CN1431316A - 构建纳米图形和纳米结构的操纵方法 - Google Patents

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Abstract

一种构建纳米图形和纳米结构的操纵方法，该方法包括下列步骤：(1)用3－氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理基底表面，形成APTES基底表面；(2)APTES基底表面在高温下退火；(3)将生物大分子样品溶液滴加在APTES基底表面，利用二维分子梳技术将样品分子拉直，在APTES基底表面形成样品分子网络；(4)利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像；(5)根据纳米图形和纳米结构设计，对选定的样品分子图形进行选位；(6)用“逐线反馈纳米操纵技术”对样品分子进行纳米操纵，即利用原子力显微镜的探针对同一条线进行第二次扫描时，借助探针针尖对样品分子施力大小而进行切割或推的操纵，经过多次操纵获得由生物大分子构成的纳米图形和纳米结构。

Description

构建纳米图形和纳米结构的操纵方法
技术领域
本发明涉及线性生物大分子，特别是一种在固体表面利用“分子梳”和原子力显微镜操纵线性生物大分子构建纳米图形和纳米结构的操纵方法。
背景技术
Di Mauro和Hollenberg(E.Di Mauro and C.P.Hollenberg.Adv.Mater.1993，5：384)曾提出通过多聚核苷酸作为起始点进行在位的DNA合成或杂交来实现在固体支持物的上构建DNA网络的策略，但这由于需要复杂的合成过程和一些持别的要求，其难度是可想而知的。另一种策略希望利用新近发展的纳米操纵技术将DNA分子排布成所预期的图形，并且已经利用扫描隧道探针显微镜(scanning tunneling microscope，STM)或原子力显微镜(atomic force nicroscope，AFM)实现了原子和小分子在固体表面的人工图形的排布(D.M.Eigler，E.K.Schweizer.Positioning single atomswith a scanning tunneling microscope.Nature 1990，344：524-526)，但操纵生物大分子目前还是不现实的。对DNA来说，仅仅通过SPM针尖就想使得这种柔软的线性分子从它的自由蜷曲的自然状态转变为规则的结构是难以实现的。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是克服上述已有技术的困难，提供一种构建纳米图形和纳米结构的操纵方法，对生物线形大分子的操纵并形成纳米图形纳米结构。
本发明的技术解决方案，概略地说，本发明构建纳米图形和纳米结构的操纵方法就是采用宏观操纵和纳米操纵相结合的方法，简单地说，就是通过宏观操纵将生物大分子拉直并构成二维网络，再利用原子力显微镜进行纳米操纵，进行切割、推的操纵，构成纳米图形和纳米结构。
具体地说：一种构建纳米图形和纳米结构的操作方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理基底表面，形成APTES基底表面；
(2)APTES基底表面在高温下退火；
(3)将生物大分子样品溶液滴加在APTES基底表面，利用二维分子梳技术将样品分子拉直，在APTES基底表面形成样品分子网络；
(4)利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像；
(5)根据纳米图形和纳米结构设计，对选定的样品分子图形进行选位；
(6)用“逐线反馈纳米操纵技术”对样品分子进行纳米操纵，即利用原子力显微镜的探针对同一条线进行第二次扫描时，借助探针针尖对样品分子施力大小进行切割或推的操纵，经过多次操纵获得由生物大分子构成的纳米图形和纳米结构
所说的基底可以是云母，也可以是硅。
所说的基底为云母，即新剥离的云母表面用0.5～1％的APTES水溶液处理2分钟，用双蒸水洗涤后，在80℃～200℃环境下烘烤1～4小时，然后放在干燥器中备用。
所说生物大分子样品可以为DNA、RNA、蛋白质、蛋白质和DNA复合物或其他复合物。
所说的原子力显微镜的探针可对处于液体或真空环境的样品进行操纵。
附图说明
图1是利用“分子梳“对在基底表面的DNA溶液操纵形成DNA网络的示意图。
图2是利用原子力显微镜切割DNA分子操纵示意图。
图3是利用旋转离心力将DNA分子拉直的装置及过程示意图。
图4是DNA分子在云母表面形成一条条直线的原子力显微镜探测结果-DNA线AFM图像。
图5是DNA网络用原子力显微镜探测所获得的图像。
图6是应用纳米操纵技术形成纳米图形过程的AFM图像。
图7是利用纳米操纵技术构建的DNA文字图形的AFM图像。
图8是利用纳米操纵技术形成DNA纳米结构过程的AFM图像。
图9是利用纳米操纵技术形成纳米级波浪结构的AFM图像。
图10是对蛋白质进行纳米切割的AFM图像。
具体实施方式
下面着重以DNA分子为例来说明本发明的方法。
本发明利用DNA样品构建纳米图形和纳米结构的操纵方法，包括下列步骤：
1、用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理基底表面，形成APTES基底表面；
为了在固态表面即基底表面构建稳定的、精确的DNA图形，基底必须满足两个要求。首先，在大气、水或真空环境下DNA分子能在其表面吸附。吸附力要适当，从而使得DNA链能被AFM针尖移动。第二，基底必须很稳定，而且在AFM针尖的纳米操纵过程对它也不能产生严重的破坏。为达到这些目的，我们采用了可控的方法来修饰一个固态基底，例如云母或硅。3-氨基丙基-三乙氧基硅氧烷(APTES)被用来处理云母或硅的表面。然后，APTES处理过的表面须进行一个退火的过程，从而控制其对DNA分子的吸附能力。(关于基底处理以适合于DNA拉直的要求，请参见我们的专利：胡钧，黄一波，张益 ，欧阳振乾，李民乾。一种用于DNA操纵的云母衬底的制造方法。发明专利，申请号：00116715.4，申请日：20000623)；
2、APTES基底表面在高温下退火，例如，云母基底，即新剥离的云母表面用0.5～1％的APTES水溶液处理2分钟，用双蒸水洗涤后，在80℃-200℃环境下烘烤1-4小时，然后放在干燥器中备用；
3、将DNA溶液滴加在APTES基底表面利用二维分子梳技术将DNA分子拉直，形成DNA网络。
分子梳技术在固体表面拉直DNA其拉伸方向可以控制。因此经过几次分子梳操纵，就可以在表面形成DNA网络。通过对DNA溶液的浓度调整，网格尺寸可以被控制在纳米水平。具体见图1；
4、利用原子力显微镜(AFM)对DNA分子进行成像；
5、根据所需构建的纳米图形和纳米结构设计，对选定的DNA图形进行选位；
6、利用AFM的逐线反馈纳米操纵技术对DNA分子进行纳米操纵。
通常的纳米操纵的过程为：首先，为了获得一幅图像，选定感兴趣的区域；接下来，通过增加力来驱动AFM针尖与选定区域接触，从而利用AFM针尖的移动进行不同的纳米操纵。我们的“逐线反馈纳米操纵”的具体过程就是先用AFM轻敲模式(tapping)扫描一条线，获得这条线的信息(力，或者它所转换成的高度)，然后对同一条线进行第二次接触模式(Contact)扫描时实现对这条线的操纵(见图2)。Tapping模式成像时的力非常小，对样品造成的破坏比接触模式(Contact)要小得多。另外，“逐线反馈纳米操纵”技术的优点是，纳米操纵可以在一条扫描线后进行监视和调整。这样的操纵可以获得很高的精确性，切割DNA时的空间精确度达到＜5nm，而这主要是受针尖尺度的限制。而且整个成像和操纵过程不用退出AFM的反馈系统而连续进行。利用“逐线反馈纳米操纵”技术不仅可以实行纳米“切割”，还可以进行纳米的“推”操纵。在“推”操纵时，操作类似于“切割”，但力要小于切割时的域值，通常要小10nN(随针尖的不同而变化)。这样，扫描区域内吸附在表面的物质将被AFM针尖清除掉，留下来的则是我们所需要的DNA图形，从而完成了纳米图形的构建。另外，“推”的操作还可以诱导基底上的DNA分子形成纳米颗粒和纳米棒。
下面再举例说明各种纳米图形和纳米结构的操纵。
实施例1 DNA线
基底的处理：采用了硅烷化的云母作为基底。即新剥离的云母表面用0.5-1％的3-氨基丙基-三乙氧基硅氧烷(3-aminopropyl triethanoxysilane，APTES)水溶液处理，时间为2分钟。处理过的APTES-云母表面用双蒸水洗涤后，在120℃干燥几个小时，然后放置在干燥器中备用。
DNA样品准备和拉直操纵。λDNA购自Sigma公司(美国)；DNA用TE缓冲液(例如40mM Tris-HCl，1mM EDTA)稀释至1～5ng/μl，取4μl上述DNA溶液滴加在处理好的APTES-云母表面，然后将带DNA溶液的APTES-云母放置于一个旋转装置上(Yi Zhang，Qihua Xiong，Bin Li，Shitao Lou，Zhenqian Ouyang，Jun Hu，Minqian Li.Stretching DNA molecules with acentrifugal method and imaging with Atomic Force Microscope.ProbeMicroscopy 2000，Vol.2，No.1，31-36；如图3所示)。进行拉直操纵时，旋转装置的转速(ω)控制在200～300rpm，而液滴中心离转轴的距离为2cm。在这样的转速下，DNA液滴在APTES-云母表面移动的平均速度大约为1cm/s。DNA溶液从APTES-云母表面被甩掉后，样品表面立即在空气中干燥，然后进行AFM探测。
APTES-云母表面的样品由NaNoScope IIIa AFM系统(Digital Instrument，美国)成像。采用轻敲模式AFM成像，扫描头为E或J型。AFM针尖为硅针尖(Silicn-MDT Ltd.，俄罗斯)。所有的图像均在大气条件下获取，相对湿度控制为30～40％。
AFM探测的结果显示DNA在云母表面形成了一条条的直线(见图4)。AFM图像扫描范围为7μm×7μm。
实施例2 DNA网格
如实施例1所述可以将DNA在一个方向拉直成DNA线，在这个基础上，重复这个过程，但将第二次拉直DNA的方向让其与第一次相垂直(也可成任意角度)，即形成DNA二维网格。如图5所示。扫描范围2.7μm×2.7μm
实施例3  对DNA网络进行切割和“推”的操纵形成DNA方格
利用我们的“逐线反馈纳米操纵”技术，可以对DNA网格进行切割和“推”的操纵形成DNA方格。实验中，我们用NaNoScope IIIa AFM系统(DI公司)进行成像和DNA分子的操纵，采用J型扫描头和Force modulation针尖(DI公司)。DNA分子在APTES-云母表面的排布如实施例2所述。图6中一系列的图像显示了一个由DNA分子构成的方格形成的全过程。我们先选定这个位置(图6a)，然后利用纳米“切割”技术将选定部位的DNA链切断(图6b)，再将所切断的、不需要的DNA用纳米“推”的技术清理出这个区域(图6c)，就解决了这个部位的工作；其它几个部位也可以照此操作(图6d，e，f)。最后，就形成了一个DNA方格。这个方格可以是构成更复杂结构的基础。
AFM图像扫描范围：a，c，d，e，f各为800nm×800nm；b为300nm×300nm。
实施例4  用DNA分子书写D，N，A字母
在用实施例1所述方法形成一个二维DNA网络的基础上，采用实施例3中的类似技术，用AFM针尖进行纳米操纵，可以用DNA书写人类的文字。见图7。其中三个字母“DNA”分别由三幅AFM图像拼合而成，扫描范围为500nm×500nm。
实施例5  纳米颗粒和纳米棒
采用实施例3中的“推”操纵技术，可将纳米切割后获得的DNA片段，用针尖诱导折叠为纳米颗粒和纳米棒，如图8所示。AFM图像扫描范围为300nm×300nm。
利用纳米操纵技术形成DNA纳米结构过程如下：
a、DNA首先被切断；
b、从断点开始，DNA链被针尖推着形成纳米颗粒；
c、继续用AFM针尖操纵，则形成纳米DNA“棒”；
d、继续推则形成较长的DNA“棒”；
e、DNA“棒”还似乎有比较规则的结构。
AFM图像的扫描范围均为：300nm×300nm。
实施例6   DNA的纳米级的波浪形结构
用“逐线反馈纳米操纵”技术还可以形成DNA的纳米级波浪形结构。切断DNA链的力有一个域值，而这个域值随不同的针尖而不同，大约在20nN～100nN间变化。在小于域值的情况下，DNA链可以不被针尖切断而被弯曲成波浪形结构，如图9所示，有意思的是，DNA被针尖拉弯后并没有缩回来而是吸附在那里。这可能是由于DNA链被过度拉伸而失去了弹性的缘故，也有可能是那部分DNA分子被牢牢吸附在固体表面而不能回复了。我们认为，这种基于AFM针尖的纳米操纵非常重要，因为可以构成极其复杂的DNA图形，而这要通过宏观操纵(二维DNA网络)和纳米操纵的结合才能达到的。
AFM图像的扫描范围为500nm×500nm。
实施例7  对蛋白质进行纳米切割
利用“逐线反馈纳米操纵”技术同样可以对蛋白质线性大分子进行切割。图10是我们利用该技术对α-synuclein蛋白质积聚纤维切割后的结果。其中扫描范围是α为400nm×400nm，b为700nm×700nm。
对其他线性生物大分子也可以采用上述宏观操纵和纳米操纵相结合的方法来构建所需要的纳米图形和纳米结构，在此不再赘述。

Claims (5)

1、一种构建纳米图形和纳米结构的操作方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理基底表面，形成APTES基底表面；
(2)APTES基底表面在高温下退火；
(3)将生物大分子样品溶液滴加在APTES基底表面，利用二维分子梳技术将样品分子拉直，在APTES基底表面形成样品分子网络；
(4)利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像；
(5)根据纳米图形和纳米结构设计，对选定的样品分子图形进行选位；
(6)用“逐线反馈纳米操纵技术”对样品分子进行纳米操纵，即利用原子力显微镜的探针对同一条线进行第二次扫描时，借助探针针尖对样品分子施力大小而进行切割或推的操纵，经过多次操纵获得由生物大分子构成的纳米图形或纳米结构。
2、根据权利要求1所述的构建纳米图形和纳米结构的操纵方法，其特征在于所说的基底可以是云母，也可以是硅。
3、根据权利要求1所述的构建纳米图形和纳米结构的操纵方法，其特征在于所说的基底为云母，即新剥离的云母表面用0.5～1％的APTES水溶液处理2分钟，用双蒸水洗涤后，在80℃～200℃环境下烘烤1～4小时，然后放在干燥器中备用。
4、根据权利要求1所述的构建纳米图形和纳米结构的操纵方法，其特征在于所说生物大分子样品可以为DNA、RNA、蛋白质、蛋白质和DNA复合物或其他复合物。
5、根据权利要求1或2或3或4所述的构建纳米图形和纳米结构的操纵方法，其特征在于所说的原子力显微镜的探针可对处于液体或真空环境的样品进行操纵。
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