CN1238370C - 单个生物大分子的分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种单个生物大分子的分离方法,该方法包括以下步骤:①将生物大分子样品溶液滴加在原子级平整的基底表面;②利用原子力显微镜对样品分子进行成像;③在适当的区域选定单个样品;④用原子力显微镜的“逐线反馈纳米操纵”技术对样品分子进行“推”的纳米操纵,通过改变探针针尖对样品分子所施力的大小使样品吸附在针尖上,从而实现单个生物大分子的定位分离。
Description
技术领域
本发明涉及一种各种生物大分子的分离方法,特别是一种基于原子力显微镜纳米操纵技术在固体表面分离单个生物大分子的方法。
背景技术
生命科学和生物技术的迅猛发展需要更加高效、可靠的生物大分子分离纯化方法。目前最常用的凝胶电泳和层析方法需要较多的生物样品分子,且费时和难以自动化。新近发展起来的基于微制造(microfabricated)的各种分离设备(Hou-Puchou,Charles Spence,Axel Scherer,And Stephen Quake.Amicrofabricated device for sizing and sorting DNA molecules.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96:11-13;Chia-Fu Chou,Robert H.Austin,Olgica Bakajin,et al.Sorting biomolecules with microdevices.Electrophoresis,2000,21:81-90;J.Han,H.G.Craighead.Separation of longDNA molecules in a microfabricated entropic trap array.Science,2000,288:1025-1029),虽然可以较快速地对较少量的样品进行分离,但对单个生物大分子的分离仍然是比较困难的,并且不能够定位分离。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是克服上述已有技术的局限,提供一种可对单个生物大分子进行分离的方法。
本发明的技术解决方案,概括地说,本发明单个生物大分子的分离方法就是采用纳米操纵技术分离单个生物大分子的方法。具体地说:一种分离单个生物大分子的方法,其特征在于该方法包括下列步骤:
(1)将生物大分子样品溶液滴加在原子级平整的基底表面;
(2)利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像;
(3)在适当的区域选定单个样品;
(4)用原子力显微镜的“逐线反馈纳米操纵技术”对样品分子进行“推”的操纵纳米操纵,通过改变探针针尖对样品分子所施力的大小使样品粘着在探针上,从而实现单个生物大分子的分离。
所说的基底可以是云母,也可以是硅,也可以是化学修饰后的基底。
其中化学修饰后的基底为将新剥离的云母或硅表面用0.5~1%(重量)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane,APTES)水溶液处理2-5分钟,用双蒸水洗涤后,在80℃~200℃环境下烘烤1~4小时。
该适当区域为只有一个样品,且在其周围一定距离内没有其他样品存在的区域。
所说的原子力显微镜的探针的针尖可以经过修饰或不经修饰。
所说原子力显微镜的探针的针尖为单个,也可以是针尖阵列,从而可以进行并行分离。
所说的原子力显微镜的探针可对处于空气、液体或真空环境的样品进行分离。
所说的生物大分子可以为DNA、RNA、蛋白质、蛋白质与DNA的复合物或其他复合物和聚集物。
本发明的积极进步效果在于:本发明能够对单个生物大分子进行分离,且能进行定位分离。
附图说明
图1是利用原子力显微镜探针分离DNA片段的过程示意图。
图2是利用原子力显微镜探针分离DNA片段具体过程的原子力显微镜探测结果示意图:a为固定在基底上拉直的DNA分子;b为切割有1、2、3小片段的上述DNA;c为分离小片段3后余留的DNA片段;d为再分离小片段1后余留的DNA片段;e为继之分离小片段2后残留的DNA片段。
具体实施方式
结合图1、2所示,下面着重以DNA分子为例来说明本发明的方法。
本发明利用原子力显微镜纳米操纵技术分离单个生物大分子的方法,包括下列步骤:
1、将生物大分子样品溶液滴加在原子级平整的基底表面。
为了使生物大分子在基底表面的有适中的吸附力以同时满足AFM成像和可以分离的需要,必须根据生物大分子本身的性质选择适当的基底或对基底进行适当的处理。为达到分离DNA的目的,我们选用了云母或硅作为固态基底,或采用硅烷化的云母或硅作为基底,即将新剥离的云母或硅用0.5~1%的APTES来处理其表面,时间为2~5分钟,处理过的APTES一云母/硅表面用双蒸水洗涤后,然后在80℃~200℃环境下烘烤1~4小时以控制基底对DNA分子的吸附能力,然后放置于干燥器中备用。(具体操作步骤,请参见我们的专利:胡钧,黄一波,张益,欧阳振乾,李民乾。一种用于DNA操纵的云母衬底的制造方法。发明专利,申请号:00116715.4,申请日:20000623)。
2、用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像。
首先进行DNA样品准备和拉直操纵,λDNA购自Sigma公司(美国),DNA用TE缓冲液(40mM tris-Hcl,1mM EDTA)稀释至1~5ng/μ1,取4μl上述DNA溶液滴加于洁净的盖玻片一端,接下来用“分子疏”将DNA拉直。具体做法是,首先将该盖玻片反转,先使带有溶液的一端轻轻地接触处理好的APTES一云母或APTES-硅表面,然后慢慢地将整个盖玻片盖在云母或硅表面上,在此过程中,水流弯液面将溶液中的DNA拉直,APTES对DNA的吸附力使DNA得以固定在基底上。样品表面在空气或液氮中干燥后,用AFM进行探测和操纵。成像时,采用AFM轻敲模式(tapping mode),在相对湿度为30~40%下的大气条件下获取。
3、在适当的区域选定单个样品。
为了更有效的分离样品,最好是选择那些在基底上只有一个样品,且在其周围一定距离内没有其他样品存在的区域。选定样品后,将其定位在尽可能小的区域内的中心位置,然后执行分离过程。
4、用原子力显微镜的“逐线反馈纳米操纵技术”(Jun Hu,Yi Zhang,Haibin Gao,Minqian Li,Uwe Hartmann.Artificial DNA patterns by Mechanicalnanomanipulation.Nano Letters,2(1):55-57.2002)对样品分子进行“推”的操纵纳米操纵,通过改变探针针尖对样品分子所施力的大小使样品粘着在探针针尖上,从而实现单个生物大分子的分离。
“逐线反馈纳米操纵”技术的具体过程为:先用AFM轻敲模式(tapping)扫描一条线,获得这条线的信息(力,或者它所转换成的高度),然后对同一条线进行第二次接触模式(contact)扫描时进行监视和调整(改变扫描力的大小)从而实现对这条线的操纵。整个成像和操纵过程不用退出AFM的反馈系统而连续进行。这样的操纵可以获得很高的精确性,切割DNA时的空间精确度达到<5nm,而这主要是受探针尺度的限制。在实行“切割”的纳米操纵时,获得一幅图像,选定感兴趣的区域;接下来,通过增加力来驱动AFM探针与选定区域接触,从而利用AFM探针的移动(有时需要来回多次)将DNA切断。对DNA小片段进行分离的操作类似于“逐线反馈纳米操纵”技术中的“切割”过程,不同的是所用的力要小于切割时的域值,通常要小于10nN(随探针的不同而变化),并且扫描的区域要尽量小(比要分离的目标物体稍大即可),然后执行二维扫描过程,在此扫描过程中通过改变探针针尖对样品分子所施力的大小,克服基底对样品的吸附使样品转移吸附到探针针尖上,从而完成DNA小片段的分离。切割与分离两者不同的是,切割时的AFM探针在一维方向上来回移动,且用的力较大;而分离DNA小片段时,AFM探针在二维方向上运动,用的力也比切割时要小。
DNA单分子的AFM成像、切割与分离都是在NANOScope IIIa AFM系统(Digital Instrument,美国)上完成的,其可在空气、液体或真空环境下进行。扫描头为E或J型。AFM探针为硅探针(Silicon-MDT Ltd.,俄罗斯)或Forcemodulation探针(Digital Instrument,美国)。
本实施例中原子力显微镜的探针的针尖可为单个,也可以是针尖阵列,从而可以进行并行分离。
对其他单个生物大分子如RNA、蛋白质、蛋白质与DNA的复合物或其他复合物和聚集物也可以采用上述基于原子力显微镜的纳米操纵的方法得以分离,在此不再赘述。
Claims (8)
1、一种单个生物大分子的分离方法,其特征在于该方法包括下列步骤:
(1)将生物大分子样品溶液滴加在原子级平整的基底表面;
(2)利用原子力显微镜对样品分子进行成像;
(3)在适当的区域选定单个样品;
(4)用原子力显微镜的“逐线反馈纳米操纵技术”对样品分子进行“推”的纳米操纵,通过改变探针针尖对样品分子所施力的大小使样品粘着在针尖上,从而实现单个生物大分子的分离。
2、根据权利要求1所述的单个生物大分子的分离方法,其特征在于该基底为云母、硅或化学修饰后基底。
3、根据权利要求2所述的单个生物大分子的分离方法,其特征在于该化学修饰后基底为将新剥离的云母或硅表面用0.5-1%的APTES水溶液处理2-5分钟,用双蒸水洗涤后,在80℃-200℃环境下烘烤1-4小时。
4、根据权利要求1所述的单个生物大分子的分离方法,其特征在于该适当区域为只有一个样品,且在其周围一定距离内没有其他样品存在的区域。
5、根据权利要求1所述的单个生物大分子的分离方法,其特征在于该原子力显微镜的探针的针尖为经过修饰的或不经修饰的。
6、根据权利要求1所述的单个生物大分子的分离方法,其特征在于该原子力显微镜的探针的针尖为单个或针尖阵列。
7、根据权利要求1所述的单个生物大分子的分离方法,其特征在于该原子力显微镜的探针的分离样品为处于空气、液体或真空环境的样品。
8、根据权利要求1-7任一权利要求所述的单个生物大分子的分离方法,其特征在于该生物大分子为DNA、RNA、蛋白质、蛋白质与DNA的复合物或聚集物。
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