CN112513618B - 生物聚合物分析方法及生物聚合物分析装置 - Google Patents

Abstract

在毛细管电泳时，有时会发生由杂质等产生尖峰状的噪声、或者检测到光谱不同于标识荧光体的波长光谱的噪声峰的现象。因此，本公开提供一种确定标识荧光体自身的强度而不受杂质所产生的噪声荧光峰影响的技术。本公开中，设定噪声峰共有的荧光强度特性(噪声的荧光谱线)，将噪声峰作为不同于标识荧光体的荧光体对待，利用标识荧光体+噪声荧光体来进行色彩变换，从而将荧光体与噪声进行分离(参照图5)。

Description

生物聚合物分析方法及生物聚合物分析装置

技术领域

本公开关于生物聚合物分析方法和生物聚合物分析装置。

背景技术

作为以荧光体为标识来决定DNA的碱基序列的方法，例如有公知的桑格尔双脱氧法。在该双脱氧法中，首先，将要解析的DNA导入载体并放大，使其变性而生成单链模板DNA。然后，使该模板DNA与引物DNA耦合，以引物DNA为起点进行互补链合成。此时，除了4种单脱氧核苷酸之外，还添加特定的1种双脱氧核苷酸作为终止子。在添入了该双脱氧核苷酸时，互补链合成将停止，因此可以得到终止于特定碱基的各种长度的DNA片段。使用针对腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)这4种碱基的双脱氧核苷酸即ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP,分别进行上述互补链合成反应，得到终端碱基分别为A、C、G、T的各种长度的DNA片段，并对这些DNA片段进行分子量分离，按照分子量依次读取碱基类型，从而能够解析碱基序列。

分子量分离通过使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳来进行。近年来，在毛细管内填充凝胶或者分子量可分离的高聚物来进行电泳的方式成为主流。使用该毛细管电泳法的DNA碱基序列决定装置(DNA测序仪)能够应对连续自动分析，能够高速地对多个试样并行地进行分析处理，是目前普及最广泛的DNA测序仪。

对检测出的片段的碱基类型的判定原理是预先用终端碱基类型互不相同的4种荧光体对上述片段进行标识，在特定的检测位置照射激励光，根据所产生的荧光光谱的差异来判别碱基类型。基于上述原理的装置除了作为DNA测序仪的用途以外，还被广泛应用于荧光标识的生物相关物质的分析。

被用作为标识的荧光体的组合有多种，在选定蓝色系、绿色系、黄色系、红色系等不同特性的荧光体例如4种荧光体的情况下，荧光的极大波长分别为528nm、549nm、575nm、602nm这样互不相同的波长，根据该荧光极大波长的差异或荧光光谱的差异，能够识别荧光体类型或识别荧光体类型的混合状态，从而能够判定终端碱基类型。根据检测出的荧光光谱来确定荧光体类型的方法使用的是例如专利文献1记载的公知方法。

用作为标识的荧光体类型在决定碱基序列时通常为4种，但有时也使用5种以上的荧光体类型用于测定，且对每一个片段类型使用不同的荧光体进行标识，由此来测量DNA的分子量分离模式。在5种以上的情况下，也能够根据来自检测出的荧光体的荧光光谱等识别出荧光体类型，并判别片段类型及其长度。

测定装置至少具有测定荧光体类型数量以上的不同波段的荧光强度的功能。荧光体的荧光光谱互不相同，且每一种荧光体类型的基于光谱特性在多个波段中的荧光强度比率也不同。因此，根据检测出的多个波段的荧光强度和每一种荧光体类型的荧光强度比率，通过矩阵计算对每一种荧光体类型的强度(量)进行变换。由于荧光体类型的量就是碱基类型的量，因此，能够确定每一种碱基的量，并能得到每一种碱基随着泳动而发生的时间变化。

例如在专利文献2中记载了上述毛细管电泳装置。通常，在毛细管电泳装置中，将包含作为测定对象的DNA的试样注入到石英毛细管中的聚丙烯酰胺等分离介质中，并在毛细管的两端部施加电压。试样中含有DNA的试样在毛细管内移动，并根据分子量的大小等进行分离，从而在毛细管内产生DNA带。各DNA带包含有上述的荧光色素，因此在被激光、LED光等照射时会发出荧光。若利用荧光测量单元对上述发出的荧光进行读取，则能够决定DNA的序列。蛋白质的分离和分析也同样地进行，从而能够分析蛋白质的结构。毛细管电泳装置中向样本照射光的光照射方式如下所示。即，对排列在平面基板上的多个毛细管所形成的毛细管阵列的其中一侧或者两侧的端部毛细管照射激光，激光在相邻的毛细管中依次传播，造成横切毛细管阵列，从而对所有毛细管中泳动的试样进行照射。荧光检测方式如下所示。即，将毛细管阵列上的激光照射部的像通过集光透镜、透射型衍射光栅、成像透镜而成像在二维CCD上。从而，在多个波段中(例如将500nm～700nm的波长范围以10nm的间隔分割成20份)检测出多个荧光体发出的荧光的强度。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2011－30502号公报

专利文献2：日本专利特开2004－144479号公报

发明内容

发明所要解决的技术问题

如专利文献1所公开的，作为检测对象的荧光体是用于进行标识的荧光体(标识荧光体)。即，上述通过矩阵计算进行的变换是为了决定检测出的荧光强度来自于哪一种荧光体类型(碱基类型)、以及荧光体类型(碱基类型)相互混合的比率是多少。

然而，在电泳时，目标(检测对象)以外的成分有时也会泳动而被检测出。例如，泳动样品中包含的杂质、垃圾等有时也会泳动并通过毛细管的检测区域。该杂质所产生的噪声荧光峰会与原本的标识荧光体的峰值信号重叠，或者被单独地检测出。在这种情况下，噪声荧光峰有可能被误判为是标识荧光体中的某一个或者是多个标识荧光体的组合等，从而影响向荧光体类型的变换、碱基类型的判定。

该噪声荧光信号不同于作为对象的标识荧光体的荧光光谱，因此通常将荧光光谱强度变换为荧光体类型强度的矩阵变换并不是正确的变换。

而且，还存在噪声荧光信号叠加在荧光体类型强度上并计算成不正确的强度，从而影响片段类型或碱基类型的判定的问题。

本公开是鉴于上述情况而完成的，提供一种确定标识荧光体自身的强度而不受杂质所产生的噪声荧光峰影响的技术。

解决技术问题所采用的技术方案

发明人对用作为标识的荧光体以外的泳动峰进行了解析，结果发现有不同于被用作标识的荧光体的荧光光谱的光谱，而且多个杂质荧光峰的光谱之间存在共性。

因此，发明人基于上述发现，在本公开中，将噪声荧光作为参与泳动的荧光体对待，并且与其他标识荧光体相同地决定噪声荧光在多个波段的每一个波段中的荧光强度比率。此外，在用于将荧光光谱强度变换为荧光体类型强度的矩阵变换中，以标识荧光体(Q类型)和噪声荧光体(R类型)的矩阵的形式进行计算，由此来确定标识荧光体的浓度。从而，能够将噪声荧光峰识别为噪声，并能将其从标识荧光体的谱峰去除。

本公开相关的进一步特征可从本说明书的记载、附图中明确。另外，本公开的方式通过要素、多种要素的组合、后文的详细记载和添附的权利要求书的内容来达到和实现。

本说明书的记载仅仅是典型的示例，必须理解权利要求书或应用示例在任何意义下都不构成限定。

发明效果

根据本公开，在电泳数据(电泳图)中检测出杂质产生的噪声荧光峰的情况下，也能够不受其影响地确定标识荧光体自身的强度，并准确地识别和检测碱基类型等生物相关成分。

附图说明

图1是表示本实施方式的毛细管电泳装置100的简要结构例的图。

图2是表示本实施方式的毛细管电泳装置100的构成要素即检测机构部37的简要内部结构(光检测系统)例的图。

图3是用于说明数据处理部101基于解析方法1执行的电泳数据解析处理的流程图。

图4是用于说明数据处理部101基于解析方法2执行的电泳数据解析处理的流程图。

图5是表示实施例1的噪声荧光去除效果的图。

图6是表示实施例2的噪声荧光去除效果的图。

图7是表示实施例3中使用的标识荧光体的荧光分光谱线：x(q,p)和噪声荧光谱线：y(r,p)(q＝0,1,2,3，r＝0，p＝0,1,2，……，19)的图。

图8是表示所测定的电泳时的电泳图s(p,t)的一例的图。

图9是表示利用最小二乘法解析得到的噪声荧光体的强度波形：n(r,t)的一部分(噪声荧光1的信号强度901)的图。

图10是表示通过运算去除噪声峰后的结果(来自各标识荧光体的荧光强度波形f(q,t):荧光体1～4的强度波形1001～1004)的图。

图11是表示作为比较例不设定噪声荧光体而计算出的来自标识荧光体的荧光强度波形(荧光体1～4的强度波形1101～1104)的图。

图12是表示4种标识荧光体的谱线(荧光体1～4的谱线1201～1204)和2种噪声荧光体的谱线(噪声荧光1和2的谱线1205、1206)的图。

图13是表示实施例4中使用的标识荧光体的荧光分光谱线：x(q,p)(q＝0,1,2,3，p＝0,1,2，……，19)的图。

图14是表示实施例4中使用的噪声荧光谱线：y(r,p)(r＝0，p＝0,1,2，……，19)的图。

图15是表示所测定的电泳时的电泳图s(p,t)的一例的图。

图16是表示根据解析方法1计算出的噪声荧光体的强度波形：n(r,t)的一部分的图。

图17是表示通过解析方法1的运算而得到的结果(来自泳动时的标识荧光体的荧光强度波形：f(q,t))的图。

图18是作为比较例没有设定噪声荧光体的荧光谱线y(r,p)而计算出的来自标识荧光体的荧光强度波形的图。

具体实施方式

以下，参照附图对本实施方式及实施例进行说明。附图中，功能上相同的要素有时用相同的编号来表示。另外，附图示出了遵循本公开原理的具体的实施方式和实施例，但这些都是用于理解本公开的，并不能用来对本公开进行限定性解释。

另外，本实施方式中，为了本领域技术人员实施本公开而进行了充分详细的说明，但必须理解其他的安装、方式也是可行的，在不脱离本公开的技术构思的范围和宗旨的情况下，可以对结构、构造进行变更或对多种要素进行替换。因此，下文的记载并不限定于此来进行解释。

而且，本实施方式中，后述的数据处理部的功能可以通过在通用的计算机上运行的软件进行安装，也可以通过专用的硬件或软件和硬件的组合来进行安装。

本实施方式涉及以荧光体为标识的DNA、蛋白质等生物相关成分(生物高聚物)的解析技术，涉及例如决定DNA碱基序列的方法及其装置、以及测量DNA分子量分离模式的方法及其装置。

本实施方式的特征在于，除了标识荧光体的谱线之外，还预先设定标识荧光体以外的荧光体(非标识荧光体)的谱线(例如噪声谱线)，并利用该谱线，通过运算(参照后述的式(1)等)来求出非标识荧光体的荧光强度的时间变化(波形)，并从检测出的电泳图信号去除噪声。本实施方式的特征还在于通过运算从后述的式(1)直接求出来自泳动时的标识荧光体的荧光强度。

<毛细管电泳装置的结构例>

图1是表示本实施方式的毛细管电泳装置100的简要结构例的图。毛细管电泳装置100是生物高聚物分析装置，例如包括：包含用于将试样分离的分离介质的由毛细管形成的多毛细管阵列1；保持有缓冲液3以将多毛细管阵列的负电极2和试样导入部22浸在其中的第1缓冲容器23；具有阀门6的凝胶块4；保持有缓冲液12以将凝胶块4和接地电极7浸在其中的第2缓冲容器25；用于向毛细管阵列内注入作为泳动介质的凝胶的注射筒10；用于获取依赖于试样的信息的检测部26；向光照射部位8照射激光9以使泳动的试样内的荧光体被激发的光源20；获取试样所产生的荧光的检测机构部37；调节毛细管阵列1的温度的恒温槽11；对分离介质施加电压的高压电源21；执行各种处理的数据处理部(处理器)101；存储后述的各标识荧光体的谱线(与荧光分光谱线同义)和各噪声荧光谱线的存储器102；存储过去的检测数据和运算结果等的存储设备103；供操作人员输入指示和各种数据等的输入设备(鼠标、键盘、各种开关、触摸屏等)104；以及输出检测(测定)结果、运算结果和判定结果等的输出设备(显示设备、发出警告音等的扬声器等)105。

多毛细管阵列1由多根(例如96根、24根、16根、12根、8根等)管状构件即石英制的毛细管16构成，并由包含光照射部位(照射激光9的位置)8的检测部26将多毛细管阵列1排列在平面上后使用。各毛细管16被聚酰亚胺等覆盖，但在光照射部位8覆盖被去除，从而能够进行光照射。另外，多毛细管阵列1中填充了含有DNA分子等样品的检查试样和用于分离检查试样中的DNA分子的分离介质即高聚物水溶液。多毛细管阵列1的一端形成有能够向毛细管16内导入试样的试样导入部22，并配置有能够施加负电压的负电极2。另一端具有与凝胶块4相连结的凝胶块连接部5，从凝胶块4向毛细管阵列1注入分离介质(例如具有分子筛效应的高聚物水溶液)。检测部26设置在试样导入部22与凝胶块连接部5之间。

将作为泳动分离介质的高聚物水溶液注入到毛细管16内的流动介质注入机构24具有凝胶块4、注射筒10和阀门6。在向各毛细管16内填充作为泳动介质的高聚物水溶液时，例如通过未图示的控制部关闭阀门6并将注射筒10压入，从而将注射筒10内的高聚物水溶液注入到毛细管内。

毛细管阵列1、凝胶块4、缓冲液3、负电极2、接地电极侧的缓冲液12、接地电极7、高压电源21构成用于使检查试样在分离介质(高聚物水溶液)中进行电泳的电压施加机构。在要使其进行电泳时，负电极2浸在缓冲液3中，未图示的控制部打开阀门6。从而，负电极2、缓冲液3、毛细管阵列(更准确地说是各毛细管16内的高聚物水溶液)1、凝胶块(更准确地说是凝胶块4内的高聚物水溶液)4、接地电极侧的缓冲液12和接地电极7形成通电回路。该通电回路被高压电源21施加电压。在通电回路上施加电压时，检查试样在分离介质(高聚物水溶液)中进行电泳，从而根据其分子量等性质而发生分离。

电泳装置100的光学系统由电源20、包含光照射部位8的检测部26和用于检测检测部26所产生的荧光35的检测机构部37构成。光源20使激光9(488.0nm和514.5nm的光)振荡。也可以使用通过带通滤波器等实现单色的LED光或从其它可激发荧光的光源射出的光来代替激光9。检测部26中并排配置有激光9会透过毛细管阵列1的部位即光照射部位8。而且，从毛细管16排列的两个方向(图1中的上下方向)向检测部26照射激光9，以使多根毛细管的光照射部位8同时被穿透。该激光9激发检查试样，从而从检查试样发出荧光。包含二维检测器34的检测机构部37检测该荧光，从而能够获取DNA分子序列等依赖于检查试样的信息。

<检测机构部37的内部结构例>

图2是表示本实施方式的毛细管电泳装置100的构成要素即检测机构部37的简要内部结构(光检测系统)例的图。图2中示出了检测机构部37和光照射部位8。

检测机构部37具备荧光集光透镜31、光栅32、聚焦透镜33、CCD相机或CMOS相机等二维检测器34。虽未图示，但光路的中途也可以适当地插入用于去除激励光的滤光器。向光照射部位8照射激光9而产生的来自于载放在阵列台15上的毛细管16中的检查试样的荧光35通过荧光集光透镜31而变成平行光36，然后被光栅32分光，通过聚焦透镜33成像在二维检测器34上。图2的右侧示出了与上述成像相关的要素(毛细管阵列1、光照射部位8、光栅32、二维检测器34)的结构例。毛细管阵列1的阵列像(图中为16道)沿Y轴方向排列，来自各毛细管16的分光被沿着X轴方向分光而成像，并被二维检测器的X方向的每一个像素检测出不同波长下的荧光强度。数据处理部101例如响应于操作人员从输入设备104输入的指示，对检测出的荧光强度的信号进行解析，来决定碱基序列等。数据处理部101例如还响应于操作人员输入的指示，将荧光强度的信号或作为解析结果的碱基序列等输出到(显示在)输出设备105上。

<电泳数据解析的概况>

接下来，对于本实施方式中的电泳数据(电泳图)解析的概况进行说明。

电泳装置100在指定的时间重复检测泳动过程中的信号(可以是连续照射激光9并周期性地或者每隔规定期间地进行检测，也可以使激光9的照射定时与信号检测定时同步)。重复次数设为t(一秒测定一次的情况下，次数＝时间(秒))。

另外，各标识荧光体发出的荧光按照各荧光光谱，在每一个分光波长下以特定的强度比率进行发光。上述荧光通过光栅、棱镜等进行分光，并由检测器进行检测。基于标识荧光体的组合，设定从波长W1到波长W2的检测波长范围，并且将该范围的荧光分成多个波段来进行检测。例如，在二维检测器34的感测面上将520nm～700nm的波长范围分割为连续的20个波段来进行检测。由此，将分割波段编号记为p(＝0，1,2，……，P-1；P＝分割数量)，将标识荧光体类型的编号记为q(＝0,1,2，……，Q-1；Q＝荧光体类型数量)，将噪声荧光的编号记为r(＝0，……，R-1；R＝设定的噪声荧光体类型数量)，在时间t内的各信号成分如下所示。

检测出的每一个分割波段的电泳图信号：s(p,t)

来自泳动时的标识荧光体的荧光强度：f(q,t)

正在泳动的荧光性噪声的强度：n(r,t)

每一个分割波段的背景强度：b(p,t)

标识荧光体的荧光谱线：x(q,p)

所设定的噪声的荧光谱线：y(r,p)

s(p,t)是分成多个波段检测出的强度(所测定的信号)。f(q,t)是泳动谱带等发出的各荧光体的荧光强度。n(r,t)是被认为包含在泳动谱带中的噪声的强度。b(p,t)是各检测波段的背景强度。背景强度是成为基线信号的强度，通过在实际检测出的s(p,t)中提取出发生非脉冲式变动的信号而得到。x(q,p)是各标识荧光体的荧光谱线，是各标识荧光体(标识荧光体类型(q))自身发光时在每一个检测波段(p)检测到的强度对每一种荧光体类型进行了归一化后的谱线。一旦决定了标识荧光体，其荧光谱线就唯一地确定，相当于荧光光谱。y(r,p)是针对被视作为噪声的荧光与x(q,p)同样地进行确定的谱线，设定为相当于噪声的荧光光谱。例如，基于累积的检测数据对噪声进行解析(或假定噪声具有何种特性)而提取出的谱线。这里，呈现为“噪声的谱线”，但也可以呈现为不同于标识荧光体的其它荧光体的谱线。

上述中，将s(0,t)、……s(P-1,t)以P行1列来表示的矩阵设为S，将f(0,t)、……f(Q-1,t)以Q行1列来表示的矩阵设为F，将n(0,t)、……n(R-1,t)以R行1列来表示的矩阵设为N，将b(0,t)、……b(P-1,t)以P行1列来表示的矩阵设为B，将x(0,0)、……x(Q-1,P-1)以P行Q列来表示的矩阵设为X，将y(0,0)、……y(R-1,P-1)以P行R列来表示的矩阵设为Y，则可用下式(1)来呈现。式(1)中，矩阵S、F、N、B、X、Y用加粗且斜体的字体来表示。

[数学式1]

S＝XF+YN+B…(1)

例如，当分割数量为20，标识荧光体数量为6，噪声荧光体数量为2时，可用下式(2)来呈现。

[数学式2]

根据式(1)，通过将矩阵F和矩阵N一并替换为(Q+R)行1列的矩阵G，将矩阵X和矩阵Y一并替换为P行(Q+R)列的矩阵Z，可以用下式(3)来呈现。于是，当分割数量为20，标识荧光体数量为6，噪声荧光体数量为2时，下式(3)可以如式(4)那样来呈现。式(3)中，矩阵S、G、B、Z用加粗且斜体的字体来表示。

[数学式3]

S＝ZG+B…(3)

[数学式4]

式(3)是将噪声视作为荧光体，并假定试样中使用的标识荧光体有Q种，试样中包含的噪声荧光体有R种，从而针对Q+R种荧光体从荧光光谱强度变换为荧光体类型强度的矩阵变换方式。

在没有检测出噪声荧光的情况下，矩阵N≈0，成为通常的变换，但在由于泳动而检测出噪声峰的情况下，基于上述来求出矩阵F和矩阵N在确定碱基类型等时是有效的。

矩阵X和矩阵Y是取决于荧光体类型、荧光光谱分割条件等泳动条件的固定值，根据其值和测定的矩阵S、矩阵B，通过最小二乘法来决定各时刻的矩阵F、矩阵N。通过上述处理，能够得到将噪声荧光峰的影响排除在外的标识荧光体强度波形矩阵F，能够得到碱基类型、片段类型的准确值(解析方法1)。

另外，根据上述计算得到的矩阵N来确定每一个检测波段的强度即矩阵YN，并从矩阵S减去该矩阵YN，从而能够得到去除了噪声峰的电泳图(解析方法2)。

<数据处理部中的解析处理>

这里，将上述解析方法1和2作为数据处理部101执行的处理来进行说明。图3是用于说明数据处理部101基于解析方法1执行的电泳数据解析处理的流程图。图4是用于说明数据处理部101基于解析方法2执行的电泳数据解析处理的流程图。

(i)基于解析方法1的处理

(i-1)步骤301

检测机构部37通过照射激光9来对从检查试样产生的荧光进行检测。检测机构部37中，二维检测器34将波长范围分割成P个检查波段0～P-1(P：波长分割数量，例如P＝20)，并重复地输出规定泳动时间t(例如t＝0～10000)内的检测数据。然后，数据处理部101获取从检测机构部37重复输出的检测数据作为电泳图信号(电泳数据)s(p,t)。即，这里，得到与分割波段数量(P个)相应数量的电泳图信号。数据处理部101例如将依次得到的各波段的电泳图信号s(p,t)暂时存储到存储器102中。

(i-2)步骤302

数据处理部101从存储器102读取各波段的电泳图信号，并从该信号分别将呈现非脉冲式变化的信号作为背景强度的时间变化的信号b(p,t)提取出。即，由于获取每一个分割波段(分割成P段)的电泳图信号，因此提取出P个背景强度的时间变化。更具体而言，例如，可以通过对电泳图信号s(p,t)进行低通滤波，去除高次谐波成分的荧光强度信号，并且检测出波形的波谷，将其位置相连而得到的信号作为背景强度的时间变化b(p,t)。此外，还有每隔一定区间获取最小的强度，将其相连从而作为背景强度的时间变化的方式等。

(i-3)步骤303

数据处理部101从存储器102读取预先准备好的检查试样所使用的各标识荧光体的荧光谱线、标识荧光体以外的荧光体(非标识荧光体：例如噪声)的荧光谱线。各标识荧光体谱线是一旦标识荧光体的类型分好就唯一确定的谱线。噪声的荧光谱线通过假定噪声所具备的谱线特征，基于该假定的谱线特征，对过去获取的多个电泳数据(电泳图信号)分别进行解析而决定。因此，这些谱线是取决于泳动条件(荧光体类型、分割条件等)的固定值。例如，各标识荧光体的谱线和噪声的荧光谱线在进行电泳之前求出，并预先存储到存储器102中。

(i-4)步骤304

在上述式(2)或(4)中，对规定的波长分割数量下检测出的电泳图信号s(p,t)、泳动时的背景强度b(p,t)、各标识荧光体的荧光谱线x(q,p)、所设定的噪声谱线y(r,p)、来自泳动时的标识荧光体的荧光强度f(q,t)和泳动时的荧光性噪声的强度n(r,t)之间的关系做出了规定。

数据处理部101例如基于式(4)，使用最小二乘法(一例)来计算各时间的荧光强度f(q,t)和各时间的荧光性噪声的强度n(r,t)。

(i-5)步骤305

数据处理部101将步骤304中计算出的各时间的荧光强度f(q,t)按照不同的标识荧光体显示在输出设备(显示装置)105上(例如参照实施例2的图10)。

(i-6)步骤306

数据处理部101对步骤304中计算出的各时间的荧光强度f(q,t)进行解析，从而决定检查试样中包含的碱基序列。也可以将所决定的碱基序列的信息显示在输出设备(显示装置)105上。碱基序列的决定方法可以使用公知的方法(例如专利文献1记载的方法)。

(ii)基于解析方法2的处理

解析方法2中，步骤301～304中进行与解析方法1相同的处理。因此，这里仅说明不同于解析方法1的步骤401～403。

(ii-1)步骤401

数据处理部101将从存储器102读取到的噪声的荧光谱线y(r,p)与步骤304中计算出的泳动时的荧光性噪声的强度n(r,t)相乘，并将得到的乘积从检测出的各波段的电泳图信号s(p,t)减去，从而获得去除了噪声峰成分的电泳图信号。

(ii-2)步骤402

数据处理部101将步骤401中计算出的去除了噪声峰成分的各波段的电泳图信号显示在输出设备(显示装置)105上(例如参照实施例1的图5的下部和图6的下部)。

(ii-3)步骤403

数据处理部101对步骤S402中计算出的去除了噪声峰成分的各波段的电泳图信号进行解析，从而决定检查试样中包含的碱基序列。也可以将所决定的碱基序列的信息显示在输出设备(显示装置)105上。碱基序列的决定方法可以使用公知的方法(例如专利文献1记载的方法)。

<实施例1>

图5是表示实施例1的噪声荧光去除效果的图。实施例1是基于解析方法2得到的测定结果。图5的上部表示测定(检测)到的电泳图s(p,t)的时间变化，图5的中部表示通过运算得到的噪声荧光n(r,t)的时间变化，图5的下部表示从s(p,t)去除了基于n(r,t)的检测波段成分后减小了噪声荧光峰影响的电泳图。

图5示出荧光体类型有5种时噪声荧光有1种且预先测定并设定荧光谱线的情况下的测定和运算结果。图5中，s(p,t)的时间变化将分割成20段的信号中的第2、5、8、11、14、17段的强度提取出后来表示(各波形示出6个检测波段的强度变化)。另外，在泳动时间t＝9640scan附近检测出噪声峰501。关于该噪声峰501，检测的谱带宽度比荧光体片段的谱带宽度要小，从而可以确认是噪声。通过从图5上部的信号波形s(p,t)的时间变化减去基于噪声荧光成分(图5中部的信号波形)的检测波段，能够得到去除了噪声峰的波形(图5下部的信号波形)，从而能够准确地进行碱基解析。

图5中虽未图示，但在直接基于式(3)决定来自标识荧光体的荧光强度f(q,t)的时间变化的情况下(解析方法1)，也能够得到去除了噪声峰的荧光强度波形。由此，即使在原本的荧光体泳动谱带的谱峰上重叠了噪声的情况下，也能够去除其影响。

<实施例2>

图6是表示实施例2的噪声荧光去除效果的图。实施例2与实施例1相同，是基于解析方法2得到的测定结果。图6中，与图1一样，图6的上部表示测定(检测)到的电泳图s(p,t)的时间变化，图6的中部表示通过运算得到的噪声荧光n(r,t)的时间变化，图6的下部表示从s(p,t)去除了基于噪声荧光成分的检测波段强度成分后减小了噪声荧光峰影响的电泳图。

实施例2中，在泳动时间t＝11170、12220、12650、12720scan附近检测出噪声峰，在s(p,t)中可以看到其噪声峰601～604。从荧光光谱进行判断可知，11170、12220scan(扫描)附近的峰601、602不同于标识荧光体。此外，12650、12720scan(扫描)附近的峰603、604与其它多个泳动谱带相比，谱带宽度变窄，因此也被识别为噪声。由此，可以确认能够判定出噪声峰。通过从图6上部的信号波形s(p,t)的时间变化减去基于所确定的噪声荧光成分(图6中部的信号波形)的检测波段强度成分，能够得到去除了噪声峰的信号波形(图6下部的信号波形)。基于上述去除了噪声峰的信号波形，能够准确地进行碱基解析。

<实施例3>

实施例3示出基于解析方法1的结果的效果。实施例3中示出在测定用于决定碱基序列的试样的情况下，使用4种标识荧光体的例子。作为荧光体1、2、3、4，使用荧光的极大波长各为528nm、549nm、575nm、607nm的荧光体。作为二维检测器34，使用X方向的像素数为256或512像素，并使波长发生约0.72nm/像素的程度的色散，以此来使荧光成像。将检测波长范围设为W1＝520nm，W2＝692nm，并以大致均等的波段宽度分割成20段进行检测(各波段的宽度为约8.6nm)。二维检测器34中，对每约12个像素进行强度的累计来确定强度。

图7表示实施例3中使用的标识荧光体的荧光分光谱线：x(q,p)和噪声荧光谱线：y(r,p)(q＝0,1,2,3，r＝0，p＝0,1,2，……，19)。实施例3中，标识荧光体有荧光体1、2、3、4这4种，噪声荧光体为1种，并预先对各自的荧光强度特性进行另行解析，获得其荧光谱线。图7中示出标识荧光体1～4的谱线701～704和噪声荧光体1的谱线705。信号强度以分割后的所有波段的强度累计值为1的方式进行归一化来表示。

如图7所示，4种标识荧光体和1种噪声荧光体的波长谱线互不相同，根据上述式(3)，可以通过最小二乘法进行逆变换。因此，如图3所说明的，数据处理部101使用最小二乘法，计算来自泳动时的标识荧光体的荧光强度波形：f(0,t)、f(1,t)、f(2,t)、f(3,t)和噪声荧光体的强度波形：n(0,t)。

图8表示所测定的电泳时的电泳图s(p,t)的一例。图8中，泳动时间t＝8600scan～9100scan，并示出检测波段0～检测波段19这20个波段各自的强度变化。图9是表示利用最小二乘法解析得到的噪声荧光体的强度波形：n(0,t)的一部分(噪声荧光1的信号强度901)的图。由图9可知，在t＝8800scan附近检测出噪声峰。但是，根据本公开的方法(解析方法1)，即使检测出这样的噪声峰，也能够去除其影响地对来自标识荧光体的荧光强度波形进行解析。图10示出通过运算去除了噪声峰后的结果(来自各标识荧光体的荧光强度波形f(0,t)、f(1,t)、f(2,t)、f(3,t)：荧光体1～4的强度波形1001～1004)。而图11作为比较例，示出不设定噪声荧光体而计算出的来自标识荧光体的荧光强度波形(荧光体1～4的强度波形1101～1104)。图11的荧光体1的荧光强度波形1101在泳动时间t＝8800～8850的范围内变缓和，可知其受到了噪声的荧光强度波形(图9)的影响。因此，波形缓和部分的碱基识别判断有可能出错。也就是说，荧光体1的强度波形1101的缓和程度越小，出错的可能性就越小，但强度波形1101的缓和程度变大时，荧光体1的碱基有可能重叠显示。从而，为了准确地识别碱基，必须去除噪声成分。对此，可知图10所示的荧光强度波形f(q,t):(q＝0、1、2、3)能更准确地确定噪声峰附近(泳动时间t＝8800附近)的来自标识荧光体的荧光强度。

实施例中将噪声荧光体设定为1种，如果设定为2种，则具有不同谱线的噪声也能够去除，从而准确性更高。例如，图12是表示4种标识荧光体的谱线(荧光体1～4的谱线1201～1204)和2种噪声荧光体的谱线(噪声荧光1和2的谱线1205、1206)的图。这种情况下，4种标识荧光体1201～1204和2种噪声荧光体1205、1206各自的波长谱线互不相同，从而可以识别。

此外，在将检测波长范围加以分割来检测的情况下，检测波段不一定要是连续的，也可以使用不连续(跳跃式)的波段。而且，各波段的波长宽度也无需每个波段都是相同宽度(检测波段宽度均等：实施例3中设定为均等)，也可以是任意的宽度(例：设定为不均等的检测波段宽度：后述的实施例4(图13和图14)中可以将谱峰部分的波段宽度设定为大于其他部分)。例如，可以是荧光极大波长附近更宽(更大)，或者检测出激光9的拉曼散射的波段的宽度变窄(变小)，或者不检测来自该波段的信号。若检测波段宽度连续且均等，则标识荧光体或噪声荧光体不会产生的激光9的拉曼散射的影响会出现在检测信号中，因此，将检测波段设定为不均等是有效的。分割数量也可以不是各实施例中所示的20个。只要在这些条件下设定标识荧光体的荧光谱线、噪声荧光体的荧光谱线即可。

<实施例4>

实施例4中，使用5种标识荧光体来解析5种片段。作为标识荧光体1、2、3、4、5，使用荧光的极大波长各为520nm、550nm、570nm、590nm、655nm附近的荧光体。作为二维检测器34，使用X方向的像素数为256或512像素，并使波长发生约0.72nm/像素的程度的色散，以此来使荧光成像。将检测波长范围设定为W1＝522.5nm，W2＝690nm。波段分割数量与实施例3相同，分割成20段。另外，将各检测波段的波长宽度(＝像素数)设定为不相同，在荧光极大波长附近较宽(较大)，除此以外较窄(较小)。检测波段的宽度与间隔设定为不均等。

图13是表示实施例4中使用的标识荧光体的荧光分光谱线：x(q,p)的图。图14是表示实施例4中使用的噪声荧光谱线：y(r,p)(q＝0,1,2,3,4，r＝0,1，p＝0,1,2，……，19)的图。实施例4中，标识荧光体有荧光体1、2、3、4、5这5种，噪声荧光体为2种，并预先对各自的荧光强度特性进行另行解析，获得其荧光谱线。荧光谱线的强度以波段强度的累计值为1的方式进行归一化来表示。并设定由检测波段编号1、4、7、10、16检测大概5个荧光极大波长范围的荧光。由图13和图14可知，5种标识荧光体和2种噪声荧光体的荧光谱线互不相同。因此，基于式(3)，通过最小二乘法可以进行逆变换。因此，数据处理部101根据上述解析方法1，计算来自泳动时的标识荧光体的荧光强度波形：f(q,t)和噪声荧光体的强度波形：n(r,t)。

图15是表示所测定的电泳时的电泳图s(p,t)的一例的图。图15中，示出泳动时间t＝10000scan～115000scan以及检测波段0～检测波段19这20个波段各自的强度变化。图16是表示根据解析方法1计算出的噪声荧光体的强度波形：n(r,t)的一部分的图。参照图15，在t＝11100scan附近检测出并不是来自标识荧光体的荧光的峰1501。图15中，峰1501的荧光谱线不同于5种标识荧光体，并且其谱带宽度明显窄于荧光体的被标识的片段。因此，峰1501可以识别为噪声峰。但在实施例4中，即使检测出这样的噪声峰1501，也可以去除其影响地对来自标识荧光体的荧光强度波形进行解析。

图17是表示通过解析方法1的运算而得到的结果(来自泳动时的标识荧光体的荧光强度波形：f(q,t))的图。图18是作为比较例没有设定噪声荧光体的荧光谱线y(r,p)而计算出的来自标识荧光体的荧光强度波形的图。图18中，在t＝11100scan附近可识别出尖锐的峰1801。而在图17所示的荧光强度波形f(q,t)中，没有出现峰1801。然后，数据处理部101对去除了噪声峰1801的荧光强度波形进行解析处理。由此，能够进行减小了噪声影响的片段解析。

实施例4中，将噪声荧光体设为1种也能实现去除噪声的效果。另外，在片段解析时，能够应对标识荧光体类型有6种或4种等情况的荧光体的多种组合，能够识别出噪声峰并减小其影响。

<电泳结果的可靠性表示处理>

上述实施例1～4中，将来自标识荧光体以外的物质的荧光强度作为噪声提取出(参照图5、6、9、16)。这样的噪声不出现在电泳结果中是理想的，但要做到0非常困难。在噪声的混入无法避免但要提取的噪声出现频次变多、或者噪声的强度(等级)过大的情况下，可以判断相应的电泳结果(检测数据)自身的可靠性低。因此，例如预先设定可以判断为可靠性低的噪声出现频次的阈值和强度的阈值。于是，数据处理部101判断提取出的噪声的出现频次和强度是否超过上述阈值，在超过了至少一方的阈值的情况下，判定为电泳结果的可靠性低，并将判定结果输出到输出设备105。输出方式可以是警告音，也可以在画面上显示警告。由此，能够提供具有泳动评价判定部的电泳装置，其根据峰值强度及其发生频次来评价泳动结果。从而，操作人员能够判断是否需要再次进行电泳测定。

<总结>

(i)本实施方式中，使试样通过毛细管电泳进行泳动，并对其时间波形进行解析，但本公开不限于毛细管电泳，适用于所有泳动方式并取得同样的效果。另外，标识荧光体以外的物质发光也发生在使用泳动以外的测定方式的情况。

电泳的情况下，发生反应的样本在具有分子筛效果的介质(例如高聚物水溶液)中泳动时，将按照分子量从小到大的顺序进行流动，尤其是在DNA的情况下碱基会逐个地分离，因此通过依次读取，能够测定信号强度。碱基逐个读取是基本的流程，因此，作为碱基逐个读取的方法，也可以使用电泳以外的其他方法。例如，可以在基板上为每一种碱基安装荧光体并读取，拆除后为下一种碱基安装荧光体并读取，重复这样的步骤也能够读取逐个碱基信号。这样的使DNA的碱基序列依次反应并检测的方式和装置也有可能在反应检测时重叠了来自标识荧光体以外的荧光。即，有时会检测到标识荧光体以外的荧光体(视作为噪声荧光体)产生的信号，将其作为噪声。这样的碱基逐个读取的情况下，检测出的信号中的时间信息与连续地读取碱基的碱基泳动基本相同，因此，在碱基产生的荧光强度信号上重叠噪声而被检测出。然后，对标识荧光体以外的物质所产生的发光进行确定，设定其荧光谱线，并作为标识荧光体和标识荧光体以外的荧光体发出荧光来进行变换运算，从而能够将标识荧光体的强度与标识荧光体以外的荧光强度分离，能够更加准确地确定碱基类型。

从而，根据本公开的技术，电泳以外的方法也能够与电泳的情况相同地去除噪声。

(ii)本实施方式中以DNA为例进行了说明，但本公开的技术适用于多糖类、蛋白质(酵素、肽)、核算(DNA、RNA)等生物高聚物。

(iii)本实施方式中，预先设定用于生物高聚物的Q种(Q为1以上的整数)标识荧光体的谱线、不同于标识荧光体的R种(R为1以上的整数)荧光体即非标识荧光体(例如噪声)的谱线，并预先保存在存储器102或存储设备103中。另外，使用电泳等测定方式来检测多个波段的强度的时间变化。而且，数据处理部(例如处理器)101从存储器102等读取标识荧光体的谱线和非标识荧光体的谱线，并利用多个波段的强度的时间变化、Q种标识荧光体的谱线和R种非标识荧光体的谱线来识别Q+R种荧光体。而且，数据处理部101根据识别出的Q种荧光体的数据对生物高聚物进行解析。解析通过公知的技术来进行。由此，通过导入非标识荧光体的谱线，能够确定标识荧光体自身的强度而不受杂质所产生的噪声的影响，并且能够准确地检测并识别生物高聚物的成分。

本实施方式中，设定规定宽度的检测波长范围(例如520nm～700nm)，并将该检测波长范围分割成P(P为正整数：例如分割成20份)个波段，检测多个荧光体的强度的时间变化(s(p,t))。从而，由于每个波段的各标识荧光体的荧光强度比率并不相同，所以能够高精度且高效率地检测出标识荧光体和非标识荧光体，并能将它们分离。

具体而言，本实施方式中，通过2种方法来识别标识荧光体和非标识荧光体。其一是例如根据上述式(1)(或者式(3))，计算f(q,t)，利用所得到的f(q,t)来识别Q种荧光体的方法(解析方法1)。其二是根据式(1)计算n(r,t),从s(p,t)减去基于n(r,t)的检测波段成分，从而去除非标识荧光体的荧光强度，利用去除了非标识荧光体后的多个荧光体的强度的时间变化来识别Q种荧光体的方法。(解析方法2)。

此外，本实施方式中，还可以通过判断R种非标识荧光体的出现频次以及该非标识荧光体的强度中的至少一方是否在预先设定的阈值以上，来评价测定结果的可靠度。从而，操作人员能够判断是否再次进行测定为佳。

(iv)本公开并不局限于上述实施方式和实施例，也包含各种变形例。另外，实施方式和实施例的记载是为了易于理解本公开的技术而进行了详细说明，但并不限定为必须具备上述说明的全部结构。此外，能够将某实施例的结构的一部分替换成其他实施例的结构，此外也能将其他实施例的结构添加至某实施例的结构上。另外，关于各实施例的结构的一部分，也可以进行其它结构的追加、删除、替换。

标识荧光体除了4～6种以外，也可以适用于其它各种情况。另外，噪声荧光体除了1种、2种以外，也可以设定为多种。荧光体的组合除了实施例记载的情况以外，也可以是各种组合。检测波段的设定也可以是更多的分割数量。只要分别设定与这些组合相应的荧光谱线，就可以实施同样的解析。此外，上述实施例中以DNA为测定对象，但也适用于将蛋白质等生物相关成分分离检测的方法和装置，同样能够不受杂质产生的荧光成分的影响或减小影响地进行测定。

标号说明

1 毛细管阵列

2 负电极

3 负电极侧的缓冲液

4 凝胶块

5 连接到凝胶块的连接部

6 阀门

7 接地电极

8 光照射部位

9 激光

10 注射筒

11 恒温槽

12 接地电极侧的缓冲液

15 阵列台

16 毛细管

20 光源

21 高压电源

22 试样导入部

23 第1缓冲容器

24 流动介质注入机构

25 第2缓冲容器

26 检测部

31 荧光集光透镜

32 光栅

33 聚焦透镜

34 二维检测器

35 来自毛细管部的发光

36 来自毛细管部的发光经荧光集光透镜成为平行光的光束

37 荧光的检测机构部

100 毛细管电泳装置

101 数据处理部

102 存储器

103 存储设备

104 输入设备

105 输出设备。

Claims (14)

1.一种生物高聚物分析方法，将生物高聚物作为试样，使用多种荧光体作为标识物，并检测所述荧光体各自的荧光强度，从而对所述生物高聚物进行分析，其特征在于，包括如下步骤：

设定用于所述试样的Q种标识荧光体的谱线，Q为1以上的整数；

设定不同于所述标识荧光体的R种荧光体即非标识荧光体的谱线，R为1以上的整数；

利用规定的测定方式来检测来自所述试样的荧光强度；以及

利用所述荧光强度、所述Q种标识荧光体的谱线、所述R种非标识荧光体的谱线，对Q+R种荧光体进行识别，

在检测来自所述试样的荧光强度时，设定规定宽度的检测波长范围，并将该检测波长范围分割成P个波段来进行检测，P为正整数,

将分割后的每一个波段的检测强度设为s(p,t)，将所述Q种标识荧光体的谱线设为x(q,p),将所述R种非标识荧光体的谱线设为y(r,p),将测定时的背景强度设为b(p,t),将来自标识荧光体的荧光强度设为f(q,t),将来自非标识荧光体的荧光强度设为n(r,t)的情况下，根据下面的式子来识别所述Q+R种荧光体：

或者，

这里，t表示时间，

p表示分割波段的编号，p＝0,1,……，P-1，

q表示标识荧光体类型的编号，q＝0,1,……，Q-1，

r表示非标识荧光体的编号，r＝0,1,……，R-1。

2.如权利要求1所述的生物高聚物分析方法，其特征在于，还包括：

根据所述识别出的Q种荧光体的数据，来对所述生物高聚物进行解析。

3.如权利要求1所述的生物高聚物分析方法，其特征在于，

根据所述式子确定f(q,t)，并识别所述Q种荧光体。

4.如权利要求1所述的生物高聚物分析方法，其特征在于，

根据所述式子确定n(r,t)，并从所述s(p,t)减去由所述n(r,t)造成的信号强度，从而确定去除了所述非标识荧光体的分割后的每一个波段的检测强度，并识别Q种荧光体。

5.如权利要求1所述的生物高聚物分析方法，其特征在于，包括：

使所述试样在毛细管内泳动或者使所述试样逐次反应。

6.如权利要求1所述的生物高聚物分析方法，其特征在于，还包括：

通过判断所述R种非标识荧光体的出现频次以及该非标识荧光体的强度中的至少一方是否在预先设定的阈值以上，来评价所述规定的测定方式的测定结果的可靠度。

7.一种生物高聚物分析装置，将生物高聚物作为试样，使用多种荧光体作为标识物，并检测所述荧光体各自的荧光强度，从而对所述生物高聚物进行分析，其特征在于，包括：

测定部，该测定部利用规定的测定方式来检测来自所述试样的荧光强度；

存储器，该存储器存储用于所述试样的Q种标识荧光体的谱线和不同于所述标识荧光体的R种荧光体即非标识荧光体的谱线，Q是1以上的整数，R是1以上的整数；以及

数据处理部，该数据处理部从所述存储器读取所述Q种标识荧光体的谱线和所述R种非标识荧光体的谱线，并利用所述检测强度、所述Q种标识荧光体的谱线和所述R种非标识荧光体的谱线，识别Q+R种荧光体，

所述测定部将预先设定的规定宽度的检测波长范围分割成P个波段来进行检测，P是正整数，

将分割后的每一个波段的检测强度设为s(p,t)，将所述Q种标识荧光体的谱线设为x(q,p),将所述R种非标识荧光体的谱线设为y(r,p),将测定时的背景强度设为b(p,t),将来自标识荧光体的荧光强度设为f(q,t),将来自非标识荧光体的荧光强度设为n(r,t)的情况下，所述数据处理部根据下面的式子来识别所述Q+R种荧光体：

或者，

这里，t表示时间，

p表示分割波段的编号，p＝0,1,……，P-1，

q表示标识荧光体类型的编号，q＝0,1,……，Q-1，

r表示非标识荧光体的编号，r＝0,1,……，R-1。

8.如权利要求7所述的生物高聚物分析装置，其特征在于，

所述数据处理部还根据识别出的所述Q种荧光体的数据对所述生物高聚物进行解析。

9.如权利要求7所述的生物高聚物分析装置，其特征在于，

所述数据处理部根据所述式子计算f(q,t)，并识别所述Q种荧光体。

10.如权利要求7所述的生物高聚物分析装置，其特征在于，

所述数据处理部具有如下功能：根据所述式子确定n(r,t)，并从所述s(p,t)减去由所述n(r,t)造成的信号强度，从而确定去除了所述非标识荧光体的分割后的每一个波段的检测强度，并显示该强度。

11.如权利要求7所述的生物高聚物分析装置，其特征在于，

所述数据处理部还具有如下功能：通过判断所述R种非标识荧光体的出现频次以及该非标识荧光体的强度中的至少一方是否在预先设定的阈值以上，来评价所述规定的测定方式的测定结果的可靠度。

12.如权利要求7所述的生物高聚物分析装置，其特征在于，

还具有使试样泳动的电泳机构部或者使试样逐次反应的逐次反应机构部。

13.一种生物高聚物分析方法，生物高聚物试样为DNA、低聚糖核苷酸，对所述试样用每一种碱基类型或每一个解析片段都不同的荧光体进行标识，并检测来自试样的荧光，从而对其碱基序列、片段类型进行解析，其特征在于，

设定用于试样的Q种标识荧光体的荧光谱线、以及荧光谱线不同于所述标识荧光体的R种荧光谱线，R为1以上，

根据所述检测荧光强度和Q+R种所述荧光谱线，来识别Q种荧光体，

在检测来自所述试样的荧光强度时，设定规定宽度的检测波长范围，并将该检测波长范围分割成P个波段来进行检测，P为正整数,

将分割后的每一个波段的检测强度设为s(p,t)，将所述Q种标识荧光体的谱线设为x(q,p),将所述R种非标识荧光体的谱线设为y(r,p),将测定时的背景强度设为b(p,t),将来自标识荧光体的荧光强度设为f(q,t),将来自非标识荧光体的荧光强度设为n(r,t)的情况下，根据下面的式子来识别所述Q+R种荧光体：

或者，

这里，t表示时间，

p表示分割波段的编号，p＝0,1,……，P-1，

q表示标识荧光体类型的编号，q＝0,1,……，Q-1，

r表示非标识荧光体的编号，r＝0,1,……，R-1。

14.一种生物高聚物分析装置，生物高聚物试样为DNA、低聚糖核苷酸，对所述试样用每一种碱基类型或每一个解析片段都不同的荧光体进行标识，并检测来自试样的荧光，从而对其碱基序列、片段类型进行解析，其特征在于，

具有数据处理部，该数据处理部根据用于试样的Q种标识荧光体的荧光谱线、荧光谱线不同于所述标识荧光体的R种荧光谱线、以及所述检测荧光强度，识别Q种荧光体，R为1以上，

测定部将预先设定的规定宽度的检测波长范围分割成P个波段来进行检测，P是正整数，

将分割后的每一个波段的检测强度设为s(p,t)，将所述Q种标识荧光体的谱线设为x(q,p),将所述R种非标识荧光体的谱线设为y(r,p),将测定时的背景强度设为b(p,t),将来自标识荧光体的荧光强度设为f(q,t),将来自非标识荧光体的荧光强度设为n(r,t)的情况下，所述数据处理部根据下面的式子来识别所述Q+R种荧光体：

或者，

这里，t表示时间，

p表示分割波段的编号，p＝0,1,……，P-1，

q表示标识荧光体类型的编号，q＝0,1,……，Q-1，r表示非标识荧光体的编号，r＝0,1,……，R-1。