CN101748207A - 单一波长的dna测序装置 - Google Patents
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Abstract
单一波长的DNA测序装置，包括工作台，工作台上依次分别设置有荧光激发系统，阵列毛细管系统，荧光探测系统和数据处理系统，所述荧光激发系统由760-960nm波长的一个激光器，及激光器光束位置上设置的反射镜，与反射镜中轴线呈45°的位置设置的一低倍物镜和在低倍物镜光束的垂直线位置上设置的一观测目镜构成；本发明用一个激光器取代现有测序仪的多个激光器，同时激发四种不同荧光染料的多光子荧光，实现DNA序列的毛细管电泳分离和多光子荧光探测，极大地简化了传统的检测系统，具有灵敏度高、仪器成本低、噪声低、体积小等特点。
Description
(一)技术领域：本发明涉及一种DNA测序装置，具体是单一波长的DNA测序装置。
(二)背景技术：DNA序列分析是基因组学和现代分子生物学领域最重要的技术之一，是了解基因结构和功能的基础。目前使用的DNA序列分析装置主要是以电泳分离理论为基础而设计的，具有操作简单、经济实用、探测灵敏、分离效率高等优点。Smith等人采用4种荧光试剂标记，4光谱通道检测系统，首次进行了毛细管电泳激光荧光检测的DNA序列分析，Mathies和Kambara等提出另一种测序装置，即采用20只毛细管并列电泳，激光荧光电荷藕合阵列检测器(CCD)检测，进一步提高了检测的灵敏度。Yeung等又提出了100只毛细管阵列电泳装置，采用CCD检测器同时检测100只毛细管的DNA分离样品，均获得满意效果。但上述检测装置有一个共同点，即是均采用多个激光光源，对应激发多个不同荧光染料的多光子荧光，以实现DNA序列的毛细管电泳分离和多光子荧光探测，因此，价格十分昂贵，且体积较大，不利于仪器的小型化和固定化；此外，当蓝、绿光照射时，凝胶层、玻璃等的荧光背景较强，影响仪器的灵敏度。
(三)发明内容：本发明就是提供一种能有效降低系统成本，体积较小且易于固定，灵敏度高的单一波长的DNA测序装置。
单一波长的DNA测序装置，包括工作台，工作台上依次分别设置有荧光激发系统，阵列毛细管系统，荧光探测系统和数据处理系统，其特征在于：所述荧光激发系统由760-960nm波长的一个激光器，及激光器光束位置上设置的反射镜，与反射镜中轴线呈45°的位置设置有一低倍物镜和在低倍物镜光束的垂直线位置上设置的一观测目镜构成。
本发明与现有技术的不同之处就是是用波长范围为760-960nm的一个激光器取代现有技术中的多个激光器，实现多光子激发。
所谓多光子激发荧光，通常情况下，一个分子或者原子每次只能吸收一个光子，从基态跃迁到激发态，当光强足够高时，就会产生多光子跃迁，即一次可以吸收多个光子。
许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发光谱宽阔，这样，可以用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的不同信息，便于相互对照。所以，可以用一个激光器取代多个激光器，同时激发四种不同荧光染料的多光子荧光，实现DNA序列的毛细管电泳分离和多光子荧光探测，极大地简化了传统的检测系统。采用长波长激发光源，可避开拉曼散射和瑞利散射，且远离发射光谱，有利于降低背景的噪声，提高仪器系统的灵敏度。同时还具有成本低和噪声低的特点。
本发明包括荧光激发系统，阵列毛细管系统，荧光探测系统和数据处理系统四大部分。荧光激发系统提供高功率激发光，并聚焦在毛细管上，同时实现不同荧光试剂的多光子激发；阵列毛细管系统由方形毛细管并排构成，在高压电源的驱动下，实现4种不同荧光标记的DNA碱基对序列的分离；荧光探测系统通过4个通道探测四种不同荧光试剂的多光子激发的荧光；数据处理系统，通过自动控制收集荧光并处理，最终得到DNA序列。
(四)附图说明：
图1是本发明的结构示意图；
图2是利用本发明对6种荧光染料分子的分离图谱图；
图3是用本发明对DNA质粒样本的分离图谱图。
图中：1-工作台，2-激光器，3-反射镜，4-低倍物镜，5-观测目镜，6-阵列毛细管，7-荧光收集物镜，8-四通道荧光过滤轮，9-光纤阵列探测器，10-光电二极管，11-数据采集卡，12-计算机，13-控制器。
(五)具体实施方式：
图1中示出的是构成本发明的荧光激发系统、阵列毛细管系统、荧光探测系统和数据处理系统中各仪器之间按光路顺序排列的相对位置及构成情况。
本发明包括在工作台1上设置的荧光激光系统，它由长波长激发光源即波长范围为760-960nm的激光器2，反射镜3，数值孔径为0.22-0.45的低倍物镜4，观测目镜5构成。激光器2实现多光子激发，反射镜设置在激光器的光束位置上，低倍物镜设置在与反射镜中轴线呈45°的位置，观测目镜则设置在与低倍物镜所发光束的垂直线上；所述毛细管系统是阵列毛细管6，它可以采用单根方形毛细管或多根方形毛细管并排组成；所述荧光探测系统由荧光收集物镜7，四通道荧光过滤轮8，光纤阵列探测器9和光电二极管10构成，荧光收集物镜和上述观测目镜分别设置在阵列毛细管两侧，四通道荧光过滤轮设置在荧光收集物镜之后，光纤阵列探测器和光电二极管均设置在四通道荧光过滤轮的后部。所述数据处理系统包括计算机数据采集处理硬件和处理软件，其中硬件包括数据采集卡11、计算机12和控制器13，该控制器分别连接计算机和四通道荧光过滤轮，并对四通道荧光过滤轮进行控制。
本发明的工作过程是：激光器提供长波长激发光源，实现多光子激发，反射镜将激光束反射经低倍物镜垂直照射在阵列毛细管上，实现高通量、高效率分离，并通过观测目镜实现聚焦于毛细管正中心；荧光收集物镜收集来自阵列毛细管的荧光后，经过四通道荧光过滤轮，过滤掉环境散杂光，荧光信号为光纤阵列探测器所探测，并在光电二极管中实现转换，光信号变成电流信号；计算机数据处理系统中的数据采集卡收集到光电二极管电流信号后，进一步放大和滤波，数据采集卡收集的信号，结合控制器对四通道荧光过滤轮的控制信号，运用相应软件计算并处理出DNA序列。
具体实验操作要求：
1、毛细管处理：
①多种荧光染料分离：每次进样前分别以0.1mol/L HCl、0.1mol/L氢氧化钠、水和25mmol/L硼砂pH 9.50溶液，高压冲洗未涂层石英毛细管(57cm×75μm)10mi n；
②DNA分离：每次进样前分别以0.1mol/L HCl、0.1mol/L氢氧化钠、水和2％HEC/1×TBE/20mmol/L高压冲洗未涂层石英毛细管(57cm×75μm)10min，再用1％PVA对处理后的毛细管进行表面改性；
③分离高压：20KV。实验前，毛细管需要先进行高压平衡10分钟。
2、进样方式：①多种荧光染料进样：采用虹吸进样，15cm×60s；
②DNA进样：电动进样，-6kV×10s。
3、DNA样本衍生化反应：P1和P2为5’端FITC修饰。
4、实验步骤：
1)荧光检测系统调节好，将荧光焦点对准方形毛细管中央。
2)高压平衡毛细管10分钟；
3)调节计算机，控制器和四通道荧光过滤轮处于工作状态，同时使检测系统，毛细管系统等处于工作状态。
4)进样检测。
为了论证本发明，进行了下列实验：
1、单一波长实现激发波长不同的多种荧光试剂的同时激发。
6种荧光染料分子的激发波长和发射波长如表1，如果采用单光子激发则需要多种波长的激光器，也就说要同时实现6种荧光染料分子的同时激发，需要多个波段的激光器。本发明采用单一波长可以同时实现激发和收集。实验成功地表明本发明同时实现多种染料分子的激发，并实现毛细管电泳分离和荧光探测。实验结果如图2。
表1 6种荧光染料分子的激发波长和发射波长
| 荧光染料分子 | 激发波长(nm) | 发射波长(nm) |
| 若丹明6g | 525 | 555 |
| 若丹明B | 540 | 625 |
| 磺酸罗丹明B | 520 | 595 |
| 香豆素 | 445 | 525 |
| 钙黄素 | 494 | 517 |
| APTS 8-氨基芘-1，3，6-三磺酸钠盐 | 424 | 505 |
2、采用本发明对DNA样本进行了多光子荧光电泳分离，实验结果如图3。实验表明可以对DNA进行测序。
Claims (1)
1.单一波长的DNA测序装置，包括工作台，工作台上依次分别设置有荧光激发系统，阵列毛细管系统，荧光探测系统和数据处理系统，其特征在于：所述荧光激发系统由760-960nm波长的一个激光器，及激光器光束位置上设置的反射镜，与反射镜中轴线呈45°的位置设置的一低倍物镜和在低倍物镜光束的垂直线位置上设置的一观测目镜构成。
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