KR20110133617A - 두 유체 사이의 박형 고체상 계면을 영상화하는 방법 - Google Patents
두 유체 사이의 박형 고체상 계면을 영상화하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 제 1의 측면 및 제 2의 대향 측면을 구비한 고체 상 멤브레인(solid state membrane); 멤브레인의 제 1의 측면 상에 위치되고 제 1의 굴절율을 갖는 제 1의 유체를 포함하는 제 1의 유체 챔버; 및 멤브레인의 제 2의 측면 상에 위치되고 제 2의 굴절율을 갖는 제 2의 유체를 포함하는 제 2의 유체 챔버를 포함하고 상기 제 1의 굴절율과 제 2의 굴절율과 서로 다른 광학 현미경 관찰법(optical microscopy tool)을 위한 유체 셀(fluid cell)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서로 다른 굴절율을 갖는 제 1의 유체와 제 2의 유체 사이의 고체 상 멤브레인에 이버네선트 조명 필드를 생성하는 단계; 및 고체 상 멤브레인에서 단일 생체분자에 링크된 광학 검출기에 의해 발광된 빛을 검출하는 단계를 포함하는 단일 생체분자를 영상화하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2009년 3월 26일자로 출원되고 본원에 언급함으로써 그 내용이 전체적으로 통합된 미국 가특허출원 61/211,260의 이익을 청구한다.
정부 지원
본 발명은 계약번호 HG-004128에 의해 미국국립보건원(National Institutes of Health)에 의한 정부의 지원하에 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 권리는 갖는다.
본 발명은 광학 현미경에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 향상된 생체분자의 영상화를 위한 두 유체 사이의 박형 고체상(thin solid-state) 계면을 활용한다.
제 1 기준 인간 게놈 서열의 완성은 게놈 변환(genomic variations)이 직접적으로 약물 발견 및 의료적 치료에 영향을 주는 시대가 시작함을 나타낸다. 이러한 새로운 패러다임은 저가이고 초고속인 DNA 시퀀싱 방법에 대한 절박한 필요성을 대두시켰다. 머지 않아, 의료 기술자들은 약을 처방하기 이전에 임상조건에서 개별적인 환자들의 DNA를 일상적으로 분석할 수 있고 그것들을 게놈 정보 온라인 데이터기반에 대하여 체크하여 임의의 약물에 관련된 게놈 정보가 작성될 것이다. 부가적으로, 가격이 알맞은 시퀀싱 기법들이 비교 유전자학 및 분자 생물학에 연구들을 변화시켜 과학자들이 세포 변이체들로부터의 전체적인 게놈들을 빨리 서열화할 수 있도록 할 것이다.
초고속이고 저가인 DNA 시퀀싱을 실현하기 위해, 새로운 기술들이 Sanger's 디데옥시 프로토콜에 기초한 전통적인 방법들을 대체하도록 요구된다. 이러한 새로운 기술들은 두 개의 주요한 애로 사항들(bottlenecks)을 해결해야 한다: (1) 샘플 크기는 최소화되도록 축소되어 단일 DNA 분자 또는 작은 복제수로부터 시퀀스 판독(readout)을 가능하게 해야 한다; 및 (2) 판독 속도는 현재 최신식의 기법들에 비해 몇 차수(several orders of magnitude) 증가되어야 한다.
실리콘 질화물, 실리콘 산화물 및 기타의 고체상 표면들은 조직 공학, 이식가능한 장치들 및 기초 연구 항목들을 포함하는 다양한 생의학적 응용에 사용되어왔다. 박형 고체상 표면들은 예를 들어, 바이오센싱(biosensing) 및 DNA 시퀀싱 응용들에 사용된 나노슬릿들 및 나노기공 어레이들과 같은 서로 다른 마이크로 및 나노 구조 장치들과 관련하여 사용되어 왔다. 실리콘 질화물 멤브레인들은 최근에 생체분자 검출 및 DNA 시퀀싱과 같은 응용들을 위한 고체상 나노기공들을 생성하기에 적절한 기판들로 나타난다. 고체상 나노기공을 통한 DNA 상호전좌(전좌) 및 언지핑(unzipping)의 단일 분자 광학적 검출이 개입된 고체상 장치들은 바이오센싱 및 게놈 시퀀싱에 중요한 것으로 인식된다. 이러한 장치들을 통한 광학적 신호들의 단일 분자 생체 외 측정을 위해 이버네선트 모드(evanescent mode)의 현미경을 사용하는 것이 유용하다. 생의학적 연구 및 의학용 장치들의 필드에서, 관심있는 물질들을 통한 영상화에 의한 분자들, 세포들 및 조직들을 연구하는 능력이 바람직하다. 하나의 이러한 영상화 기법은 내부 전반사 형광 현미경법(total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM or TIRF))이다.
그러나, 이들에 관련된 필드에 사용되는 고체상 물질들은 TIRF와 같은 최신의 광학 현미경 방법들에 사용할 수 없다. 기존의 기법들에서는, 이러한 고체상 물질 표면들을 글래스 커버슬립(glass coverslip)과 같은 다른 표면의 이버네선트 필드로 이동하는 것이 어렵고, 실리콘 질화물 멤브레인 및 생물학적 샘플들을 TIRF 이버네선트 필드 레짐(regime)으로 이동하는데 필요한 나노-유체 채널들을 구성하는 것이 극도로 지루하다. 더욱이, 입자들의 내재적인 밀도(비록 청정실 환경이어도), 이러한 실리콘 질화물 칩들을 처리하는 동안 생성된 미립자들 및 이러한 실리콘 질화물 멤브레인 칩들의 온도 제한의 한계에 기인하여 이러한 나노기공들을 실리콘 질화물 표면들로 실링(sealing)하는 것은 어려운 과제이다.
발명의 요약
본 발명의 구현예들은 인덱스 매칭(index-matched) TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence microscopy)에 의한 이러한 고체상 멤브레인들(나노기공 장치들 또는 다른 생체학적 샘플들을 이동시킴)에서 이러한 멤브레인들을 가로지르는 두 개의 미디어(media) 사이에서 이버네선트 모드 여기를 달성한다. 이는 멤브레인 상의 하나이상의 생체분자들의 고해상, 고 콘트라스트(high contrast) 및 고감도 영상의 획득을 허용한다. 본 발명의 하나의 양상에 의하면, 광학 현미경 도구용 유체 셀은 제 1의 측면 및 제 2의 대향 측면을 구비한 고체상 멤브레인; 멤브레인의 제 1의 측면에 위치된 제 1의 유체 챔버(유체 chamber)로서, 제 1의 유체 챔버는 제 1의 굴절율을 갖는 제 1의 유체를 포함하는 제 1의 유체 챔버; 및 멤브레인의 제 2의 측면 상에 위치된 제 2의 유체 챔버로서, 제 2의 유체 챔버는 제 2의 굴절율을 갖는 제 2의 유체를 포함하고, 제 1의 굴절율은 제 2의 굴절율보다 높은 제 2의 유체 챔버;를 포함한다.
고체상 멤브레인은 실리콘 질화물, 실리콘 산화물, 알루미늄 산화물, 티타늄 산화물 또는 기타 유전체 물질들일 수 있다.
고체상 멤브레인들은 실리콘 웨이퍼상에 증착된 실리콘 질화물층을 포함할 수 있다. 실리콘 질화물층은 5-50nm 두께일 수 있다. 실리콘 웨이퍼는 윈도우를 포함할 수 있고 실리콘 질화물층은 윈도우를 덮거나 이를 가로질러 연장된다.
제 1의 유체는 수용성 버퍼 용액 또는 물일 수 있다. 제 2의 유체는 셀룰러(cellular) 유체, 세포막 또는 글리세롤일 수 있다. 제 1의 유체는 농축된 요소 용액 또는 CsCl 용액일 수 있다. 광학적 생체표지자에 링크된 생체분자는 멤브레인의 제 2의 측면에 제공될 수 있다. 생체분자는 DNA 분자일 수 있다. 생체분자는 RNA 분자일 수 있다. 생체분자는 단백질 분자일 수 있다. 광학적 생체표지자는 여기가능한 형광물질일 수 있다.
제 1의 유체 챔버는 마이크로채널(microchannel)일 수 있다.
고체상 멤브레인은 적어도 하나의 나노기공을 포함할 수 있고, 임의의 구현예들에서, 다수의 나노기공을 포함할 수 있다. 다수의 나노기공들은 원형 또는 정다각형 어레이(array)로 배열될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 의하면, 단일 DNA 분자들을 영상화하기 위한 광학 현미경 도구는 실리콘 웨이퍼의 윈도우를 덮는 고체상 멤브레인, 고체상 멤브레인의 일측면 위에 있는 제 1의 유동 챔버, 제 1의 유동 챔버 내에서 제 1의 굴절율을 갖는 제 1의 유체, 멤브레인의 다른 측면 위에 있는 제2의 유동 챔버 및 제 2의 유동 챔버 내에서 제 1의 굴절율보다 낮은 제 2의 굴절율을 갖는 제 2의 유체를 포함하는 유체 셀(유체 cell); 글래스 커버슬립으로서, 유체 셀이 커버슬립 위에 장착되어 글래스 커버슬립이 제 1의 유동 챔버의 바닥 표면을 형성하는 커버슬립;대물렌즈; 대물렌즈와 글래스 커버슬립 사이의 침지오일; 대물렌즈에 직접 빛을 비추도록 구성된 광원으로서, 대물렌즈는 빛의 초점을 맞추도록 구성되어 고체상 멤브레인이 덮는 윈도우보다 더 작은 이버네선트 조명 필드이 형성되는 광원; 및 고체상 멤브레인에서 단일 DNA 분자들에 의해 발광된 빛을 검출하는 영상 검출기를 포함한다.
광원은 적어도 하나의 여기 레이저를 포함하고, 임의의 구현예들에서, 서로 다른 파장에서 레이저 빔을 생성하는 다수의 레이저들을 포함하며, 영상 검출기는 전자 증폭 전하 결합 소자(CCD) 카메라 또는 광검출기를 포함할 수 있다.
비오틴-스트렙트아비딘(Biotin-streptavidin) 화학은 단일 DNA 분자들을 고체상 멤브레인 상에 고정시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 의하면, 단일 생체분자들을 영상화하기 위한 광학 현미경은 서로 다른 굴절율을 갖는 제 1의 유체와 제 2의 유체 사이의 고체상 멤브레인에서 이버네선트 조명의 필드을 생성하는 수단; 및 고체 상 멤브레인에서 단일 생체분자에 링크된 광학 표지자들에 의해 발광된 빛을 검출하기 위한 수단을 포함한다.
고체상 멤브레인에서 이버네선트 조명 필드를 생성하기위한 수단은 여기 레이저 및 초점 렌즈들을 포함할 수 있다. 광학 표지자들에 의해 발광된 빛을 검출하기 위한 수단들은 광검출기 또는 전자 증폭 CCD 카메라를 포함할 수 있다.
광학 현미경 도구는 또한 고체상 멤브레인 상에 단일 생체분자를 고정하기 위한 수단들을 포함할 수 있다.
이버네선트 조명 필드는 고체상 멤브레인의 차수들(dimensions)보다 더 작을 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 단일 생체분자를 영상화하기 위한 방법은 서로 다른 굴절율을 갖는 제 1의 유체와 제 2의 유체 사이의 고체상 멤브레인에서 이버네선트 조명 필드를 생성하는 단계; 및 고체상 멤브레인에서 단일 생체분자에 링크된 광학 표지자들에 의해 발광된 빛을 검출하는 단계를 포함한다.
방법은 고체상 멤브레인 상에 단일 생체분자를 고정하는 단계를 포함한다.
검출된 빛으로부터 영상이 생성된다.
본 발명의 다른 양상에 의하면, 단일 DNA 분자를 영상화하는 방법은 광학 현미경 도구의 대물 렌즈에 빛을 접촉시키는 단계; 빛이 제 1의 유체를 직접 통과하는 단계; 실리콘 질화물 멤브레인에서 빛을 반사시켜 제 2의 유체 내에 이버네선트 조명 필드를 생성하는 단계;및 이버네선트 조명 필드에 의해 여기되고 단일 DNA 분자로 링크된 광학 생체표지자에 의해 발광된 빛을 영상 검출기에 접촉시키는 단계를 포함한다.
이버네선트 조명 필드는 제 2의 유체 내에 생성될 수 있다. 단일 DNA 분자는 제 2 유체 내에서 실리콘 질화물 멤브레인 상에 고정될 수 있다.
도 1의 본 발명의 일 구현예에 의한 유체 셀의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 의한 유체 셀 계면의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 의한 계면에서의 TIR을 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 의한 광학 현미경 도구의 개략도이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 의한 TIRF 하에서 영상화된 단일 DNA 분자의 형광 영상이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 의한 DNA 시퀀싱 접근을 보여주는 개략도이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 의한 1 비트(a) 및 2 비트(b) DNA 판독을 사용한 광전동시검출(simultaneous electrical optical detection)을 보여주는 개략도이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 의한 멀티컬러(multi-color) 광학 현미경 도구 셋업(setup)의 개략도이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 의한 기공 로컬리제이션 카운터 히스토그램(localization counter histogram)이다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 일 구현예에 의한 다중 기공으로부터의 동시 판독(도 10a) 및 다중 비트의 동시 판독(도 10b)을 포함하는 다공 검출에서의 부가적인 단계들을 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 의한 유체 셀의 개략도이다.
도 11a는 본 발명의 일 구현예에 의한 도 11의 유체 셀의 상세한 개략도이다.
도 11b는 본 발명의 일 구현예에 의한 도 11의 유체 셀의 상세한 개략도이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 의한 TIRF하에서 영상화된 단일 DNA의 형광 영상이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 의한 분석 하드웨어의 블록도이다.
도 14a-c는 본 발명의 일 구현예에 의한 전기적 및 광학 신호들의 동기화(synchronization)를 도시한 도면이다.
도 15a-15b는 본 발명의 일 구현예에 의한 나노기공을 통한 DNA 분자들의 쓰레딩(threading)를 도시한 도면이다.
도 16a-16b는 도 15a-15b의 쓰레딩이 일어나는 동안 전기적 및 광학 신호들의 동기화를 도시한 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 의한 계면에서의 TIR를 보여주는 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 의한 유체 셀 계면의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 의한 계면에서의 TIR을 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 의한 광학 현미경 도구의 개략도이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 의한 TIRF 하에서 영상화된 단일 DNA 분자의 형광 영상이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 의한 DNA 시퀀싱 접근을 보여주는 개략도이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 의한 1 비트(a) 및 2 비트(b) DNA 판독을 사용한 광전동시검출(simultaneous electrical optical detection)을 보여주는 개략도이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 의한 멀티컬러(multi-color) 광학 현미경 도구 셋업(setup)의 개략도이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 의한 기공 로컬리제이션 카운터 히스토그램(localization counter histogram)이다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 일 구현예에 의한 다중 기공으로부터의 동시 판독(도 10a) 및 다중 비트의 동시 판독(도 10b)을 포함하는 다공 검출에서의 부가적인 단계들을 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 의한 유체 셀의 개략도이다.
도 11a는 본 발명의 일 구현예에 의한 도 11의 유체 셀의 상세한 개략도이다.
도 11b는 본 발명의 일 구현예에 의한 도 11의 유체 셀의 상세한 개략도이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 의한 TIRF하에서 영상화된 단일 DNA의 형광 영상이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 의한 분석 하드웨어의 블록도이다.
도 14a-c는 본 발명의 일 구현예에 의한 전기적 및 광학 신호들의 동기화(synchronization)를 도시한 도면이다.
도 15a-15b는 본 발명의 일 구현예에 의한 나노기공을 통한 DNA 분자들의 쓰레딩(threading)를 도시한 도면이다.
도 16a-16b는 도 15a-15b의 쓰레딩이 일어나는 동안 전기적 및 광학 신호들의 동기화를 도시한 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 의한 계면에서의 TIR를 보여주는 개략도이다.
본 발명의 구현예들은 나노미터 두께의 고체상 멤브레인을 통한 단일 분자 및 생물학적 물질의 영상화 방법에 관계한다. 이러한 방법은 종래의 전기적 측정에 더하여 단일 분자들 및 생물학적 물질의 광학적(예를 들어, 형광)측정을 허용하기 때문에 유리하다. 일 구현예에서, 단일 분자 또는 생물학적 물질은 두 개의 혼화성/비혼화성 유체사이의 박형 고체상 계면을 통해 이버네선트 모드에서 영상화된다. 유체 셀은 서로 다른 굴절률을 갖는 두 개의 혼화성 액체들 사이에 고체상 계면을 제공한다. 고체 상 계면은 수 나노미터에서 수십 나노미터까지의 두께로 존재할 수 있고 실리콘 질화물, 실리콘 산화물 및/또는 유사한 것들로 만들어질 수 있다.
고체 상 계면에서 나노기공 또는 나노기공 어레이를 통한 생체분자(예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질)의 전좌를 위해 전위가 두 개의 유체들로 적용될 수 있다. DNA 전좌에서, 단일-가닥 DNA 분자들은 일렬 방식으로 나노기공을 통해 전기영동적으로 구동된다. 이러한 구현예에서, 타겟 DNA 시퀀스의 각각의 염기는 생화학적 변환에 의해 2 또는 4 유닛 코드, 2 10-20 bp 뉴클레오티드 시퀀스 상에 최초로 맵핑(mapped)된다. 이러한 2-유닛 또는 4-유닛 코드들은 상보적으로(complementary) 혼성화되고 형광 라벨화되고 셀프-켄칭(self-quenching) 분자 비콘들(beacons)이다. 나노 기공을 통해 전좌되는 동안 분자 비콘들은 순차적으로 언지핑(unzipped)되고, 그것들의 형광 태그들은 비켄칭(unquenched)되고 단일-컬러 또는 멀티-컬러(예를 들어 2 또는 그 이상의 컬러) 내부 전반사 형광 현미경법(total internal reflection fluorescence microscopy(TIRF))에 의해 판독된다. 결과 단일-컬러 또는 멀티 컬러 광신호는 타겟 DNA 시퀀스로 상관(correlated)된다.
본 발명의 구현예들은 고체 상 계면에 고정되고 "두꺼운" 수용성 유체 층(즉, 고굴절율 유체) 위에 위치된 단일 생체분자 또는 생물학적 물질의 고해상 및 고감도 영상의 획득을 허용하기 때문에 유리하다. 보다 구체적으로, 이러한 "두꺼운" 유체 층 내부에 이버네선트 장 깊이를 실현하여, 박형 고체 상 계면에서 분자들 또는 생물학적 물질의 고 광학 콘트라스트 검출이 사용되어 단일 생체분자 또는 생물학적 물질을 영상화한다. 도 1에 본 발명의 일 구현예에 의한 유체 셀이 도시되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 유체 셀(100)은 제 1의 챔버(104) 및 제 2의 챔버(108)를 포함한다. 제 1의 유체(112)는 제 1의 챔버(104) 내에 있고 제 2의 유체(116)는 제 2의 챔버(108) 내에 있다. 두 개의 유체들(112,116)은 서로 다른 굴절율로 선택된다. 제 1의 유체(112)는 제 2의 유체(116)보다 고 굴절율을 갖도록 선택된다. 두 개의 유체들(112,116)의 굴절율은 계면(120)에서 내부 전반사(TIR)를 수득하도록 선택된다. 예를 들어, 제 1의 유체(112)는 세포질(n=1.36) 또는 세포 멤브레인(n=1.47)일 수 있고, 제 2의 유체(116)는 수용성 버퍼 용액(n=1.33)일 수 있다. 다른 구현예에서, 제 1의 유체(112)는 염을 포함한다. 두 개의 유체들(112, 116)은 수용액이다.
유체 셀(100)은 또한 계면(120)을 포함한다. 계면(120)은 고체 상 멤브레인(124)를 포함한다. 계면(120)은 제 1의 챔버(104)와 제 2의 챔버(108) 사이에 위치되어 두 개의 유체들(112,116)을 분리한다. 두 개의 유체들(112,116) 사이의 계면(120)은 전반사(TIR)이 일어나도록 허용한다. 특히, TIR 조명은 고체 상 멤브레인(예를 들어, SiN 멤브레인)(124)에서 발생하고 제 1의 챔버(104) 내에 이버네선트 파장을 생성한다. 특히 멤브레인(124)에서, 계면(120)은 생체분자 결합(biomolecular interactions)을 위한 기질을 형성한다.
도 2는 계면(120)의 상세도이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 계면(220)은 윈도우(224)를 구비한 칩(228)을 포함한다. 칩(228)은 프레임으로 작용하여 윈도우(224)를 덮는 고체 상 멤브레인을 지지한다. 칩의 예시적인 디멘젼들은 5mm x 5mm x 300μm일 수 있고, 멤브레인의 예시적인 디멘젼들은 50μm x 50μm x 5-50nm일 수 있다. 계면(220)은 화학기상증착(CVD), 습식 식각 및 포토리소그래피를 포함하는 종래의 기법들을 사용하여 임의의 호환성있는 고체 상 물질(예를 들어, 실리콘 기반 물질들)로부터 만들어진다.
일 구현예에서, 칩(228)은 실리콘이고 실리콘 질화물 멤브레인에 의해 덮힌다. 멤브레인이 유전체 물질이어서 박막 상에 형성될 수 있는 것이 바람직하다. 다른 예시적인 멤브레인 물질들은 실리콘 산화물, 알루미늄 산화물, 티타늄 산화물 및 유사 물질들을 포함한다. 다른 예시적인 물질들은 글래스, 용융실리카, 석영 및 유사 물질들을 포함한다.
본원에 개시된 고체 상 멤브레인은 대략 5-60nm의 두께일 수 있다. 예를 들어, 고체 상 멤브레인은 대략 10nm이다. 그러나, 멤브레인의 두께는 소정의 크기 및 두 개의 혼화성 액체들 사이의 TIR 조명으로부터 생성된 이버네선트 파장의 감쇠를 얻도록 선택될 수 있고 5nm보다 더 얇거나 60nm보다 더 두꺼울 수 있다. 멤브레인의 나노미터 두께는 TIR이 일어나는 두 개의 액체들 사이의 계면의 샤프한 경계를 규정하는데 도움을 준다.
임의의 구현예들에서 고체 상 멤브레인은 나노기공, 나노슬릿 또는 나노기공 어레이를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 나노기공들(1-lOOnm) 또는 나노기공 어레이들은 계면을 가로질러 유체들을 연결한다. 고체 상 나노기공들은 가변 디멘젼들을 구비하고 광범위한 온도, pH 및 화학적 변화들을 견딜 수 있다. 나노기공(들)은 예를 들어, Ar 이온빔 또는 전자-빔 스컬프팅(sculpting) 또는 반응성 이온 에칭을 사용하여 제조될 수 있다.
도 3은 광학 현미경 도구를 구비한 TIR 기반 측정을 위한 정규 현미경 글래스 커버슬립(240)에 장착된 유체 셀(100)을 도시한 도면이다. 커버슬립(240)은 대물 렌즈(236) 상에 장착되고 침지 오일(238)이 커버슬립(240)과 대물 렌즈(236) 사이에 제공된다. 형광물질과 같은 광학적 생체표지자로 링크된 하나 이상의 생체분자 또는 생물학적 물질이 영상화를 위해 멤브레인(224) 상에 고정된다.
광학적 생체표지자는 이버네선트 파장으로의 노출에 대응하여 방사선을 비추거나 발광하는 임의의 물질일 수 있다. 예시적인 광학적 생체표지자들은 형광 프로판들 또는 형광 공명 에너지 트랜스퍼(FRET) 태그들(tags)(예를 들어, 형광물질), 양자점 및 유기 화합물들을 포함한다. 당업자들에게 바람직하게, 광학적 생체표지자는 예를 들어, 공유 또는 비공유 결합과 같이 잘 알려진 기법에 의해 관심있는 생체분자와 관련될 수 있다. 발명의 일 구현예에서, 광학적 표지자들은 화학적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 다른 구현예에서, 생체분자는 예를 들어 세포 수용체 또는 신호 분자에 융합된 녹색 형광 단백질과 같은 재조합 융합에 의한 광학적 표지자와 결합할 수 있다.
레이저 광(242)이 대물 렌즈(236)의 후면 포컬(focal) 평면에 집속(focused)된다. 침지 오일(238) 및 글래스 커버슬립(24)의 인덱스 매칭(index matching)에 기인하여, 미디어 1(216) 내로 빛이 굴절된다. 멤브레인(224)에서 빛은 두 개의 액체들(212,216)의 매칭되지 않은 굴절율에 기인하여 내부 전반사된다(246). 빛은 고굴절율(고밀도)로부터 저굴절률(저밀도) 매체(medium)로 통과할 때 노멀(normal)으로부터 표면으로 반사된다. 두 매체의 계면에서 입사각이 임계각보다 크면, 빛은 고밀도 매체로 내부 전반사된다. 이버네선트 파장(246)이 기하급수적으로 감쇠되는 강도를 갖는 저밀도 매체 내에 생성되는데 이는 멤브레인(224)의 표면에서 형광물질들을 여기시킬 수 있다(전형적인 여기 광원의 "스킨(skin)" 깊이는 수십 나노미터이다). 여기된 형광물질들(250)에 의해 생성된 빛은 글래스 커버슬립(204)의 아래에 위치된 대물 렌즈(236)에 의해 집속되고 예를 들어, CCD 카메라 또는 광검출기와 같은 영상 장치에 의해 측정된다.
일 구현예에서, 빛은 멤브레인(224) 영역보다 이버네선트 파장(246) 영역이 더 작도록 생성된다. 다른 구현예에서, 빛은 멤브레인(224)영역과 이버네선트 파장(246) 영역이 동일하도록 생성된다.
임의의 구현예들에서, 멤브레인 내의 나노기공들, 나노슬릿들 또는 나노기공 어레이들은 다양한 촉진제들(stimulants)을 사용하여 살아있는 세포를 국지적으로 자극하도록 사용될 수 있다. 이러한 자극에 대한 반응은 본원에 개시된 이버네선트 모드 영상화를 사용하여 세포 멤브레인 상의 원위 위치들에서 측정될 수 있다.
생체분자 또는 생물학적 물질(예를 들어, 세포들)이 영상화되도록 멤브레인(224)상에 직접 위치될 수 있다. 대안으로, 얇은 버퍼 또는 중간층이 멤브레인(224)과 생체분자 또는 생물학적 물질 사이에 제공되어 영상화된다. 예를 들어, 유기 폴리머 분자들의 박막이 중간층으로 사용될 수 있다.
도 4에 본 발명의 구현예들에 의한 예시적인 광학적 현미경 도구(400)가 도시되었다. 광학 도구(400)의 구성요소들 및 배열은 도 4에 도시된 바와 같이 다양할 수 있다. 현미경 도구(400)는 레이저원(402), x-축 변환단(406), 렌즈(414), 렌즈(418), 백색광원(422), 편광 빔 스플리터(PBS)(426), 렌즈(430), 대물 렌즈(436), 이색성 거울(dichromatic mirror(DM))(468), 필터(472), 거울(476), 렌즈(480), CCD와 같은 검출기(484)를 포함한다. 제 1의 유체(412), 제 1의 유체(412)와 서로 다른 굴절율을 갖는 제 2의 유체 및 고체 상 멤브레인(424)을 포함하는 유체 셀이 글래스 커버슬립(440) 위에 위치된다. 침지 오일이 글래스 커버슬립(44)과 대물 렌즈(436) 사이에 제공된다.
도시된 현미경 도구(400) 내에, 레이저광 또는 백색광이 사용되어 내부 전반사 형광 현미경법을 수행하도록 사용된다. 일 구현예에서, 레이저광(410)은 렌즈들(414,418)에 직행(directed)되고 형상화(shaped)되는 레이저원(402)에 의해 생성된다. 렌즈들(430)은 레이저 빔의 크기를 축소하도록 구성된다. 렌즈들(414,418)이 또한 레이저 빔의 크기를 축소시킬 수 있다. x-축 변환단(406)을 사용하여 x-축을 따라 레이저 섬유 커플러를 이동시켜서 빛은 광학 축밖으로 이동될 수 있다. 다른 구현예에서, 백색광은 백색광원(422)에 의해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 백색광 및 레이저광 모두가 사용되어 내부 전반사 형광 현미경법을 수행할 수 있다. 빔 스플리터(426)는 제 1의 유체(412)내의 샘플(예를 들어, 생체분자(들))을 향하는 레이저 및/또는 백색광원(422)에 의해 생성된 빛을 직접 향하도록 구성된다. 또 다른 구현예에서, 다중 레이저 파장길이들이 동시에 또는 한 번에 하나씩 사용되어 단일-컬러 또는 다중 컬러 형광표지들(flurophores)을 여기시킨다.
렌즈(430) 및 이색성 거울(468)을 통과한 후에 생성된 빛은 대물 렌즈(436)에서 제한되어 내부 전반사되기에 충분한 빛이 샘플에서 직행된다. 대물 렌즈(436)은 레이저 빔의 크기를 더 축소할 수 있다. 레이저 빔 크기는 직경이 대략 .5mm-lmm일 수 있다. 렌즈들(414,418,430 및/또는 436)은 빔을 수렴(converge)하여 빔은 직경이 대략 5μm인실리콘 멤브레인에서 대략 멤브레인(424) 영역으로 스팟(spot) 크기를 생성한다. 예를 들어, 멤브레인(424)이 50x50μm2 이면, 5-50μm의 스팟 크기가 생성될 수 있다.
빛(442)은 글래스 커버슬립(440)을 향해 고체-상 멤브레인(424)에서 내부 전반사되고 이버네선트 필드는 제 2의 유체(416) 내에 생성된다. 고체 상 멤브레인(424)의 부근에 위치된 형광물질들은 이버네선트 파장에 의해 여기되는데 이버네선트 파장은 형광물질들이 형광등(fluorescent light)을 발광하도록 한다. 형광등 및 반사된 빛(452)은 이어서 이색성 거울(468)에 의해 필터(472)를 향하여 직행된다. 이색성 거울(468) 및 필터(472)는 빛을 필터링하여 오직 형광등 방사(emissions)만 통과된다. 거울(476)은 렌즈(480)를 통해 검출기(484)로 형광등을 직행시킨다.
검출기(484)는 북아일랜드, 벨페스트(Belfast)에 있는 Andor Technology pic. (Andor) 로부터 입수가능한 iXon BV887와 같은 EMCCD 카메라일 수 있다. 다른예에서 검출기(484)는 애벌런치 광다이오드(Avalanche Photodiodes)(APDs) 및 광전배증관(Photomultiplier Tubes)(PMTs)을 포함한다. 검출기(484)는 개인용 컴퓨터에 기초한 마이크로소프트 윈도우와 같은 적절한 영상 시스템 및 솔리스 소프트웨어(Solis software)(이역시 Andor 로부터 입수가능함)와 같은 영상 소프트웨어에 연결되어 검출기(484)에 의해 생성된 데이터 신호들을 진행시키고 영상 및 영상 시리즈를 생성한다. 주문제작 소프트웨어가 사용되어 데이터 신호들을 분석하고 형광 방사(fluorescent emissions)를 검출하며 조사중인 생체분자 또는 생물학적 물질의 시퀀스 또는 기타 특징들을 결정할 수 있다.
계면에서 TIR 여기 영역은 여기 빔 물성들에 의존한다. 레이저 빔은 잘 알려진 레이저 빔 형상 기법들을 사용하여 형상화되어 TIR 모드에서 레이저 조명 필드를 조절한다. 따라서, 빔의 크기는 원하는 직경으로 증가 또는 감소되거나 연장될 수 있다.
도 5에 현미경법 도구(400)와 같은 현미경법 도구를 사용하여 생성된 예시적인 영상이 도시되었다. 도 5에서, 예시적인 샘플의 TIRF 조명(504)의 뷰(view) 필드가 보여진다. 도 5에 또한 두 개의 대표적인 유체들, 특히 7M CsCl (n=1.416) 및 8M 요소(n=1.416)로 영상화된 현미경법 도구를 이용하여 영상화된 단일 형광 DNA 분자들(508)이 도시되었다. 그러나 본 발명의 다른 구현예들에 의하면, 다른 유체들이 사용되어 단일 생체분자를 영상화할 수 있다. 도 5에서, 단일 DNA 분자들은 초당 5프레임의 영상 획득(image acquisition)에서 -2.5의 배경비(background ratio)로 신호를 갖는 실리콘 질화물 멤브레인 위에 영상화된다.
도 6-1Ob는 본 발명의 일 구현예에 의한 멤브레인(124)이 나노기공(600)을 포함하는 것을 도시한 도면이다. 도 6에 도시된 바와 같이,나노기공(600)을 구비한 멤브레인(124)을 포함하는 구현예들은 DNA 전좌를 사용한 DNA 시퀀싱에 특히 적용가능하다. 그러나 나노기공(610)을 갖는 멤브레인(124)를 포함하는 구현예가 DNA 전좌를 사용한 DNA 시퀀싱에만 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 유전자형분석(genotyping applications), 생체분자 영상화 및 생체분자 스크리닝에 적용될 수 있다. 다른 구현예에서 단백질들은 나노기공(600)을 통해 영상화될 수 있다.
DNA 전좌에서, 단일-가닥 DNA 분자들은 일렬 방식(single file manner)으로 나노기공(600)을 통해 전기영동적으로 구동된다. 이러한 구현예들에서 유체 셀(100)은 유체들(112, 116)에 인가된 전기적 전위를 생성하도록 구성된 에너지원에 연결된 전극들을 더 포함하여 나노기공(600)을 통해 DNA 분자들을 전기영동적으로 구동할 수 있다.
도 6에서, 검출된 광학 지표에 링크된 단일 생체분자는 뉴클레오티드 A, T, U, C, 또는 G로 표시되는 시퀀스 코드로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)이다. 일 구현예에서, 광학 지표들은 DNA 시퀀스 상에 명확히 기록되는 형광 지표들이다.
일 예시적인 라벨링(labeling) 절차에서 고유 DNA는 뉴클레오티드 그룹으로 치환된다(각각의 염기 타입은 3-16 뉴클레오티드의 독특한 시퀀스로 치환된다.). 광학 지표로 링크된 올리고뉴클레오티드는 나노기공이 시퀀싱되는동안 시퀀스되도록 코딩된(coded) 핵산 시퀀스로부터 혼성화된 올리고뉴클레오티드의 언지핑(unzippin)으로 검출될 수 있다.
예를 들어, 하나의 DNA 변환 절차에서, 고유 DNA 시퀀스 내의 각각의 염기는 독특한 2 개의 이진 코드(binary code) 단위의 조합에 의해 대표된다(각각, 개방된 고체의 원형내에 라벨링된 0 및 1). 이러한 경우에, 0 및 1은 각각 "SO" 및 "Sl"인 10개의 뉴클레오티드의 독특한 DNA 시퀀스로서 정의된다. 단일-가닥 변환 DNA는 2 개의 코드 유닛에 상보적인 두 개의 타입의 분자 비콘들로 혼성화되고 최소 단면을 나타낸다. 예를 들어, 비콘들 중 하나는 그것의 5' 말단 및 켄처(quencher) 위, Q, 그것의 3'말단에 적색 형광물질을 포함할 수 있고 다른 비콘은 그것의 5' 말단 및 그것의 3' 말단에서 동일한 켄처 분자에 녹색 형광물질을 포함할 수 있다. 광대역-스펙트럼 켄처 분자 Q는 양 형광물질을 모두 켄칭한다. 서로 다른 두 개의 색의 형광물질들은 서로 다른 두 개의 비콘들을 구별할 수 있도록 한다. 다른 DNA 변환 절차에서, 고유 DNA 시퀀스에서 각각의 염기는 네 개의 독특한 코드들(시퀀스들)의 원 아웃(one out)에 의해 대표되는데, 이들은 이어서 대응되는 4-컬러 분자 비콘들로 혼성화된다. 모든 절차에서, 변환된 DNA 시퀀스는 비콘들의 나란한 정렬을 유도하여 이웃 비콘들 상의 켄처들은 형광 방사를 켄칭하고 DNA는 개별적인 코드 유닛이 DNA로부터 순차적으로 제거될 때 까지 "다크(dark)"를 유지한다(첫번째 비콘은 제외). 본 발명에 사용될 수 있는 예시적인 형광물질은 TMR 및 Cy5를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 형태의 형광 분자들은 CPM, Invitrogen의 Alexa 시리즈 형광 지표들, Rhodamine family 및 Texas Red 이다. 본 발명이 속하는 분야의 당업자들에게 알려진 다른 신호 분자들은 본 발명의 범위 내에 속한다. 본 발명에 사용될 수 있는 수많은 다른 형광물질들은 본원에 전체로 참조된 미국등록특허 제 6,528,258호에 열거된 것들을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 켄칭 분자들은 Dabcyl, Dabsyl, 메틸 레드 및 Elle 켄처를 포함한다. 본 발명이 속하는 분야의 당업자들에게 알려진 다른 켄처 분자들은 본 발명의 범위 내에 속한다. 이는 이웃 분자들 및 용액 내의 자유 비콘들로부터 형광 배경을 명백히 감소시켜 더 높은 신호/배경 비율(signal-to-background)의 결과를 낳는다.
도 6을 참조하면, 변환된 DNA에 상보적인 형광으로 태그된 올리고뉴클레오티드들은 이어서 DNA로 혼성화되고 분자는 멤브레인(124) 내에서 나노기공(600)을 통해 전기영동적으로 공급된다. 나노기공(600)은 부착된 형광물질들로부터 발생하는 서로 다른 컬러 내에서 빛의 플래쉬들(flashes)이 검출되는 동안에 올리고뉴클레오티드들을 하나씩 순차적으로 필 오프(peel off)하는데 사용된다. 분자가 나노기공으로 유도되면, 비콘들은 하나씩 벗겨진다. 신규 비콘이 제거되는 각 시간에 신규 형광물질이 켄칭되지 않고 현미경에 의해 등록된다. 해리된 비콘은 자동으로 폐쇄되고 그것의 고유의 형광을 켄칭하여 나노기공 근처로부터 멀리 분산된다. 제 1의 비콘의 즉각적인 해리에 의해 제 2의 비콘으로부터의 신규 형광물질은 밝아진다.
DNA 전좌 속도는 DNA 언지핑 동역학에 의해 조절되고 염기 내의 콘트라스트는 광학 프로브들(또는 비콘들)의 사용을 통해 수득된다. 나노기공(600)으로의 DNA 입장은 블록화된 레벨(blocked level)으로의 이온 전류를 갑자기 감소시킨다. 다른 측면으로부터 DNA가 나오면, 개방 기공 전류 레벨은 저장된다. 적절한 전압이 DNA 언지핑 시간(예를 들어, 1-10ms)를 튜닝(tune)하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 10-bp 헤어핀동안, 120-mV 전위가 대략 10ms의 언지핑 시간을 얻는다. 이 시간은 신호/배경 레벨들을 최적화하도록 전계 강도에 의해 튜닝된다.
이러한 방식으로, 임의의 핵산 시퀀스는 결정될 수 있다. 코딩된 시퀀스로 시퀀스된 핵산 변환, 코딩 시스템들 및 나노기공 시퀀싱에 대한 상세한 기술들은 Soni 및 Meller (Soni G. V. 및 Meller A., Progress towards ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores, Clinical Chemistry 53, 11 (2007)), Meller et al., 2009 (미국특허공보 2009/0029477), 및 Meller 및 Weng (PCT 출원번호 PCT US 2009/ 034296)에 기술되었다. 상기 인용문헌들은 본원에 그 내용이 전체적으로 통합된다. 이러한 방법이 나노기공 어레이들을 통해 동시에 사용될 수 있다.
도 7의 (a)에 1 비트 및 (b)에 "2 비트"로 사용된 코딩된 나노기공 시퀀싱 컬러가 도시되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 본원에 기술된 장치 및 방법들은 하나 및 두 개의 비트 DNA의 동시적인 전기적 및 광학적 검출을 고 신호/잡음비로 판독하고 단일 형광물질 해상도가 나타나도록 허용한다.
2-비트 컬러 코딩은 도 8에 도시된 멀티컬러 TIRF 현미경과 같은 멀티컬러 광학 현미경법을 사용하여 수득될 수 있다. 도 8에 도시된 구현예에서, 서로 다른 파장 길이를 갖는 두 개의 레이저원들(802a, 802b)은 각각 개별적으로 또는 동시적으로 조명화될 수 있어서 서로 다른 광학적 생체표지자들의 개별적이거나 동시적인 여기에 대하여 서로 다른 파장 길이를 갖는 두 개의 이버네선트 파장을 생성한다. 유사하게, 3 또는 그 이상의 컬러 코드 시스템에 대하여 서로 다른 파장을 갖는 세 개 또는 네 개의 레이저원들이 개별적으로 또는 동시에 조명화되어 서로 다른 광학적 생체표지자들의 개별적 또는 동시적인 여기에 대한 서로 다른 파장 길이를 갖는 세 개 또는 그 이상의 이버네선트 파장을 생성할 수 있다.
도 8에 도시된 바와 같이, 제 1의 레이저원(802a)는 제 1의 레이저 빔(810a)을 생성하고 제 2의 레이저원(802b)은 렌즈 L에 의해 대물 렌즈(836)로 형상화되고 직접 향하는 제 2의 레이저 빔(810b)을 생성한다. 렌즈들 L은 레이저 원들(802a, 802b)에 의해 생성된 레이저 빔들(810a, 810b)의 크기를 축소하도록 구성된다. 일 구현예에서, 레이저 원들(802a, 802b)은 청색 및 적색 다이오드 레이저들 (488nm 및 640nm)의 조합이고 샘플을 조명하도록 사용될 수 있다. 도 4에 대한 설명에서 기술한 바와 같이, 빛(802a, 802b)은 멤브레인(124)에서 내부 전반사되고 유체 셀 내에서 영상화된 생체분자에 링크된 형광물질들을 여기시키는 이버네선트 필드가 생성된다. 도 8에 도시된 구현예에서, 멤브레인(124)은 상술한 DNA 전좌를 허용하는 나노기공(600)을 포함한다.
이어서 형광등(850)은 대물 렌즈(836)을 사용하여 수집되고 이색성 거울 DM 및 필터 F에 의해 필터링되고 영상 또는 광검출기에 대한 기판 이송 냉각 전자-증폭 CCD 카메라(electron-multiplying charge-coupled device camera)와 같은 영상 또는 검출기(884)에 직접 향한다. 검출기(884)는 개인용 컴퓨터에 기초한 마이크로소프트 윈도우와 같은 적절한 영상 시스템 및 솔리스 소프트웨어(Solis software)(이역시 Andor 로부터 입수가능함)와 같은 영상 소프트웨어에 연결되어 검출기(884)에 의해 생성된 데이터 신호들을 진행시키고 영상 및 영상 시리즈를 생성한다. 주문제작 소프트웨어가 사용되어 데이터 신호들을 분석하고 형광 방사를 검출하며 조사중인 생체분자(예를 들어, DNA) 시퀀스 또는 기타 특징들을 결정할 수 있다.
도 9는 DNA 언지핑시 도 8에 도시된 다중컬러 광학 현미경법에 대한 기공 로컬리제이션 카운터 히스토그램(localization counter histogram)을 예시적으로 도시한 도면이다.
나노기공 어레이들의 광학적 시각화들이 본원에 기술된 구현예들을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 광학 시각화는 도 10A에 도시된 다중 기공으로부터 동시 판독 및/또는 도 10B에 도시된 다중 비트의 동시 판독에 대하여 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예들은 예를 들어, 세포 및 조직 유착을 시각화하여 SiN 멤브레인과 같은 고체 상 물질에 의한 세포-독성(cyto-toxicity) 및 생체적합성을 연구하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예들은 또한 나노기공, 나노슬릿 또는 나노기공 어레이를 통해 계면을 가로지르는 매체 내에 촉진제(stimulants)를 갖는 세포를 국지적으로 여기하여 멤브레인을 통한 광학 현미경법을 사용하여 세포 반응을 측정하는데 사용될 수 있다. 신규 생물질(SiN과 같은)과의 접촉 또는 촉진제에 대한 세포 반응은 세포 멤브레인 상에 생체 표지자들의 형광 판독에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 구현예들은 또한 고체 상 멤브레인 내에서 제조된 나노기공 내에서 형광으로 라벨링된 핵산 또는 기타 생체고분자들의 수송 또는 일시적 로징(lodging) 동안에 단일 분자 해상도(single molecule resolution)로 이들을 영상화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예들은 또한 DNA 전좌(translocating)와 같은 생체고분자에 화학양론적으로 부착되거나 나노 기공 내에 일시적으로 로징된 형광 라벨링된 단백질들을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예들은 멀티컬러 검출에 사용될 수 있고 따라서 DNA에 부착된 생물학적으로 구별되는 단백질들의 공간적인 국소화(spatial localization)를 검출할 수 있다.
본 발명의 구현예들은 고속 약물 스크리닝 동안에 나노기공을 통한 DNA 시퀀싱에 사용될 수 있다.
TIR 조명 필드의 크기는 빔 직경 및/또는 입사 레이저 빔의 형태의 변화에 의한 적용에 따라서 변화될 수 있다.
일 구현예에서, 도 17에 도시된 바와 같이, 대물 렌즈(236a)는 트랜스 챔버(204) 아래가 아닌 시스 챔버(208) 위에 위치되고 대물 렌즈(236a)는 영상화에 사용될 수 있다. 이러한 구성에서, 레이저 빔(242)는 멤브레인(224)에서 대물 렌즈(236a)가 아닌 렌즈(236b)를 사용하여 집속될 수 있다. 도 3에 대한 설명에서 상술한 바와 같이, 침지 오일(238) 및 글래스 커버슬립(240)의 인덱스 매칭에 의해 레이저(렌즈 236b를 통한)로부터의 빛(242)은 미디어 1(216) 내로 굴절된다. 멤브레인(224)에서, 빛은 두 개의 액체들(212,216)의 매칭되지 않은 굴절율에 기인하여 내부 전반사(246)되고, 이버네선트 파장(246)이 기하급수적으로 감쇠되는 강도를 갖는 저밀도 매체인, 미디어 1(216) 내에 생성되는데 이는 멤브레인(224)의 표면에서 형광물질들을 여기시킬 수 있다(전형적인 여기 광원의 "스킨(skin)" 깊이는 수십 나노미터이다). 여기된 형광물질들에 의해 생성된 빛은 시스 챔버(208)의 위에 위치된 대물 렌즈(236a)에 의해 집속되고 CCD 카메라(484) 또는 광검출기에 의해 측정된다.
실시예
실시예
1
샘플
지오메트리
중앙에서 프리 스탠딩(free standing) 20-50nm 두께의 실리콘 질화물 윈도우[50μm x 50μm]를 갖는 [5mm x 5mm x 300μm] 실리콘 칩이 실리콘 웨이퍼 상의 LPCVD 코팅된 SiN 층 위에 표준 포토리소그래픽 방법에 의해 제조되었다. 투 파트 PTFE/CTFE 유체 셀이 도 3에 도시된 바와 같이 칩과 글래스 커버슬립 사이의 2-10μm 두께 마이크로채널을 형성하는 글래스 커버슬립위에 이러한 칩들을 장착하도록 디자인되었다. 트랜스 챔버(204)인 마이크로채널은 더 높은 굴절율(70% 글리세롤 [n=1.42])을 갖는 유체로 채워지고, 시스 챔버(208)는 물[n=1.33] 내의 샘플 용액 버퍼로 채워졌다.
TIRF
셋업
및
레이
다이아그램(
ray
diagram
)
내부 전반사 [TIR] 현미경 관찰이 도 4에 도시된 바와 같이 셋업되었다. 레이저 빔 크기는 0.7mm로 축소되고 상업적으로 입수가능한 변환된 현미경(Olympus IX-71)의 맞춤형으로 디자인된 백 포트(back port) 내로 런치(launched)되고 내부적으로 장착된 200 mm 포컬 길이 렌즈를 통해 6OX 1.45 NA 오일-침지 TIRF 대물(objective)의 후방 포컬 평면에서 집속(focused)되었다. 레이저 포인트는 X-축을 따라 레이저 섬유 커플러를 이동시킴으로써 광학 축 밖으로 이동되었다. 글래스[n=1.52], 70% 글리세롤 [n=1.42] 및 샘플 버퍼[n=1.33]의 굴절율은 빛이 트랜스 챔버 내의 오일, 글래스 커버슬립 및 70% 글리세롤을 통해 실리콘 질화물 멤브레인에서 글리세롤-물 계면에 닿을 때까지 굴절되도록 선택되었다. 이 계면에서 TIR 모드에 대한 임계각은 스넬의 법칙에 의한 글래스-물 계면과 동일하다.
n glass sin(θ glass ) = n gly sin(θ gly ) = n w sin(θ w )
n은 글래스, 글리세롤 70% 또는 물의 굴절율이고, θ는 각각의 계면에서의 굴절각이다. 뷰 필드(field of view)의 중앙은 높은 굴절율 유체 층의 두께에 따라서 빛 전파(propagation)의 방향으로 이동된다. 형광 방사는 내부 렌즈에 의해 3X 확대되고 동일한 대물에 의해 수집되고 적절한 광학 필터를 통과한 이후에 상업적으로 이용가능한 EMCCD 카메라(Andor iXon BV887) 상에 영상화된다. 영상화는 Andor Solis 소프트웨어 또는 맞춤형으로 씌어진 소프트웨어(custom written software)를 사용하여 이루어진다.
샘플 고정(
Sample
immobilization
)
DNA 분자[57 bp]가 5' 말단으로부터의 위치 20에서 아민 개질된 티민(thymine) 염기를 갖는 5'말단에서 비오틴(biotin) 콘쥬게이션으로 IDT Tech로부터 구입되었다. DNA 분자는 벤더 프로토콜(vendor's protocols)을 이용하여 ATTO647N7N 염색 분자들[ATTO-tech]로 라벨링되었다. DNA 분자는 스트렙트아비딘-비오틴 화학(streptavidin-biotin chemistry)에 의해 실리콘 질화물 표면 상에 고정되었다. 표면은 신선하게 준비된 Piranha 용액(15 분, 7:3 v/v 의 황산 및 과산화수소 용액)내에서 세정되고 많은양의 DI-물로 린스되었다. 표면들은 0.1 mg/ml BSA-비오틴 애에서 밤새 인큐베이트되고, 바인딩 버퍼 [1OmM Tris-Cl pH8.5]로 린스되고 0.1 mg/ml의 스트렙트아비딘에 30-60분간 인큐베이트되고, 바인딩 버퍼로 린스되고 이어서 DNA 라벨링된 비오틴으로 15-30분간 인큐베이트되었다. 표면은 이어서 유체 셀 내에 장착되었다. 70%의 글리세롤이 글래스 커버슬립과 실리콘 칩 사이의 트랜스 마이크로채널 내에 채워지고 바인딩 버퍼가 시스 챔버 내에 채워졌다. 표면은 이어서 실리콘 질화물 표면에서 TIRFM에 의해 영상화되었다.
결과
실리콘 질화물 멤브레인(예를 들어, 20x40μm2 크기 및 20nm 두께)이 도 4에 도시된 바와 같이 글래스 커버슬립 위에 장착되었다. 트랜스 및 시스 챔버 내에 두 개의 유체들이 각각 글리세롤70% (v/v) (n=1.42) 및 물(n=1.33)로 선택되었다.
여기 레이저 빔이 도 5에 도시된 바와 같이 멤브레인의 차수보다 더 작은 이버네선트 필드를 형성하도록 형상화되었다. 빔의 직경을 0.7 mm로 축소시킴으로써 스팟 크기는 SiN 멤브레인 크기보다 더 작아졌다.
대물 렌즈(n=1.55)로 입장된 빛은 침지 오일(n=1.52), 글래스 커버슬립(n=1.55), 액체 2(70% 글리세롤) (n=1.42)을 통해 계면 및 최종적으로 물(n=1.33)을 가로질러 전파되었다. 빛은 글리세롤을 물로부터 분리하는 계면에서 내부 전반사되었다.
여기 필드 지오메트리를 계산하기 위해 20 nm TMR 비드가 멤브레인의 시스 측면 상에 흡착되고 TIRF 모드로 영상화되었다. 이러한 TMR 비드를 X 및 Y 축을 따라 이동시키고 영상 광학의 배율 계수(magnification factor)를 사용하여 이버네선트 필드는 약 ~10x20um로 계산되었다.
실시예에서, 3' 및 ATTO647N 라벨링된 5'에서 바이오틴화된(biotinylated) 단일 DNA 분자들은 비오틴-스트렙트아비딘 화학(즉, 방법 및 물질)을 사용하여 실리콘 질화물 표면의 시스 측면 상에 고정되었다.
실시예
2
TIRF
셋업
실험에 있어서, 나노기공(600)을 갖는 프리-스탠딩 SiN 멤브레인(20 x 20 μm )(1124)를 포함하는 실리콘 칩(1128)이 계면으로 사용되었다. 실리콘 칩(1128)은 글래스 커버슬립(1140) 위에 장착되었고, 글래스 커버슬립은 도 11에 도시된 바와 같이 맞춤형으로 제작된 클로로트리플루오로에틸렌(CTFE 폴리머) 유체 셀(1138) 상에 장착되어 마이크로 유체 트랜스 챔버(1100)를 생성하였다. 유체 셀(1138)은 실리콘 칩(1128)을 유지하는 인서트(1138a) 및 외부 셀(1138b)를 포함하여 유체 챔버들을 형성하였다. 속경화형 폴리디메틸실록산(PDMS) 층이 실리콘 칩(1128)을 CTFE 인서트(1138a)에 연결하고 글래스 커버슬립(1140)을 외부 셀(1138b)에 연결하도록 사용되었다. 인서트(1138a)를 갖는 유체 챔버는 시스 챔버이고 실리콘 칩(1128)과 글래스 커버슬립(1140) 사이의 공간은 트랜스 챔버이다. 트랜스 챔버는 입-출구 유동 채널을 사용하여 굴절 인덱스 버퍼(1112)로 채워졌다. 전기적인 측정을 위해 트랜스 전극(1140a)이 유동 채널 내의 측면 개방 내로 제공되고, 시스 전극(1140b)이 인서트(모두 Ag/AgCl)(1116) 내의 버퍼 속으로 함침되었다. 나노기공(600)이 도 11a에 도시된 바와 같이 광학 가시화 및 측정을 위한 전환 현미경(1136)으로 유체 셀(100)을 정렬하도록 사용되었다.
시스 챔버, nw∼1.33, (물 버퍼, 1M KCl 및 10 mM 트리스, pH 8.5) 및 트랜스 챔버(고굴절률 n Cs 을 갖는 수용액 버퍼)내에 사용된 버퍼의 굴절율들은 유리 굴절율n g = 1.5(nw < n Cs , < n g )보다 더 작다. 특히, 7M CsCl 및 10 mM 트리스, pH 8.5 ("Cs7M," n =1.41)을 포함하는 염 버퍼 용액이 시스 챔버 내에의 버퍼로 사용되었다.
글래스/트랜스 챔버 계면의 임계 반사각보다 더 작지만 도 11b에 도시된 바와 같이 SiN 멤브레인에서 TIR 여기를 생성하는 트랜스/시스 임계각보다 조금 더 큰 각 θ g 에서 글래스 커버슬립 측면으로부터 평행한 광선 빔이 유도되었다. 고 개구수(NA) 대물(Olympus 6OX /1.45)이 사용되어 그것의 백 포컬 평면(d)에서 축 지점을 벗어나도록 입사 레이저 빔을 집속시켜 입사각 θ g 을 조절하여 TIR을 얻도록 사용되었다. TIR 여기 영역의 평면 내 위치는 거리 d = h tan( θ Cs ) (h는 트랜스 챔버의 높이)로 위치되었다.
입사 레이저 빔 넓이는 긴 포컬 길이 색수차(achromatic) 더블렛 렌즈(200 mm)를 이용하여 형상화되었는데, SiN 멤브레인 상의 조명된 영역은 대략 10 X 20 μm2 이다. 640 nm 레이저(20 mW) (iFlex2000, 포인트-소스(Point-Source), Hamble, UK)가 단일-모드 편광-보존 광학섬유를 통해 시스템으로 연결되고, 0.7 mm 직경의 평행 가우시안 레이저 빔이 생성되었다. 이러한 높은 품질의 빔은 대물 출입에서 단단히 집속된 스팟을 보장하고, 따라서 바람직하지 않은 스캐터링(scattering)을 최소화한다. 멤브레인 표면의 시스 측면은 통상의 절차를 사용하여 스트렙트아비딘으로 코팅된다. 각각 단일 ATTO647N 형광물질로 라벨링된 쇼트 비오틴화된 DNA 올리고들이 멤브레인 표면 상에 고정되고 최대 EM 게인 및 10 ms 인테그레이션에서 작동하는 멀티플라잉(multiplying) CCD 카메라 위에 형광 빛을 프로젝팅하여 영상화된다. EMCCD 카메라(electron multiplying charged coupled device camera) (Andor, iXon DU-860)가 멤브레인 표면으로부터 형광 영상들을 기록하는데 사용되었다. 도 12는 본 발명의 일 구현예에 의한 TIRF하에서 영상화된 멤브레인 표면 상에 고정된 단일 분자의 전형적인 세 개의 영상이다. 도 12에 도시된 바와 같이 단일 형광물질은 고 콘트라스트를 갖도록 분해(resolved)되어 더 이상의 영상 처리가 필요없다.
입사각이 증가하면서 TIR에 대한 임계각은 (1) 멤브레인의 시스 측면으로부터 관찰된 레이저 빛의 급격한 사라짐, (2) 현미경의 접안렌즈를 사용한 대물 렌즈의 백 포컬 평면에서 시각화된, 위치된 TIR 레이저 빔 현상 및 (3) 단일-분자 영상화를 위한 배경 대 신호를 증가시키는 배경 강도의 갑작스러운 감소의 원인이 된다.
배경 대 신호에서 A ≥2-배의 증가가 에피(epi)-조명(샘플의 하나의 측면으로부터의 조명 및 검출) 위의 SiN 멤브레인 상에 고정된 단일 형광물질들의 영상화에서 얻어진다.
광학 및 전기 신호들의 동기 검출(
Synchronous
Detection
of
Optical
and
Electrical
Signals
)
광학 및 전기 신호들의 동기 검출을 위해 하드웨어(예를 들어, 마이크로소프트 윈도우 또는 리눅스) 및 랩뷰(LABVIEW) 소프트웨어의 조합이 디자인되었다. 도 3은 획득 하드웨어를 개략적으로 도시한 도면이다. Axopath 200B 증폭기(amplifier) 1386 (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA)가 헤드스테이지(1388)을 통해 Ag/ AgCl 전극에 연결되어 나노기공을 가로질러 이온 전류 신호를 증폭시켰다. 이온 전류 신호들은 내부 포-폴(four-pole) Butterworth 필터(1390)를 사용하여 50 KHz 에서 낮게 통과-필터링(pass-filtered) 되었고 동일한 PC에서 다기능 데이터 획득 보드(1392)로 입력되어 영상 획득 보드(1394)(Andor iXon Acquisition Board)를 통해 CCD 카메라로부터 영상 데이터를 얻었다. 다기능 데이터 획득 DAQ 보드(1392)(National Instruments, PCI-6154)가 사용되어 16 비트 에서 아날로그에서 디지털로 변환되는 해상도에서 이온-전류 신호를 얻었다.
EM-CCD 카메라(1384)로부터의 "파이어(fire)" 펄스(각각의 노출 초기를 표지하는 TTL 펄스)는 이온-전류 획득을 트리거(triggered)하고, 카운터 보드(National Instruments, PCI-6602) 상에 정확한 시간 스탬프를 생성하도록 사용되었다. ,카운터 보드는 250 KHz의 시계비를 갖는 RTSI 버스를 사용한 DAQ 보드에 내부적으로 동기화된다. 조합된 데이터 스트림(stream)은 따라서, CCD 프레임의 각각의 초기에 독특한 시간 스탬프를 포함하는데, 이온-전류 샘플링으로 동기화된다. 전좌 이벤트(event)가 이온 전류내의 드롭(drop)에 의해 검출되고, 소프트웨어(1396)가 카운터 정보내에서 대응되는 프레임 숫자를 서치하고 이러한 숫자에 대응되는 실제 영상이 보존된다. 카메라 프레임 비율은 대략 1 KHz(파이어 펄스 비율)에서 세팅된다
도 14a-c에 전기적 및 광학적 신호들의 동기화가 도시되었다. 함수 발생기에 의해 생성된 밀리세컨 길이의 전기적인 펄스들이 증폭기 헤드스테이지에 전기적으로 연결되었다. 이러한 전류 펄스들은 나노기공 신호들과 형태 및 시간스케일이 유사하다. 여기 레이저 빔이 동일한 신호를 사용하여 ON/OFF 모듈화되어 빛 및 전기적 펄스들의 동기화 소스를 제공하였다. 동기화 테스트를 위해, 형광 비드들이 멤브레인 상에 고정되었고 상술된 바와 같은 카메라를 사용하여 영상화되었다.
나노기공을 통한 DNA 전좌 동안에 두 개의 양식들이 조합되어 동시 광학 및 전기적 신호들의 동기화를 측정하였다. 기공 위치는 멤브레인 상에 최초로 식별되었다. 기공으로부터의 형광 신호는 정치 위치이고 전기적 신호로 인-싱크(in-sync) 광 업(lights up) 되었다; 따라서, 기공 위치에 대응되는 픽셀, 오버 타임, 가장 높은 형광 강도를 축척하고, 영상들의 합산은 CCD 상의 기공 위치에 대응되는 피크를 나타낸다. 일단, 기공 위치가 식별되면, 기공에 대응되는 픽셀로부터의 강도들은 추가의 데이터 분석을 위해 사용된다.
실시예
3
동시 광학 및 전기적 측정들이 4 nm 기공을 통한 형광물질-라벨링된 dsDNA 전좌를 검출하기 위해 수행되었다. 샘플 농도는 O.1 nM -0.2nM 이었다. 도 15a-15b에 기공 지오메트리, 예시적인 대략 4nm 기공의 TEM 영상이 개략적으로 도시되었다. Alexa647 형광물질들로 라벨링된 A 421 bp 프래그먼트(fragment)(DNA-A1647)가 중합효소 연쇄 반응 장치(PCR) 반응 동안 아민-개질된 티민 염기의 저 농도 통합에 의해 사용되었고 이어서 아민-활성 다이(dye)로 콘쥬게이트 되었다.
도 16a-16b에 도시된 바와 같이, 9 개의 이온 전류 및 이들의 대응되는 형광 강도 이벤트들이 DNA-A 1647 분자들이 기공의 시스 측면에 첨가된 이후에 도시되었다(4 nA 개방 기공 전류를 생성하는 200 mV 바이어스; 영상들은 최대 EM 게인(gain)으로 1ms 인테그레이션에서 얻어졌다). 나노기공 위치는 상술된 바와 같이 결정되었다. 도시된 형광 강도는 나노기공에서 중심이되는 CCD 상의 3X3 픽셀 영역으로부터 추출되었다. 전류 및 광학 데이터의 동기화 획득은 모든 이벤트에 대한 내부 배경 문턱값을 결정하는데 유용하다. 전기적 이벤트 이전에 기공 위치 대략 5 ms에서의 강도는 이벤트에 대한 배경값으로 사용되었다. 기공 위치에서 강도가 그것의 대응되는 배경보다 더 높은 적어도 하나의 표준 편차인 광학 이벤트만이 분석에 포함되어 이벤트가 스퓨리어스 신호들(spurious signals)을 제거하는 의미있는 배경 문턱값을 가지도록 보장하였다.
상술된 상세한 설명 및 후술되는 예시들은 단지 설명을 위한 것일 뿐 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 자명한 다양한 변경 및 유사한 배열이 의도된다. 또한, 설명 및 개시를 위해 식별된 모든 특허, 특허 출원 및 출판물들이 본원에 전체로서 참조되었는데, 예를 들어, 이러한 출판물에 개시된 방법론들은 본 발명에 연관되어 사용될 수 있다. 이러한 출판물들은 본 발명의 출원인 이전에 그것들의 개시가 단독으로 제공되었다. 이와 관련하여 어떤 것도 발명자들이 선행 발명 또는 어떠한 이유에 의해 이러한 개시를 예상한다는 것을 승인하는 것으로 이해되어서는 안된다. 이러한 문서들의 내용에 의한 날짜 또는 표현들에 대한 모든 진술들은 출원인에 가능한 정보에 기초하고 이러한 문서의 날짜들 또는 내용들을 단정하는 것을 승인하지 않는다.
Claims (71)
- 제 1의 측면 및 제 2의 대향 측면을 구비한 고체 상 멤브레인(solid state membrane);
멤브레인의 제 1의 측면 상에 위치된 제 1의 유체 챔버(fluid chamber)로서, 상기 제 1의 유체 챔버는 제 1의 굴절율을 갖는 제 1의 유체를 포함하는, 제 1의 유체 챔버; 및
멤브레인의 제 2의 측면 상에 위치된 제 2의 유체 챔버로서 상기 제 2의 유체 챔버는 제 2의 굴절율을 갖는 제 2의 유체를 포함하고, 상기 제 1의 굴절율은 제 2의 굴절율보다 높은, 제 2의 유체 챔버를 포함하는 광학 현미경 도구(optical microscopy tool)용 유체 셀(fluid cell).
- 제 1항에 있어서, 상기 고체 상 멤브레인은 실리콘 질화물을 포함하는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 고체 상 멤브레인은 단일 층 유전체(dielectric) 물질을 포함하는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 고체 상 멤브레인은 다중 층 유전체(dielectric) 물질을 포함하는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 고체 상 멤브레인은 실리콘 웨이퍼 상에 증착된 실리콘 질화물을 포함하는 유체 셀.
- 제 5항에 있어서, 상기 실리콘 질화물 층은 5-60nm 두께인 유체 셀.
- 제 5항에 있어서, 상기 실리콘 웨이퍼는 윈도우(window) 및 상기 윈도우를 덮는 실리콘 질화물 층을 포함하는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1의 유체는 수용성 버퍼 용액, 물 또는 요소를 포함하는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 2의 유체는 셀룰러(cellular) 유체, 세포 멤브레인, 글리세롤 및 CsCl로 이루어진 군으로부터 선택되는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1의 유체 및 제 2의 유체는 수용성 버퍼인 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 광학 생체표지자에 링크된 생체분자는 멤브레인의 제 2의 측면에 제공되는 유체 셀.
- 제 11항에 있어서, 상기 생체분자는 DNA 분자를 포함하는 유체 셀.
- 제 11항에 있어서, 상기 생체분자는 RNA 분자를 포함하는 유체 셀.
- 제 11항에 있어서, 상기 생체분자는 단백질 분자를 포함하는 유체 셀.
- 제 11항에 있어서, 상기 광학 생체표지자는 여기가능한 형광물질을 포함하는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1의 유체 챔버는 마이크로채널(microchannel)인 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 고체 상 멤브레인은 적어도 하나의 나노기공을 포함하는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 고체 상 멤브레인은 다수의 나노기공들을 포함하는 유체 셀.
- 제 1항에 있어서, 상기 고체 멤브레인은 적어도 하나의 나노슬릿을 포함하는 유체 셀.
- 제 17항에 있어서, 상기 유체 셀은 제 1의 유체 및 제 2의 유체를 가로질러 전위를 인가하도록 구성된 제 1 및 제 2의 전극들을 더 포함하여 생체분자가 나노기공을 통해 영상화되도록 구동시키는(drive) 유체 셀.
- 실리콘 웨이퍼의 윈도우를 덮는 고체 상 멤브레인, 고체 상 멤브레인의 일 측면 상의 제 1의 유체 챔버, 제 1의 유체 챔버 내에서 제 1의 굴절율을 갖는 제 1의 유체, 멤브레인의 다른 측면 상의 제 2의 유체 챔버 및 제 2 유체 챔버 내에서 제 1의 굴절율보다 더 작은 제 2의 굴절율을 갖는 제 2의 유체를 포함하는 유체 셀;
글래스 커버슬립(glass coverslip)으로서, 커버슬립 위에 유체 셀이 장착되어 글래스 커버슬립은 제 1의 유체 챔버의 하부 표면을 형성하는 글래스 커버슬립;
대물 렌즈;
TIRF 대물 및 글래스 커버슬립 사이의 침지 오일(immersion oil)
대물 렌즈에서 빛을 직접 향하도록(direct) 구성된 광원으로서, 대물 렌즈는 빛을 집속(focus)하도록 구성되어 고체 상 멤브레인을 덮는 윈도우보다 더 작은 이버네선트 조명 필드(field of evanescent illumination)가 생성되는 광원; 및
고체 상 멤브레인에서 단일 DNA 분자들에 의해 발광된 빛을 검출하는 영상 검출기를 포함하는 단일 DNA 분자를 영상화하기 위한 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 실리콘 질화물을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 실리콘 산화물을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 상기 고체 상 멤브레인은 실리콘 웨이퍼 상에 증착된 실리콘 질화물을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 24항에 있어서, 상기 실리콘 질화물 층은 5-60nm 두께인 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 상기 제 1의 유체는 수용성 버퍼 용액 또는 물을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 상기 제 2의 유체는 셀룰러(cellular) 유체, 세포 멤브레인 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 상기 광원은 여기 레이저 빔(excitation laser beam)을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 비오틴-스트렙트아비딘 화학이 고체 상 멤브레인 상에 단일 DNA 분자를 고정시키기 위해 사용되는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 단일 DNA 분자들은 광학 생체표지자들에 링크되는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 적어도 하나의 나노기공을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 다수의 나노기공을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 21항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 적어도 하나의 나노슬릿을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 31항에 있어서, 상기 광학 현미경 도구는 제 1의 유체 및 제 2의 유체를 가로질러 전위를 인가하도록 구성된 제 1 및 제 2의 전극들을 더 포함하여 생체분자가 나노기공을 통해 영상화되도록 구동시키는(drive) 광학 현미경 도구.
- 서로 다른 굴절율을 갖는 제 1의 유체와 제 2의 유체 사이의 고체 상 멤브레인에서 이버네선트 필드를 생성하기 위한 수단; 및
고체 상 멤브레인에서 단일 생체분자에 링크된 광학 검출기에 의해 발광된 빛을 검출하기 위한 수단을 포함하는 단일 생체분자를 영상화하기 위한 광학 현미경 도구.
- 제 35항에 있어서, 단일 바이오 분자는 DNA 분자를 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 35항에 있어서, 고체 상 멤브레인에서 이버네선트 조명 필드를 생성하기 위한 수단은 여기 레이저 및 대물 렌즈를 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 35항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 실리콘 웨이퍼 상에 증착된 실리콘 질화물 층을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 38항에 있어서, 상기 실리콘 질화물 층은 5-60nm 두께인 광학 현미경 도구.
- 제 39항에 있어서, 상기 실리콘 웨이퍼는 윈도우(window) 및 상기 윈도우를 덮는 실리콘 질화물 층을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 35항에 있어서, 상기 광학 현미경 도구는 고체 상 멤브레인 상에 단일 생체분자를 고정하기 위한 수단을 더 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 35항에 있어서, 이버네선트 조명 필드는 고체 상 멤브레인의 차수(dimensions)보다 더 작은 광학 현미경 도구.
- 제 35항에 있어서, 상기 광학 현미경 도구는 고체 상 멤브레인 내의 나노기공을 통해 적어도 하나의 단일 생체분자를 전좌(translocating)하기 위한 수단을 더 포함하는 광학 현미경 도구.
- 서로 다른 굴절율을 갖는 제 1의 유체와 제 2의 유체 사이의 고체 상 멤브레인에 이버네선트 조명 필드를 생성하는 단계; 및
고체 상 멤브레인에서 단일 생체분자에 링크된 광학 검출기에 의해 발광된 빛을 검출하는 단계를 포함하는 단일 생체분자를 영상화하기 위한 방법.
- 제 44항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 실리콘 웨이퍼상에 증착된 실리콘 질화물 층을 포함하는 방법.
- 제 45항에 있어서, 상기 실리콘 질화물 층은 5-60nm 두께인 방법.
- 제 45항에 있어서, 상기 실리콘 웨이퍼는 윈도우(window) 및 상기 윈도우를 덮는 실리콘 질화물 층을 포함하는 방법.
- 제 44항에 있어서, 상기 방법은 고체 상 멤브레인 상에 단일 생체분자를 고정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 44항에 있어서, 이버네선트 조명 필드는 고체 상 멤브레인의 차수(dimensions)보다 더 작은 방법.
- 제 44항에 있어서, 상기 방법은 고체 상 멤브레인 내의 나노기공을 통해 적어도 하나의 단일 생체분자를 전좌(translocating)하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 50항에 있어서, 적어도 하나의 단일 생체분자는 DNA 분자이고, 상기 방법이 DNA 분자를 DDP로 변환하는 단계; DDP를 광학 검출기에 의해 뉴클레오티드 A, T, U, C, 또는 G 로 표시되는 시퀀스 코드로 혼성화하는 단계;
나노기공을 통해 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드를 전기영동적으로 공급하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 광학 현미경 도구의 대물 렌즈로 빛을 직접 향하는 단계;
빛이 제 1의 유체를 직접 통과하는 단계;
실리콘 질화물 멤브레인에 빛을 반사시켜 제 2의 유체 내에 이버네선트 조명 필드를 생성하는 단계; 및
이버네선트 조명 필드에 의해 여기되고 단일 DNA 분자에 링크된 광학 생체표지자에 의해 발광된 빛이 영상 검출기로 직접 향하는 단계를 포함하는 단일 DNA 분자를 영상화하기 위한 방법.
- 제 52항에 있어서, 상기 제 1의 유체는 제 2의 유체의 굴절율보다 더 높은 굴절율을 갖는 방법.
- 제 52항에 있어서, 이버네선트 조명 필드는 제 2의 유체 내에 생성되는 방법.
- 제 52항에 있어서, 단일 DNA 분자는 실리콘 질화물 멤브레인 상에 고정되는 방법.
- 제 55항에 있어서, 단일 DNA 분자는 제 2의 유체 내의 실리콘 질화물 멤브레인 상에 고정되는 방법.
- 제 52항에 있어서, 상기 방법은 실리콘 질화물 멤브레인 내의 나노기공을 통해 단일 DNA 분자를 전좌하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 실리콘 웨이퍼의 윈도우를 덮는 고체 상 멤브레인, 고체 상 멤브레인의 일 측면 상의 제 1의 유체 챔버, 제 1의 유체 챔버 내에서 제 1의 굴절율을 갖는 제 1의 유체, 멤브레인의 다른 측면 상의 제 2의 유체 챔버 및 제 2 유체 챔버 내에서 제 1의 굴절율보다 더 작은 제 2의 굴절율을 갖는 제 2의 유체를 포함하는 유체 셀;
글래스 커버슬립(glass coverslip)으로서, 커버슬립 위에 유체 셀이 장착되어 글래스 커버슬립은 제 1의 유체 챔버의 하부 표면을 형성하는 글래스 커버슬립;
집속 렌즈(focusing lens);
집속 렌즈에서 빛을 직접 향하도록 구성된 광원으로, 상기 렌즈는 빛을 집속하도록 구성되어 고체 상 멤브레인을 덮는 윈도우보다 더 작은 이버네선트 조명 필드가 생성되는 광원;
제 2의 유체 챔버 위에 위치되고 고체 상 멤브레인에서 광학 생체표지자에 의해 발광된 빛을 집속하도록 구성된 대물 렌즈; 및
광학 생체표지자에 의해 발광된 빛을 검출하기 위한 영상 검출기를 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 실리콘 질화물을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 실리콘 산화물을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 상기 고체 상 멤브레인은 실리콘 웨이퍼 상에 증착된 실리콘 질화물을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 61항에 있어서, 상기 실리콘 질화물 층은 5-60nm 두께인 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 상기 제 1의 유체는 수용성 버퍼 용액 또는 물을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 상기 제 2의 유체는 셀룰러(cellular) 유체, 세포 멤브레인 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 상기 광원은 여기 레이저 빔(excitation laser beam)을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 비오틴-스트렙트아비딘 화학이 고체 상 멤브레인 상에 광학 생체표지자에 링크된 단일 DNA 분자를 고정시키기 위해 사용되는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 광학 생체표지자는 단일 DNA 분자에 링크되는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 적어도 하나의 나노기공을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 다수의 나노기공을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 58항에 있어서, 고체 상 멤브레인은 적어도 하나의 나노슬릿을 포함하는 광학 현미경 도구.
- 제 68항에 있어서, 상기 광학 현미경 도구는 제 1의 유체 및 제 2의 유체를 가로질러 전위를 인가하도록 구성된 제 1 및 제 2의 전극들을 더 포함하여 광학 생체표지자에 링크된(linked) 생체분자가 나노기공을 통해 영상화되도록 구동시키는(drive) 광학 현미경 도구.
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