CN1266283C - Dna单分子有序化测序方法 - Google Patents
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Abstract
一种DNA单分子有序化测序的方法，该方法包括下列步骤：(1)将DNA样品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技术将DNA单分子拉直并固定；(2)利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像；(3)利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”将DNA分子依次切隔成小片段；(4)利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”依次对DNA小片段进行拾取；(5)利用PCR技术分别对所分离的DNA分子进行扩增；(6)对扩增后的DNA样品进行测序。
Description
技术领域
本发明涉及DNA测序方法，特别是一种基于原子力显微镜纳米操纵的在单个DNA分子水平上进行有序化测序的方法。
背景技术
目前DNA测序方法大都以Sanger(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74：5463-55467)与Maxam和Gilbert(Maxam & Gilbert(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74：560-564)的方法为基础，在试剂和方法等方面加以改进和完善。多路测序(multiplexSequencing)、毛细管凝胶电泳和自动凝胶电泳技术的引进，使基于Sanger方法的测序效率大大提高。但这些方法都只能测定短的DNA片段，由此DNA首先内切酶或超声波随机打断成小片段，然后对每个片段的的碱基序列进行分析。很显然，DNA小片段在其原始位置信息的丧失导致了DNA序列测定是十分困难的。
也有一些与Sanger方法完全不同的新方法，如扫描探针显微术(Minne etal.(1998)Appl.Phys.Lett.72：2340-2342)、纳米孔(Vercoutere at al.(2001)Nature Biotechnol19：248；Deamer&Akeson.(2000)TIBTECH APRIL 18：147-151)、时间飞行质谱(Wu etal.(1994)Anal.Chem.66：1637-45)、焦磷酸检测分析(Ronaghi et al.(1996)Anal.Biochem.242：84-89；Ronaghi et al.(1996)Seience 281：363-365)、外切酶测序(Sauer etal.(1999)Phys.Chem.Chem.Phys.1：2472-77)、杂交测序(Service(1998)Science282：396-399&399-401)等。这些方法能较快速的对较少量的DNA样品进行测序，但在核苷酸的读出长度、分辨相邻核苷酸的鉴别能力以及操作的实用性上存在局限性。Marziali&Akeson(2001)Annu.Rev.Biomed.Eng3：195-223；Meldrum(2001)Science 292：515-517)。
在公知技术领域，有关AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”中，对于切割完的DNA片断进行拾取的操作技术的细节描述，请参见以下专利文献：专利申请号02110540.5，发明名称：构建纳米图形和纳米结构的操纵方法，发明人：胡钧；哈特曼；李民乾。
在公知技术领域，有关“分离单个分子”的操作技术，请参见以下现有技术文献：《Sortingsingle molecules：Application to diagnostics and evolutionary biotechnology》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，pp.5740-5747，June 1994)。
在公知技术领域，有关“分离后如何PCR放大”的操作技术，请参见以下现有技术文献：《分子克隆试验指南》(第三版)(科学出版社，2002)第8章内容(p597-p701)。
在公知技术领域，有关“如何测序”的操作技术，请参见以下现有技术文献：《分子克隆试验指南》(第三版)(科学出版社，2002)第12章内容(p981-p1073)。
发明内容
本发明的主要目的是克服上述已有方法的困难和局限，提供一种可对单个分子数量的样品进行较为简单快速地获得DNA序列的方法。
为了实现本发明的目的，本发明的技术解决方案是：一种DNA单分子有序化测序方法就是对DNA单分子按次序进行测序，本方法是通过分子梳技术将DNA分子拉直并固定在基底上，再利用原子力显微镜依次进行切割和分离DNA片段，然后进行PCR扩增和测序。
该方法包括下列步骤：
(1)将DNA样品溶液滴加在基底表面，利用分子梳技术将DNA单分子拉直并固定；
(2)利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像；
(3)利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”将DNA分子依次切割成小片段：
(4)利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”依次对DNA小片段进行分离；
(5)利用PCR技术分别对所分离的DNA分子进行扩增；
(6)对放大后的DNA样品进行测序。
所说的基底可以是云母，也可以是硅，也可以是化学修饰后云母。
所说的化学修饰后的云母，即新剥离的云母表面用0.5～1％的APTES水溶液处理2分钟，用双蒸水洗涤后，在80℃～200℃环境下烘烤1～4小时，然后放在干燥器中备用。
所说的DNA单分子可以为质粒DNA、基因组DNA、BAC、YAC、cDNA、染色体以及克隆了的或经PCR技术扩增得到的DNA片段，可以是各种方法制备的DNA片段包括机械打断的片段、直接提纯的片段。
所说的原子力显微镜探针可在空气、液体或真空环境中进行操作。
所说原子力显微镜的探针的针尖可以是针尖阵列，可以进行并行分离、拾取和测序。
附图说明
图1是DNA单分子有序化测序的流程示意图。
图2是利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”将拉直固定在云母表面的DNA分子依次切割形成小片段的AFM探测所获得的图像。
图3是利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”对切割制备的DNA分子片段进行分离前后的AFM探测结果。
具体实施方式
下面着重以λDNA分子为例来说明本发明的方法：
本发明对DNA分子进行有序化测序方法，包括下列步骤：
1、将DNA样品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技术将DNA单分子拉直并固定。
为了使DNA分子在基底表面的有适中的吸附力以同时满足AFM成像和可以分离的需要，我们采用了用0.5～1％的APTES水溶液处理基底2分钟，然后在80℃～200℃环境下烘烤的工程，最后用“分子梳”技术将DNA拉直固定在基底上(关于基底处理以适合于DNA拉直的要求，请参见我们的专利：胡钧，黄一波，张益，欧阳振乾，李民乾。一种用于DNA操纵的云母衬底的制造方法。发明专利，申请号：00116715.4，申请日：20000623)。
2、利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像。
3、利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”将DNA分子依次切割成小片段。
“逐线反馈纳米操纵技术”的具体过程为：先用AFM轻敲模式(tapping)扫描一条线，获得这条线的信息(力，或者它所转换成的高度)，然后对同一条线进行第二次触模式(comact)扫描时进行监视和调整(改变扫描力的大小)从而实现对这条线的操纵。整个成像和操纵过程不用退出AFM的反馈系统而连续进行。在实行“切割”的纳米操纵时，先获得一幅图像，选定感兴趣的区域；接下来，通过增加力来驱动AFM针尖与选定区域接触，从而利用AFM针尖的移动(来回移动的次数与所用力的大小有关)将DNA切断。这样的操纵可以获得很高的精确性，切割DNA时的空间精确度达到＜5nm，而这主要是受针尖尺度的限制。
4、利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”依次对DNA小片段进行分离。
利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”依次对DNA小片段进行分离的操作类似于步骤3中的“切割”工程，不同的是所用的力要小于切割时的域值，通常要小10nN(随针尖的不同而变化)，并且扫描过程要尽量小(比要分离的目标物体稍大即可)，然后执行二维扫描过程，在此扫描过程中通过改变探针针尖对样品分子所施力的大小，克服基底对样品的吸附使样品转移吸附到针尖上，从而完成DNA小片段的分离。
5、利用PCR技术分别对所分离的DNA分子进行放大。
6、对放大后的DNA样品进行测序。
下面再具体详细地DNA单分子有序化测序的方法。
1、基底的选择与处理
采用了硅烷化的云母作为基底。新剥离的云母表面用0.5-1％的3-氨基丙三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane，APTES)水溶液处理，时间为2分钟。处理过的APTES-云母表面用双蒸水洗涤后，在80℃～200℃环境下烘烤1～4小时(优选120℃干燥2小时)，然后放在干燥器中备用。
2、DNA样品准备和拉直操纵
λDNA购自Sigma公司(美国)；DNA用TE缓冲液(40mM tris-Hcl，1mM EDTA)稀释至1～5ng/μl，取4μl上述DNA溶液滴于洁净的盖玻片一端，接下来用“分子梳”将DNA拉直。具体做法是，首先将该盖玻片反转，先使带有溶液的一端轻轻地接触处理好的APTES-云母表面，然后慢慢地将整个盖玻片盖在云母表面上，在此过程中，水流弯液面将溶液中的DNA拉直，APTES对DNA的吸附力使DNA得以固定在基底上。样品表面在空气或液氮中干燥后，用AFM进行探测和操纵。
2、DNA单分子的AFM成像、切割与分离
DNA单分子的AFM成像、切割与分离都是在NANOScope IIIa AFM系统(DigitalInstrument，美国)上完成的。扫描头为E或J型。AFM针尖为硅针尖(Silicon-MDT Ltd.，俄罗斯)或Force modulation针尖(Digital Instrument，美国)。成像时，采用AFM轻敲模式(tappingmode)，在相对湿度为30～40％下的大气条件下获取。切割和分离工程都是通过“逐线反馈纳米操纵技术”完成的。两种不同的是，切割时的AFM针尖在一维方向上来回移动，且用的力较大；而分离DNA小片段时，AFM针尖在二维方向上运动，用的力也比切割时要小。
对其他DNA也可以采用上述基于原子力显微镜纳米操纵的方法进行单分子有序化测序，在此不在赘述。
Claims (7)
1、一种DNA单分子有序化测序的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)将DNA样品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技术将DNA单分子拉直并固定；
(2)利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像；
(3)利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”将DNA分子依次切割成小片段；
(4)利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”依次对DNA小片段进行分离；
(5)利用PCR技术分别对所分离到的DNA分子进行扩增；
(6)对扩增后的DNA样品进行测序。
2、根据权利要求1所述的DNA单分子有序化测序方法，其特征在于所说的基底是云母或硅或化学修饰后云母或平整的玻璃表面。
3、根据权利要求2所述的DNA单分子有序化测序方法，其特征在于所说的化学修饰后的云母，即新剥离的云母表面用0.5～1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)水溶液处理2分钟，用双蒸水洗涤后，在80℃～200℃环境下烘烤1～4小时，然后放在干燥器中备用。
4、根据权利要求1所述的DNA单分子有序化测序方法，其特征在于所说的DNA单分子为质粒DNA、基因组DNA、BAC、YAC、cDNA、染色体以及克隆了的或经PCR技术扩增得到的DNA片段。
5、根据权利要求4所述的DNA单分子有序化测序方法，其特征在于所说的DNA单分子还包括经机械打断或直接提纯制备得到的DNA片段。
6、根据权利要求1所述的DNA单分子有序化测序方法，其特征在于所说原子力显微镜探针在空气、液体或真空环境中进行操作。
7、根据权利要求1所述的DNA单分子有序化测序方法，其特征在于所述的AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”中，所说原子力显微镜的探针的针尖是针尖阵列，且进行并行分离、拾取和测序。
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