通過する際の該通路
の該半透明部を介して出される螢光中の変化を検出する
ことを包含しており、そのことにより上記目的が達成さ
れる。

本発明のキラル化合物を分離する方法は、（ａ）界面動
電領域内の、電気浸透的にポンプ可能なキラル支持電解
質内に該化合物を配すること、及び（ｂｌ該キラル化合
物を分離するのに有効な期間、該領域内の該支持電解質
に有効界面動電電位を印加すること、を包含しており、
そのことにより上記目的が達成される。

本発明の検出器は、液体試料中の螢光スビシーズの存在
を示すための検出器であって、（ａ）細孔又は小径の、
二重又は両端開口の、壁を有する。少なくとも一部が半
透明である。該試料を収容するための通路、（ｂ）該螢
光スビシーズ内に螢光を励起するのに有効な波長のコヒ
ーレント放射を該試料に照射するための手段、及び（Ｃ
１該螢光スピシーズによって出される螢光を該半透明部
を介して集めるための手段を備えており、そのことによ
り上記目的が達成される。

また１本発明の分離検出システムは、電気浸透的にポン
プ可能な液を含む試料中の、複数の螢光変化誘導標的ス
ピシーズを分離し、検出するためのシステムであって、
（ａ）電気浸透的にポンプ可能な液を収容するための、
細孔又は小径の、二重又は両端開口の、壁を有し、半透
明検出部に接続され且つ連通されている通路、（ｂ）該
試料を該通路内に供給するための手段、（Ｃ）該試料が
供給される前後に於いて該通路に浸透的にポンプ可能な
液を供給するための手段、（ｄ）該通路に沿って且つ該
検出領域を介して、有効界面動電電位を加えるための手
段、（ｅ）該試料が該検出部を通過する際に、該試料内
に螢光を励起するのに有効な波長のコヒーレント放射を
該試料に与えるための手段、及び（［１該螢光変化誘導
スピシーズが該検出部を通過する際に、出された螢光中
の変化を該半透明部を介して検出するだめの手段を備え
ており、そのごとにより」二記目的が達成される。

検出ポリニーム（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ）
を介して支持電解質中を通過する際の界面動電的に輸送
される標的スピシーズの検出を５該検出ボリユームを介
しての該スピシーズの通過に関連する検出事象（ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ　ｅｖｅｎｔ）が、コヒーレント源により
オンカラムに供給された電磁放射のビームによって発生
された放出光（特に５螢光）の変化である場合に於いて
、高効率で行うことができるごとが見出された。コヒー
レント放射源を用いることは。

よく規制された波長の放射を、非コヒーレント光源と比
較して、危険なく１強度のかなりの１員失もなく、更に
ｌｉ々乱先による望ましくない干渉もなく。

オンカラムで試料に供給することかできる。コヒーレン
ト放射を用いることによって、ラマン及びレイリー散乱
からの干渉が最小になるので、感度が増大する。この検
出システムにより、化合物の混合物の分析及び／又は分
離が高い効率で可能となる。本発明の検出システムを用
いて、フェムトモル（１０−”モル）以下の範囲の標的
の世を検出することができる。

他の面では１本発明は、界面動電分離プロセスに用いる
検出器を提供するものである。この検出器は、螢光分析
のためのオンカラムコヒーレント勃起源を備えている。

本発明の更に他の面によって、光学的活性の（即ち、キ
ラル）支持液（ｓｕｐｐｏｒｔ　１ｉｑｕｉｄ）が界面
動電分離プロセスに用いられる場合に生ずる。ラセミ混
合物の光学的活性成分への界面動電分１Ｘｆｆか提１共
される。

（以下余白） 実ｊ１江上 レーザ励起螢光検出器を備えた界面動電分離系を構成し
た。第３図および第４図によりこの系を説明する。この
系には、全長７５ｃｍ、内径１５１ｔｍの融解石英キャ
ピラリ３０　（ヒューレソトーバノカード社製）が含ま
れる。キャピラリはその外面に不透明のポリイミド保護
コーティング３１を有し、その一部は炎で除去され半透
明部３２となる。キャピラリ３０は、５ｍＭβ−ヒスチ
ジン、　　２．５ｍＭ　Ｃｕ５Ｏ４Ｈ５１１□０および
１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含みＮ　＋１４０１１−発
加えてｐｔ１７　８に調整した支持電解質で液体１１人
される。供給容器３４および流出容器３５も同＋Ａ５こ
支持電解質を含み、従って液体封入キャピラリ３０はそ
れら容器の間に連続的な液体連結および電気的連結を形
成する。電極３７と３９との間にそれぞれ配線４０およ
び４１を介して電源３６から一３０ｋＶの電位を印加し
、完全な電気回路とする。キャピラリ、ＪＯの内面は陽
イオンを選択的に吸着するようになっている。これによ
り電解質中のカチオンが優先的にキャピラリ壁に二層と
して引きつけられ１キャピラリ３０内の支持電解質の本
体に次々と正味陽電荷が付与される。流出容器３５の液
体に電極３９により−３０にνの電位をかけると、この
陽荷電液体はキャピラリ３０から容器３５へ電気浸透的
に引っばられ。

追加の電解質が容器３４からキャピラリ３０へ導入され
る。電流は３０−３３μ八であった。キャピラリ３０中
の液体の線速度は約１−２ｍ１／秒であった。

ギヤピラリ３０はフローセル４２を通り抜け、継手４４
および４５によりその半透明部３２が、所定位置に支持
される。半透明部３２はフローセル４２の中央で検出ボ
リュームを限定する。

フローセル４２には、オンカラム螢光検出器が含まれ１
　この検出器は励起源として波長３２５ｎｍで５ｍＷの
連続波出力を有する）ｌｅ−Ｃｄレーザ４６（リコニク
ス、モデル４２４０Ｂ　、　サニーヘール、　ＣＡ）を
使用する。レーザのフィルタ出力はレンズ４７を介して
光ファイバ４９　（８０μｍ、融解石英材）上に集めら
れ、レーザ光線は光ファイバ４９によりフローセル４２
へ運ばれる。ファイバ４９は、その出力がキャピラリ３
０の半透明部３２上に集められるように、３輔位置決め
ヘッド５０により所定位置に支持される。

検出ボリュームを介°して輸送されている液体から発す
る螢光は、　　０，６ｍｓの融解石英光ファイバ５１に
より励起ビームに垂直に集められる。ファイバ５１は３
輔位置決めへソド５２により所定位置に支持される。フ
ァイバ５１で集められた螢光は高域カットオフフィルタ
５３．可変波長帯域を選択するよう働く高速モノクロメ
ータ−５４（セントロニック　モデルＱ４２４９Ｂ　＞
　、および光電子増倍管５５を通過する。光電子増倍管
５５の出力は、キースリー　インスツルメント社型　モ
デル４８０ピコアンメーター（図示せず）により増幅さ
れ、配′１ｆＡ５６を介して帯形記録形５７に送られる
。

使用に際し、試料がキャピラリ３０に注入される。

これは、キャピラリ３０の四極端を容器５８に含まれる
液体試料中゛に浸し、陽極リート４０を電極５９に連結
し、６ｋＶの高圧を短期間（５−１０秒）かけるごとに
より２行われる。これにより、１から５鳳１長に限定さ
れた試料の“プラグがカラム３０に導入される。

以下のダンシル化アミノ酸各１０−’Ｍで構成される第
１の試料を、支持電解質で用いたのと同じ液体中で調製
した。

１−Ｔｙｒ −Ｔｙｒ −Ｐｈｅ Ｌ　　Ｐｈ（う −Ａｓｐ １−　、へ　ｓｐ −Ｑｌｕ ＧＩｕ （り！激化アミノ酸はシグマ　ケミカル社、七ン１−ル
イス、ＭＯから購入するか、またはＴａｐｕｈｉ、　ａ
ｔ　ａｌ。

（１）　　、　　へｎ礼　　Ｂヨｉｏｃｈｅｍ、　　　
　１１５．　　１２３　　　（１９８１）、　　　ａｎ
ｄＴａｐｕｔ＋ｉ、。ｔ　ａｌ、　（［Ｉ）　、ムー艶
し９明県１旦　？肌−３２５（１９８１）の方法で、！
！Ｉ′！！シた。支持電解質液はｌ−ヒスチジンの銅（
Ｉｆ）錯体を含む。この錯体は光学的に活性で、従って
支持′電解質はキラル支持電解質である。４ｍの光学活
性なペアはカラム３０中を（多動するに従って互いに分
離される。また。

分離は各ペアの光学異性体のメンバー間でも生じる。８
個の分子、Ｉｔスピシーズそれぞれが検出ボリュームを
通過するとそれらが検出される。この場合。

それらのダンシル標識が螢光を発し、これが検出される
。結果を第５図ａに通電クロマトグラフィー（エレクト
ロフェログラム）として示す。ここではレーザ励起螢光
信号を時間に対しプロットしている。次に、支持液中の
ｌ−ヒスチジンの２をｄ−ヒスチジンで置き換え、前の
実験で用いたのと等しい総濃度のｄ−ヒスチジンとＣ−
ヒスチジンとの１：１混合液を得る。このキラリティー
のない支持電解質を用いて実験を繰り返したところ。

ｄ異性体を！異性体の分離は観察されなかっ１こ。

第５図すに示されるように１個々の・１つのピーク。

すなわち各アミノ酸に対し１つのピークが見られた。同
様に、１−ヒスチジンをｄ−ヒスチジンで完全に置き換
えると、ダンシル化されたｄアミノ酸異性体とｌアミノ
酸異性体の順序が逆になって分離が生じた。

従ってこれら３つの実験は、コヒーレント（ずなわち、
レーザ）エネルギー源によりオンカラムで励起された螢
光の変化を測定することは、小径通路内の電気浸透的に
ポンプ可能な液体中の分Ａｆｔスピシーズの存在を界面
動電プロセスにより検出するための有効かつ効率良い方
法である。という本発明の広い局面を説明するものであ
る。これら実験では約Ｑ、５ｎｌの検出ボリュームを用
いた。検出中のスピシーズは、電気浸透的にポンプ可能
な支持電解質１１あたり約１０−４モルの濃度であった
。

観察された信号対雑音比は１００：１より大きかった。

これらの要素を結合すると３本検出系は５×１０−”モ
ル（すなわち、フェムトモルを下まわる）標的スピシー
ズを検出できることがわかる。

これら実験はまた。界面動電分離プロセスを用いて光学
異性体を分離できる。という本発明の他の局面をもしめ
している。光学異性体のこの分離は、速度および感度の
両方の見地において先例がないと信じる。

失」１肌ｌ より広範なアミノ酸を用いて実施例１の実験を繰り返し
た。アミノ酸は様々な組み合わせて用いた。その結果を
表１に示す。表１は５本文で説明した条件下、ｐＨ８で
得られた。いくつかのｄ、　　Ｎ−ダンシル−アミノ酸
に対する移動時間（Ｌｄ。

ｔｐ）、　Δを値（弐（１）参照）および相対ピーク域
（Ａｄ、／ｌ）を示す。移動時間の再現性は±３％相対
標学偏差（Ｒ，Ｓ、Ｄ、）単位よりよく、また相対ピー
ク域では約±５％Ｒ，Ｓ、Ｄ、である。

（以下余白） 実施例１で観察され第５図ａおよびｂで示された優れた
信号対雑音比が、このより広範な試料についてもみられ
た。この信号対雑音比から、このより広範な標識アミノ
酸が簡便な現実験装置によりフェムトモル（１０−”モ
ル）あるいはそれより低いレベルで検出できることが示
された。次式で示される蛍の絶対等級Δｔが０．０１を
越える場合、基線解像が可能であることがわかる： Δ　ｔ＝　　（ｔ　ｄ　　−ｔ）　　＞／　　Ｃ’Ａ　
　（ｔ　ｄ　　＋　　ｔｓ　　　））式（１） ここで、む、およびｔｚ　はｄ光学異性体および！光学
異性体の移動時間である。支持電肩實中のｐ−ヒスチジ
ンをｄ−ヒスチジンで置き換えると。

ｄアミノ酸と！アミノ酸の移動順序が逆になる。

すなわち、Δｔの符号が変わる。第５図ａはまた。

同じダンシル−アミノ酸の２つの光学異性体に対する螢
光信号が異なることを示している。表１では、　１０個
の異なるｄ、１−ダンシル−アミノ酸ムこ対する内部標
準として！−フルギニンを用い、それをもとに移動時間
、Δを値および相対ピーク域が示されている。ｄ、７！
−セリン以外の全ての場合において解像が達成されてい
るが、Δｔの符号はアミノ酸により異なる。観察された
アミノ酸の移１すＪ順序はＨＰ　Ｌ　Ｃでみられたもの
（Ｌａｍ、　ａｔ　ａｔ、。

↓、　Ｃｈｒｏｍａｔｏ　、、　　１９９．２９５　（
１９８０）、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ−、
、−２３９、４５１（１９８２）参照）と異なるが、鏡
像異性体の移動順序はΔｔの符号で示されるように同じ
である。

本発明がいかに作用するかのいかなる特別な理論によっ
ても制限されることば望まないが、　Ｃｕ　（Ｉｆ）ｆ
ｆ−ヒスチジン支持電解質によるキラリティーの認識は
、ジアステレオマーの三元錯体を形成するための混合キ
レート錯体形式により説明することができる。以下の説
明は現データの全てと一敗する。Ｃｕ（ＩＩ）６−ヒス
チジンに結合したアミノ酸は遊＾１１アミノ酸より速く
移動する。これは使用したｐＨ条件下でＣｕＮＩ）　β
−ヒスチジンが陽電荷を有するからである。しかし、Ｃ
ｕ（［）／−ヒスチジンにより強く結合したアミノ酸は
より弱い螢光信号を示し、これは洞イオンとの結合によ
る消滅で生したものである。従って、より多く錯体が形
成された鏡像異性体は速く移動するが、銅イオンとの結
合による消滅で生じる弱い螢光信号を示す（第５図ａお
よび表１参照）。

尖施骸 ウシ　インシュリンをフルオレスセイン　イソチオシア
ネイト（ＦＩＴＣ）÷標識した。インシュリン（シグマ
　ケミカル社）　１０ｎｗを０．５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩
緩衝液（ｐｔｌ　９．５）　　６　ｍｌ、に熔解させた
。

ＦＩＴＣ（シグマ　ケミカル社）　　１．５ｍｇを添加
後。

混合液を４℃で一晩攪拌してインシュリンにＦ　ＩＴＣ
を連結した。

反応混合液を１．５Ｘ４０ｃｍセファデクス”Ｃ−２５
シリカゲル濾過カラムに配し、　０．ＯＩＭ−リン酸緩
衝塩溶液（ｐＨ７，４）で流速約１ｍｅ１分にて溶出さ
せた。未反応Ｆ　’Ｉ　Ｔ　Ｃはシリカゲルに吸着され
た。

ＦＩＴＣ−標識インシュリンを含む黄色のバンドをカラ
ムから取り出し、水５部にて希釈した゛。両性イオン緩
衝液　ＣＨＥＳＣ２ＣＮ−シクロへキシルアミノコエタ
ン　スルフォン酸）をｌｏｍＭレヘルレベ加え、溶液の
ｐｌｌを９までもっていった。

実施例１の装置で標識インシュリン溶液を用イた。５ｋ
Ｖの電位を１３秒間印加することにより、キャピラリカ
ラムに試料を設置した。次いで３０にνの電位をかけて
、試料をキャピラル中を界面動電的に輸送した。電流は
５．６ｍＡであった。オンカラムのレーザ励起は３２５
ｎｍであった。５１０ｎｍにて放射をモニターした。５
．５分と８．０分の間Ｓご、ＦＩＴＣ＋票１−へインン
エリンＳこ［１１当する一連のピークが示さてした。

１１、ミー、晦歌−Ａ−挫娑ユご−ｙ 実もか例３の実験を変更をｊＪｎえて２回像り返す。

太狗例４では、標識インシュリンの代わりに、ＦｌｒＣ
−標識コンカナハリンＡ（シグマ　ケミカル社、あるい
はフル力　ケミカル社、　ＩＩａｕｐｐａｕＢｅ。

Ｎ、Ｙ、から人手可能）の蛋白を用いる。キャピラリカ
ラム乙こ設置される供給混合液には、　　０．５ｍｇ／
ｍＮの蛋白と、ｐｌｌを８に保つ２０ｍＭ緩衝液とが含
まれる。

界面動電電圧を印加すれば、界面動電的に標識された蛋
白にトｎ当するピークが５から１０分までに１硯察され
るであろう。

実施例５では、標識インシュリンの代わりに。

ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗ヒトガンマグロブリンをリン酸緩
衝塩溶液（ｐＨ７，２）に溶かしたもの（シグマ　ケミ
カル社から入手可能）を用いる。ここでもまた１本発明
のオンカラムレーザ励起法を用いることにより、このイ
ムノグロブリンを検出領域中を輸送させて生じた螢光ピ
ークが観察されるであろう。

本発明がここで述べた実施態様に限定されないことはい
うまでもない。上述のキャピラリの代わりに、小径の細
長い、壁を有する３通路の形であればどんなものでも使
用できる。概括的な言葉でいえば、直径が約５００μｍ
を越えない通路を使うのが好ましい。より広径の通路は
、界面動電電位を印加した際に、過度の加熱を起こす可
能性がある。好ましい通路には、１本あるいは複数本の
通路が含まれ、それぞれの直径は約５００μｍまで。

特に約５μｍから約３５０μｍまでである。通路の断面
が小さいほど、検出領域のボリュームが小さくなり、従
って検出系の感度の必要性が大きくなることが認められ
よう。その構造が簡単であることから２円形断面のキャ
ピラリが好ましい。

通路は、界面動電的な力のもとでスピシーズの分離を行
うのに有効な長さのものでなければならない。通路が長
いほど、試料が通路中を移動するのに要する時間が長く
なり、従って様々なスピシーズが互いに分離されるであ
ろう距離が大きくなることが認められよう。同時に、ハ
ンドの拡張が生じ１従って長さを増すことによっては解
像度は改善されない。これらの要素から１通路の長さに
は実用上の制限が示唆されるが、必要に応じてより長い
ものあるいはより短いものも使用できる。

例えば、約５ｃｍという短い通路の長さで良好な結果が
得られる。同様に、数ｍより長い通路の長さによる多く
の通常の分析用セツティングでは１通路中の輸送時間が
不便なことに長くなる。一般に。

約１０　ｃｍから約２００ｃｍまでの通路の長さ、特に
約４０ｃｍから１５０ｃｍまでの通路の長さが好ましい
。より長い通路や短い通路１例えば４または５　ｒｎま
で長い通路あるいは約５　ｃｎ＋まで短い通陀も使用で
き。

本発明の思想に反しないことはいうまでもない。

細長い通路は、　ｉ’ｉｔ久性を有し支持電解質と接触
しても物理的にもとの状態を保持し、ンまた界面動電電
位を印加した際に伝真される電気が無視てきまた生じる
熱も無視できるように実質的に絶縁性であり、しかもそ
の内面に陽電荷あるいは陰電荷を帯びることができる。

という性質を有する材料で構成される。適切な材料とし
ては１通ｙとおよびそれに含まれる電解質のコンダクタ
ンスの々了ましくは少なくとも約９５％が電解質による
ようなコンダクタンスを有するものであろう。さらに、
検出用に通路内に含まれる通過液体から螢光が放射され
得るように９通路の一部は半透明である必要がある。通
路の半透明部分はまた。必要に応じて。

試料にコヒーレント励起エネルギーをインプットするた
めの人口として使用することもできる。離れた半透明検
出領域断片を用いこれに通路を連結することも可能であ
るが、この場合１半透明断片への通路の連結は、連結を
越えて界面動電電圧を印加した時に過度の過熱あるいは
アークが生しないように、または液体の流れに乱れが生
じないように１行う必要がある。本来その中に半透明部
分を有する連続通路を用いればこれらの問題は回避でき
る。石英、ガラスおよび融解石英のような無機物質、お
よびテフロン（ポリテトラフルオロエチレンおよびフン
化エチレン／プロピレン重合体）。

ポリクロロトリフルオロエチレン、アラミド、ナイロン
（ポリアミド）、ポリビニルフロラ・イド。

ポリビニルフルオライド、ポリスチレン、ポリエチレン
等のような有機物質が使用できる。

発明の背景の節で指摘したように、電気浸透的な流動は
１通路の内面が荷電スピシーズを運んだり吸着したりす
ると達成される。この内面は、より多くの陽電荷が付与
されるようにその表面を酸性液に接触させたり、より多
くの陰電荷が付与されるようにその表面を塩基性物質に
接触させたり。

あるいは電荷数を減らずためにその表面をシリル化剤に
接触させたりなどして、改変してその電荷を変えること
ができる。（トリメチルシランを使用して狭通路電気泳
動領域壁上の電荷宏度を減少させ、これにより領域中の
輸送を変化させること（７）　記ｉ　ニツイ”’Ｃハ、
　Ａｔ頃ｂ１月４上匹ル更占１月４．．５３゜Ｎｏ、　
８．　Ｊｕｌｙ　１９８１，１２９８を参照せよ。）当
業者に周知の他の表面改変技術も同様に使用できる。

試料を通じて印加される電圧は、過度に加熱されること
なく識別可能な界面動電的挙動が生しるのに有効な電圧
でなければならない。一般に約１０００Ｖより低い電圧
では小さすぎ、また約１００ｋＶより高い電圧は従来の
高圧電源では一般的でない。、ニア′ｌ。

ら実用上の制限に基づけば、約３にνがら杓９０ｋＶま
での電圧、特に約５ｋＶから約６０ｋＶまでの電圧か＆
Ｉ’ましい。電位の極性により、電気的に帯電されたス
ビシーズの移動方向が決定される。安全汀の理由から、
接地電位での分析系をできるだけ多く持つことが好まし
い。

通路には、電気浸透的にポンプ可能な支持液が充填され
る。液体が電解質であれば、すなわちそれが電気的に帯
電されたスピシーズを充分含むかあるいは運ふかして電
流を通すならば、液体は電気浸透的にポンプ可能である
。典型的な電気浸透的ポンプ可能な支持液は２例えば１
ｐあたり少なくとも約０．０００５モルのイオン性スピ
シーズを、好ましくは１ｒあたり約０．００１から約１
０モルのイオン性スピシーズを含む。このようなレベル
により。

高速度の界面動電的輸送が得られる。最も一般的には、
支持液は水をヘースにしたものか、あるいは混合された
水−有機液体系を・＼−スにしたものである。混合系は
、水だけては溶解度が］＠られている付機標的物質を可
溶化あるいは急病するのを助けるのに有用となり得る。

電気を伝導し得る適切な有機液体も使用できる。支持電
解質で用いる代表的な材料には、水、および水と混和可
能な１つ以上の有機物質を水に混合して成る混合溶媒が
ある。水と混和可能な有機物質としては次のようなもの
がある：酢酸、プロピオン酸、クロル酢酸などの低級（
例えば、１〜４炭素原子）アルカン酸；メチルアミンの
ような一級および二級の低級アルキルアミン；エタノー
ル、メタノールおよびプロパツールのような低級アルコ
ール−低級アルカンジオールのような低級ポリオール；
アセトニトリル、ピリジン、ピペリジンおよびキノリン
を含む含窒素液体；アセトンおよびメチルエチルケトン
のような低級ケトン、ＤＭＦ、Ｎ−メチルホルムアミド
、Ｎ−エチルホルムアミド、Ｎ−エチルアセトアミドな
どのような低級アルキルアミド。

これら物質は代表例にすぎなし）。実際には、それ自身
電解質であるかまたはイオン性スピシーズを運んで導電
性となり得るどんな液体も使用できる。

これら液体のどれを用いても、支持液には、塩。

キレートおよび他の錯体のような付加イオン性物質、酸
、塩基および緩衝液などが含まれてよい。

液体が界面動電通路中を通過する際のｐＨで両性イオン
である付加イオン性スビシーズを用いるのがしばしば好
ましい。代表的な物質には、無機酸のアルカリ金属塩、
アルカリ土類金属塩およびトランザクション金属塩；有
機酸のその様な塩；その様な酸のアンモニウム塩および
有機塩基塩；ハロゲン酸、有機酸およびその他の酸；金
属酸、金属水酸化物、アミンおよび他の塩基などがある
。典型的な両性イオンには、アミノ酸、およびシグマケ
ミカル社、セントルイス、ＭＯで市販されているＧｏｏ
ｄの緩衝液がある。これらの付加イオン性物質あるいは
イオン化可能な物質は、それらの主機能が支持電解質の
導電性を増すことにあるので。

それらが試料および支持電解質中の他の成分と和合可能
である限り、一般に以上の広範なりラスから随意に選ん
でよい。

１つの応用として１本発明はキラル支持電解質を用いて
、混合キラル化合物を鏡像異性体へ分離しまたこの分−
を検出する。キラル支持電解質は上述の基準を満たす液
体であるが、また、鏡（！、異性体の混合物の１メンバ
ーと選択的に相互作用してそれに混合物の他のメンバー
と異なる界面動電的移動度を優先的にもたらすであろう
１つ以上のキラルスピシーズを含有するという性質をも
有する。界面動電的可動性の修飾は、１つの鏡像異性体
に荷電スピシーズを選択的に結合させる形になり得る。

またそれは、いくつかの荷電鏡像異性スピシーズの１つ
の電荷音度を、それに帯電していない嵩高い基を選択的
に結合させることによって。

あるいは１鏡像異性体が支持電解質の荷電スピシーズに
結合する能力あるいはそれを引きつげる能力を変えるよ
うな基を選択的に結合させることによって、変える形に
なり得る。キラル支持電解質成分として有用な様々な物
質は９文献中の他のセツティングで記載されている。例
えば、ここで引用文献として採用するＥｎａｎｔｉｏｍ
ｅｒｓ、　Ｒａｃｃｍａｔａｓ。

ａｎｄ　Ｒｅ５ｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｂｙ　Ｊ、　Ｊａｃ
ｑｕｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆
　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９８１を参照−
ヒよ。キラル支持電解質中の含有物に対する適当なキラ
ルスピシーズには２例えば、以下のギラルアニオン。

キラルカチオン、キラル錯体が包含される。このキラル
アニオンには１例えば、（＋）カンファー−１０−スル
ホン酸のアニオン、（＋）ショウノウ酸、（−）ジヘン
ゾイル酒石酸、　（→−）および（−）、ｄ−（２，４
，５，７−チトラニトロフルオレニリデンアミノオキシ
）プロピオン酸（ＴＡｐＡ）、ジアセトンケログロン酸
、（＋）および（−）マンデルａ、　　（−）マレイン
酸、　　（十）ｈよび（−）酒石酸、（＋）および（−
）３−ブロモカムフォア−９−スルホン酸などのアニオ
ンがある。このキラルカチオンには２例えば、ブルシン
。

キニン、ストリキニン、（＋）および（−）エフェドリ
ン、（−）−２−アミノ−１−ブタノール。

（＋）および（−）ｄ−メチルベンジルアミン。

（＋）および（−）エフェドリンなどのカチオンがある
。キラル錯体には１例えば、１−アスパルチル−１−フ
ェニルアラニン　メチルエーテルの泪（ＩＩ）および亜
鉛（ＩＩ）錯体（市販の人工甘味料、アスパルタミン）
；ｌ−プロリン、１−ヒスチジンおよび１−ビベコン酸
の銅（ＩＩＩ）錯体；およびＬ−２−アルキル−４−オ
クチルジエチレントリアミンの亜鉛（Ｉｆ）錯体などが
ある。

キラル支持電解質に包含されるキラルスピシーズの前述
のリストは代表例にすぎない。分析しようとする物質グ
ループの１メンバーと選択的に相互作用することにより
物質グループのメンバーの界面動電的可動性を差動的に
変える。他のどんなキラルスビシーズも同様に使用でき
る。包含されるキラルスピシーズの選１尺にあたっては
２鏡イ象異性混合物の分解能に関する当分野の教示、特
にジアステレオ異性体の形成によるそのような分解能に
関する教示に従うことがしばしば有利となり得る。

本発明は、レーザ励起螢光の検出を用いて、界面動電的
に輸送される標的スピシーズの存在を決定するものであ
る。“螢光性”および“螢光”という用語はここでは、
長命および短命の光ルミ４セントスピシーズを含むよう
に、すなわら“燐光性”あるいは“螢光性゛と考えられ
るかもしれない物質を含むように、また“燐光”あるい
は“螢光”と考えられるかもしれない放射を含むよう乙
こ。

広く用いられる。

検出される放射螢光の変化は、螢光標的スピシーズが検
出領域を横切る場合は螢光の増加であり得る。この変化
は、消滅スピシーズあるいは“透明”スピシーズが螢光
ハックグラウンド存在下で検出領域を横切る場合は、螢
光の：残少であり得ろ（Ｉｌ、　Ｓｍａｌｌ、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　５４バ１９８２
）　。

４６２−４６９．参照）。それはまた、螢光スピシーズ
のスペクトル特性あるいは一時特性の変化でもあり得る
。検出される放射螢光スペクトルの変化は。

特別なアクセプタンス波長帯における螢光強度の変化で
あり得、これは標的スビシーズが検出領域を通過して、
この特別なアクセプタンス波長帯域内へあるいはその帯
域外にシフトされた螢光を有することにより生じる。こ
のような波長のシフトは、標的スピシーズ内での分子内
会合などにより生じ得る。第３図に示されるように、こ
のアクセプタンス帯は、高域カットオフフィルタお−よ
び高速（ハイライトスループットｈｉｇｈ　ｌｉｇｈｔ
　ｔｂｒｏｕｇｈｐｕｔ）モノクロメータ−のような波
長帯域フィルタにより容易に限定し得る。一時特性の変
化は３例えば螢光の寿命の増加或いは減少であり得る。

それはまた、螢光の偏極あるいは角分布の変化でもあり
得、これは分析上重要な結果であることがＭ、　Ｊｏｌ
ｌｅｙ＋Ｊ、　Ａｎａｌ、　Ｔｏｘ、、　５　　（Ｓｅ
ｐｔｌｏｃｔ　１９８１）、　２３６．により示されて
いる。

螢光あるいはその等価物における上述の変化はいずれも
検出事象として使用し得るが、螢光において最も一般的
に研究される変化、従って本発明における好ましい゛変
化は、螢光スピシーズが検出領域を横切る際に生じる螢
光の増加である。測定されている標的スピシーズが木来
螢光性のものであってよい場合もあるが、一般的には標
的スピシーズに螢光標識を共有的に付けるかもしくは池
の方法で結合させる。螢光標識は、試料か界面動電通路
内に置かれた時に、標的スピシーズに付；Ｊたり結合さ
せたりすることができる。あるい１ま、界面動電通路中
をスピシーズが通過する間に、螢光標識と標的スビシー
ズは相互作用し１：Ｉる。この通過中の相互作用には、
標的スピシーズと支持液中あるいは界面動電通路壁内の
物質との反応が含まれ得る。それはまた、標的スピシー
ズを含む電気化学的反応によっても生しる。いずれにし
ても。

標的が検出領域中を界面動電的に移動しそして検出事象
がコヒーレント放射により励起された螢光の変化にある
限り、標的、標識および条件のいかなる組合せを用いる
ことも本発明の範囲内にある。

広範囲の螢光標識が公知である。代表的な通常の螢光標
識には、以下のような主要な官能性物質を含む物質が包
含される。この官能性物質には。

例えば、１−および２−７ミノナフタレン、　ｐ、ｐ“
−ジアミノスチルヘン、ピレン、四級フエナントリジン
塩、９−７ミノアクリジン、アントラセン。

オキサカルボシアニン、メロシアニン、３−アミンエキ
レニン、ペリレン、ビス−ベンゾキサゾール、ビス−ｐ
−オキサヅリルベンゼン、１．２−ヘンゾフエナジン、
レチノール、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレブ
リゲニン、テトラサイクリン、ステロフェノール、ヘン
ズイミダヅリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロ
メン、インドール、キサンチン、７−ヒドロキシクマリ
ン。

フェノキサジン、サリチル酸塩、スト口フアンチジン、
ポルフィリン、トリアリールメタン、希土類金属キレー
ト、およびフラビンがある。

結合に対する官能性物質を有するか、あるいはこのよう
な官能性物質を含むべく調製され得る個々の螢光化合物
には１例えば、以下の化合物が包含される。この化合物
には、ダンジルクロライド。

フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートの
ようなフルオレセイン類、　　３．Ｓ−ジヒドロキシ−
９−フェニルキサントヒトロール、ローダミンイソチオ
シアネート、Ｎ−フェニル−２−アミノ−６−スルホナ
トナフタレン、４−アセトアミド−４−イソチオシアネ
ートスチルヘン−２゜２′−ジスルホン酸、ピレン−３
−スルホン酸。

２−トルイジノナフタレン−６−スルホネート。

Ｎ−フェニル、Ｎ−メチル−２−アミノナフタレン−６
−スルホネート、エチジウムブロマイド。

アテプリン、オーラミン−０，２−（９’　　−アント
ラセン）パルミチン酸塩、ダンシルホスファチジル−エ
タノールアミン、Ｎ、Ｎ’　　−ジオクタデシルオキサ
カルボシアニン、Ｎ、Ｎ’　　−ジヘキシルオキサカル
゛ポジアニン、メロシアニン、４−　（３°−ピレニル
）ブチレート、ｄ−３−アミノデスオキシエキレニン、
１２−　（９’　　−アントロイル）ステアレート、２
−メチルアントラセン、９−ビニルアントラセン、２．
２’　　−（ビニレン−ｐ−フェニレン）−ビス−ベン
ゾキサゾール、ｐ−ビスＣ２−＜４−メチル−ｔ−フェ
ニルオキサシリル）〕ベンゼン１６−シメチルアミノー
１．２−ヘンゾフェナジン、レチノール、ビス（３’　
　−アミノピリジニウム）−１，１０−デカンジルジョ
ーダイト、ヘレブリゲニンのスルファナフテイルヒドラ
ヅン、クロロテトラサイクリン、Ｎ−（７−シメチルア
ミノー４−メチル−２−オキソ−３＝クロメニル）マレ
イミド、　　Ｎ　　ｆ　−（２−ヘンズイミダゾリル）
−フェニルコマレイミド、Ｎ−（４−フルオラニチル）
マレイミド１　ビス（ホモバニリン酸）、リザザリン、
４−クロロ−７−ニトロ−２，ｉ　　３−ヘンゾオキサ
ジアゾール、メロシアニン５４０．レヅルフィン、ロー
ズヘンガル。

ユウロピウムおよびテルビ、ウムのポリアミン−ポリ酸
錯体、および２，４−ジフェニル−３（２）１）−フラ
ノンがある。

螢光スビシーズは、約２００ｎｍを越える光を吸収すべ
きことが望ましく、好ましくは約３００ｎｍを上まわる
。１．ｒに好ましくは約４００ｎｍを上まわる光を吸収
すべきであり１通常、吸収されるコヒーレント光の波長
より高い１０ｎｍを上まわる波長で放射する。フルオロ
フォア（目ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ　）は標的に共有的ある
いは非共有的に、また直接あるいは間接的に結合され得
る。共有結合される場合は、その特別な結合基は結合さ
れる２部分の性質およびそれら個々の機能に依るであろ
う。多（の結合基および結合法が文献中に教示されてい
る。

結合はまたレセプターを用いても達成され得る。

例えば、抗原のフルオロフォアは、抗原に対するレセプ
ター、例えば抗体の仲介により標的に結合されよう。レ
セプターは次々に共存的あるいは非共有的に２例えば吸
着により結合されよう。

本発明を用いて分離され測定される標的分子は。

螢光標識できてしかも支持液中に懸濁あるいは溶解させ
得る物質から、実質的には制限なく１選択され得る。最
も一般的には、標的スビシーズは生物学的に、生態学的
にあるいは化学的に興味深い物質であろう。

標的分子は、ポリアミノ酸、すなわちポリベプヂドや蛋
白；多糖類；ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＤＮＡ断片のような
核酸やオリゴヌクレオチド；およびそれらを組み合わせ
たような巨大分子であり得る。このような組合わせの集
団には、細菌、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンド
リア、核、細胞膜などがある。

広範な蛋白およびポリペプチドは、構造上の類似した特
徴、特別な生物学的機能を有する蛋白。

特定の微生物、特に病因となる微生物に関連する蛋白５
　などにより分類される。

以下に構造上関連のある蛋白のクラスを示す：プロクミ
ン。ヒストン、アルブミン、グロブリン。

硬蛋白、リン蛋白、ムコ蛋白１色素蛋白、リポ蛋白、核
蛋白、Ｉ唐蛋白、プロテオグリカン、分類されない蛋白
１例えばソマトトロピン、プロラクチン、インシュリン
およびペプシン。

ヒト血漿中には多くの可能な標的蛋白が存在することは
言うまでもなく、これらは臨床的に重要で以下のものが
含まれる：プレアルブミン、アルブミン、α１−リポ蛋
白、チロキシン結合グロブリン、Ｇｃ　−グロブリン（
ＧｃＩＬＧｃ２−１．Ｇｃ２−２　）　、　コリンエス
テラーゼ、ミオグロビン、トランスフェリン、フィブリ
ノーゲン、イムノグロブリンＧ　（ＩｇＧ）　、　　イ
ムノグロブリンＡ　（ＩｇＡ）　。

イムノグロブリンＭ　（ＩｇＭ）、　、　　イムノグロ
ブリンＥ　（ＩｇＥ）あるいはγＥ−グロブリン（ＴＥ
）。

補足因子、血液凝固因子１例えば副甲状腺ホルモン（バ
ラトルモン）、インシュリン、グルカゴン。

ソマトトロピン（成長ホルモン）、卵胞刺激ホルモン、
黄体形成ホルモン（間細胞刺激ホルモン）。

ゴナドトロピン、セクレチンおよびガストリンを含む゛
ペプチドホルモンや蛋白ホルモン。

他の興味深い巨大分子標的物質は、腸内細菌。

サルモネラ、シガエラ（赤痢菌）、プロテウス種。

バストゥーレラ、プルセラ、好気性の胞子形成バチルス
、Ｍｆ、気−性の胞子形成バチルス、ミコバクテリア、
放線菌類（菌類様細菌）、スビロヘーク。

マイコプラズマなどのような微生物に由来あるいは存在
するムコ多Ｉｌｌや多！Ｊ！　＋Ｎである。

他の標的スピシーズには次のものが含まれ得る二リケッ
チア（細菌様寄生動物）、タラミゾイア。

菌類およびウィルス（アデノウィルス、ポックスウィル
ス、ミクソウィルス、レオウィルスタイプ１−３．肝炎
ウィルスおよび癌ウィルスを含む）。

単量体のあるいはより小さい標的物の分子量は。

通常約７５から２０，０００．より一般には１００から
３．０００であろう。興味深い標的物としては、薬剤１
代謝物、殺虫剤、汚染物質などがある。モルフインアル
カロイド（モルヒネ、コディン、ベロイン。コカイン、
ヘンゾイルエクゴニン等）、ニルゴツトアルカロイド、
ステロイドアルカロイドなどのようなアルカロイドもこ
れらに含まれる。

他の興味深い薬剤には以下の物がある：エストロゲンお
よびアンドロゲンを含むステロイド；副腎皮質ステロイ
ド；胆汁酸；強心配糖体；ジゴキシンおよびジゴキシゲ
ニンを含むアグリコン；バルビッル酸塩１例えばフェノ
バルビクールおよびセコバルビタール；アンフヱタミン
を含むアミノアルキルベンゼン；カンナビノールおよび
テトラヒドロカンナビノール、ビタミン、プロスタグラ
ンディン、抗生物質、ヌクレオシドおよびヌクレオチド
。

他のグループの標的化合物はアミノ酸および小ペプチド
であり、これにはポリョードチロニン。

例えばチロキシン、およびトリョードチロニン。

オキシトシン、ＡＣＴＨ，アンジオテンシン、　ｍｅｔ
−および１ｅｕ−エンケファリン、それらの代謝物およ
び誘導体が含まれる。

フルオロフォアは、標的物上の水素あるいは他の置換可
能な官能性物質を結合手あるし・は結合基で置き換える
ことにより、標的スピシーズに付けられ得る。標的物上
の基としては、水酸基、アミノ基、アリール基、チオ基
、オレフィン基などがあり得る。結合基は通常は水素以
外に１から２０原子を有するであろう。これら原子は一
般には、炭素、酸素、硫黄、窒素および原子番号１７か
ら３５のハロゲンである。結合基に存在する結合官能性
物質としては、カルボニル（オキソ型および非オキソ型
の両方）、活性ハロゲン、ジアゾ、メルカプトエチレン
特に活性化エチレン、アミンなどが含まれる。ヘテロ原
子（すなわち水素原子や炭素原子でない）の数は通常約
０〜６の範囲、より一般には約１〜６．好ましくは約１
〜４の範囲であろう。

たいていの場合、結合基は脂肪族であろうが。

ジアゾ基とともに、芳香族基も含まれる。一般に。

結合基は、その鎖中に約１〜１０原子、より一般には約
１〜６原子を有する二価の鎖である。酸素は通常、炭素
や水素に結合して、好ましくは炭素のめに結合して、オ
キソまたはオキシとして存在するであろう。これに対し
窒素は通常、炭素のみに結合してアミノとして、あるい
はアミドとして存在するであろう。また硫黄は酸素に類
似するであろう。

結合基および結合される分子間の共有結合形成における
一喰的な官能性物質はアルキルアミン。

アミド、アミジン、チオアミド、ウレア、チオウレア、
グアニジンおよびジアゾである。

ポリペプチドとの結合に特に適用される結合基には、カ
ルボン酸を含む結合基がある。このカルボン酸は、ジイ
ミドと結合して、または炭酸モノエステルと混合した無
水物として、または活性カルボン酸エステル（例えば、
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはｐ−ニトロフェニ
ル）として用いられる得る。イミドエステルとしては窒
素類似物が使用され得る。還元的なアミノ化条件下（例
えば、水素化ホウ素の存在下）では、アルデヒドは、イ
ミンを形成してアルキルアミンを生成するべく用いられ
得る。使用可能な他のオキソ型でないカルボニル基には
、イソシアネートやイソチオシアネートが含まれる。さ
らに活性アシル基、特にブロモアセチル基も使用され得
る。

たいていの場合には、標的には１つまたはそれ以上の官
能基を有する。この官能基は結合基と結合するための部
位として作用し得る。特に、ヒドロキシル基、ラミノ基
およびアリール基（とりわけ活性子り−ル基）が使用に
供される。また、オキソ官能性物質とヒドロキシル基（
これは、カルボキシメチル基のような結合基と結合する
ための部位として用いられる）とから、オキシムが調製
され得る。

結合基の選択は広範囲にわたって変えられ、これは、フ
ルオロフォア中やこのフルオロフォアが結合し得る化合
物中に存在する官能性物質、所望の結合基の性質や長さ
などに依存している。

本発明は、界面動電釣場におけるスピシーズの相対的移
動に基づいて、スピシーズの分離を成すものである。支
持電解質（発明の背景を参照のこと）の正味過剰な電荷
と同じ′電荷を有するスピシーズは、支持電解質より速
く移動する傾向にあるだろう。帯電していないスピシー
ズは支持電解質の速度で移動するであろうし、また反対
の電荷を有する物質は支持電解質より遅く移動するであ
ろう。

分離の条件は非常に非回避的である。これにより、スピ
シーズの他の性質を使って分離を行うことが可能となる
。例えば、あるスピシーズを他の荷電スピシーズに選択
的に結合して、この最初のスピシーズに電荷を付与する
ことができる。

これは、この２つのスピシーズの疎水性を釣り合わせる
ことによって１例えば第１の荷電物質のミセル状分散を
作り次いで第２の帯電していない物質をこのミセルに選
択的に結合させることによって１行うことができる。こ
れにより事実上第２の物質に電荷が付与されるであろう
。他の技術としては、混合液のｐＨを変えて、混合液中
のあるスビシーズを選択的にプロトン化あるいは脱プロ
トン化することによりその界面動電的可動性を変えるこ
とが可能である。

本発明では、オンカラムに供給されたコヒーレント放射
源、すなわちレーザを使って螢光性スピシーズを励起し
ている。連続レーザあるいはパルスされたレーザが使用
できる。約２０Ｗまでのような低パワーから中パワーの
レーザで良好な結果が得られる。必要に応じてより高パ
ワーのレーザも使用できるが、利益をもたらすことは見
出されておらず、しかも試料を不必要に加熱するという
欠点を有する可能性がある。コヒーレント光源の波長は
、測定されている螢光スピシーズの励起波長とマツチさ
せる必要がある。すなわち、それは螢光を励起するのに
有効な波長であるべきである。

コヒーレント光を使うことは、それがレンズやミラーに
よって、より重要なことには、ファイバ光学部品によっ
ても同様に、直接試料通路に効率良く便利に与えられる
という重要な利点をもたらす。

コヒーレント励起エネルギーのビームは、試料の流れを
横切るように試料に加えることができ。

あるいは必要に応じて、液体の流れの方向と同軸に、あ
るいは流れ方向に逆らって加えることもできる。螢光の
測定は従来の測定法を用いて行われる。これらは連続測
定、もしくは間欠測定すなわち時間ゲート測定であり得
る。これらの測定は螢光放射のある選択された波長で行
われる。測定は。

試料通路上の励起が生じるのと同じ地点で、あるいは励
起地点より下流で１行なってよい。長寿命のフルオロフ
ォア（例えば、螢光性物質）の場合には、あるいは励起
が流れとともに伝達されであるいは流れと逆に伝達され
て供される場合は、下流で測定するのが有利である。励
起や検出のための角度は同平面でよく、あるいは必要に
応して変えるごとにより干渉１反射などを除いてもよい
。

螢光検出器で生した信号は記録され、また／あるいはそ
れは制御信号として使用される。記録は標準チャート式
記録計などにより行い得る。制？ＴＩ＋信号は１例えば
予備環境中の螢光性スビシーズを捕らえるあるいは集め
るようにバルブを開閉するために利用できる。

（以下余白） Ｊ−一図Ｊ征９１旧良ぺ説−所 第１図は電気浸透ポンピングのプロセスを説明するため
の液で充たされた管の断面図、第２図は界面動電分離の
プロセスを説明するだめの液で充たされた管の断面図、
第３図は本発明を実施するだめの装置の一例の一部をブ
ロックで示す説明図。

第４図は本発明で用いられるオンカラム光学螢光測定セ
ルの一例の断面図、第５図は本発明を用いてｉ′↑ろれ
、検出された分、補を示す代表的な２例の１ｍ電クロマ
トグラフィ　（エレクト［２）よりグラム）を示す図で
ある。

Ｖソ　　−ト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気浸透的にポンプ可能であり螢光可能である液体
   試料中の標的スピシーズの存在を検出するための螢光ア
   ッセイ法であって、 （ａ）電気浸透的にポンプ可能な液で充たされた、小径
   の、両端開口の、壁を有し、少なくとも一部が半透明で
   ある、通路内に、該試料を配すること、（ｂ）該ポンプ
   可能な試料及びポンプ可能な液に対して有効電気浸透ポ
   ンピング電位を印加して、該試料が該通路内を移動する
   ようにさせること、（ｃ）該試料内に螢光を励起するの
   に有効な波長のコヒーレント放射を該試料に放射するこ
   と、及び（ｄ）該標的スピシーズが該半透明部を通過す
   る際の該通路の該半透明部を介して出される螢光中の変
   化を検出すること を包含する電気浸透的にポンプ可能であり螢光可能であ
   る液体試料中の標的スピシーズの存在を検出するための
   螢光アッセイ法。 ２、前記照射が、前記通路の該半透明部を介して行われ
   る特許請求の範囲第１項に記載の螢光アッセイ法。 ３、前記コヒーレント放射が、ファイバ光装置によって
   ビームとして前記試料に加えられる特許請求の範囲第１
   項に記載の螢光アッセイ法。 ４、前記電気浸透的にポンプ可能な液が、水性の液であ
   る特許請求の範囲第１項に記載の螢光アッセイ法。 ５、前記壁を有する通路が管状である特許請求の範囲第
   １項に記載の螢光アッセイ法。 ６、前記標的スピシーズが螢光性であり、前記検出され
   る変化が出された螢光の増加である特許請求の範囲第１
   項に記載の螢光アッセイ法。 ７、電気浸透的にポンプ可能であり螢光可能である液体
   試料中の、複数の螢光変化誘導標的スピシーズの存在を
   検出するための方法であって、（ａ）電気浸透的にポン
   プ可能な液で充たされた。 小径の、両端開口の、壁を有し、該複数のスピシーズの
   互いの界面動電分離がなされるのに充分な長さと、該長
   さ以降の少なくとも一部に半透明部とを有する、通路内
   に、該試料を配すること、（ｂ）該ポンプ可能な試料及
   びポンプ可能な液に対して有効電気浸透ポンピング及び
   電気泳動分離電位を印加して、該試料が該通路内を移動
   するようにさせ、該複数の標的スピシーズを互いに界面
   動電的に分離すること、 （ｃ）該標的スピシーズが該半透明部を通過する際に、
   該試料内に螢光を励起するのに有効な波長のコヒーレン
   ト放射を該試料に照射すること、及び（ｄ）該個々の分
   離された標的スピシーズが該半透明部を通過する際の該
   通路の該半透明部を介して出される螢光中の変化を検出
   すること を包含する電気浸透的にポンプ可能であり螢光可能であ
   る液体試料中の、複数の螢光変化誘導標的スピシーズの
   存在を検出するための方法。 ８、前記照射が、前記通路の前記半透明部を介して行わ
   れる特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ９、前記コヒーレント放射が、ファイバ光装置によって
   ビームとして前記試料に加えられる特許請求の範囲第７
   項に記載の方法。 １０、前記電気浸透的にポンプ可能な液が、水性の液で
   ある特許請求の範囲第７項に記載の方法。 １１、前記壁を有する通路が管状である特許請求の範囲
   第７項に記載の方法。 １２、前記標的スピシーズが螢光性であり、前記検出さ
   れる変化が出された螢光の増加である特許請求の範囲第
   ７項に記載の方法。 １３、キラル化合物を分離する方法であって、（ａ）界
   面動電領域内の、電気浸透的にポンプ可能なキラル支持
   電解質内に該化合物を配すること、及び （ｂ）該キラル化合物を分離するのに有効な期間、該領
   域内の該支持電解質に有効界面動電電位を印加すること
   、 を包含するキラル化合物を分離する方法。 １４、前記キラル支持電解質が、分離されている該キラ
   ル化合物と差動的に反応して、分離されている該化合物
   に対して異なった界面動電易動度を与えるキラルスピシ
   ーズを含んでいる特許請求の範囲第１３項に記載の方法
   。 １５、前記界面動電領域が、電気浸透的にポンプ可能な
   液で充たされた、小径の、両端開口の、壁を有する通路
   である特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６、液体試料中の螢光スピシーズの存在を示すための
   検出器であって、 （ａ）小径の、両端開口の、壁を有する、少なくとも一
   部が半透明である、該試料を収容するための通路、 （ｂ）該螢光スピシーズ内に螢光を励起するのに有効な
   波長のコヒーレント放射を該試料に照射するための手段
   、及び （ｃ）該螢光スピシーズによって出される螢光を該半透
   明部を介して集めるための手段 を備えた液体試料中の螢光スピシーズの存在を示すため
   の検出器。 １７、前記通路が界面動電領域を形成している特許請求
   の範囲第１６項に記載の検出器。 １８、前記通路が、管状の、壁を有する通路である特許
   請求の範囲第１７項に記載の検出器。 １９、前記照射するための手段が、前記半透明部を介し
   てコヒーレント放射のビームを発するための手段を備え
   ている特許請求の範囲第１７項に記載の検出器。 ２０、電気浸透的にポンプ可能な液を含む試料中の、複
   数の螢光変化誘導標的スピシーズを分離し、検出するた
   めのシステムであって、 （ａ）電気浸透的にポンプ可能な液を収容するための、
   小径の、両端開口の、壁を有し、半透明検出部に接続さ
   れ且つ連通されている通路、 （ｂ）該試料を該通路内に供給するための手段、（ｃ）
   該試料が供給される前後に於いて該通路に浸透的にポン
   プ可能な液を供給するための手段、（ｄ）該通路に沿っ
   て且つ該検出領域を介して、有効界面動電電位を加える
   ための手段、 （ｅ）該試料が該検出部を通過する際に、該試料内に螢
   光を励起するのに有効な波長のコヒーレント放射を該試
   料に与えるための手段、及び （ｆ）該螢光変化誘導スピシーズが該検出部を通過する
   際に、出された螢光中の変化を該半透明部を介して検出
   するための手段 を備えた電気浸透的にポンプ可能な液を含む試料中の、
   複数の螢光変化誘導標的スピシーズを分離し、検出する
   ためのシステム。