CN101221148B - 基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法 - Google Patents
基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101221148B CN101221148B CN2008100330006A CN200810033000A CN101221148B CN 101221148 B CN101221148 B CN 101221148B CN 2008100330006 A CN2008100330006 A CN 2008100330006A CN 200810033000 A CN200810033000 A CN 200810033000A CN 101221148 B CN101221148 B CN 101221148B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- collaurum
- order
- dna
- sequencing quality
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种生物工程技术领域的基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法。本发明通过在上样过程中将胶体金添加到样品或上样缓冲液中，一方面胶体金粒子与单链DNA分子结合，富集DNA分子且增加DNA移动的速度，另一方面，胶体金粒子在毛细管中的聚合物网络中形成交链点，从而增强了分离的有效性。所述胶体金，其粒径为5nm～60nm，用量为0.001nmol/L～1nmol/L。本发明具有优化电泳的显著效果，制备简单，应用广泛等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域的用于电泳的样品制备方法，特别是一种基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法。
背景技术
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。已经被广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。电泳的分辨率是最重要的指标之一。
毛细管电泳技术，又称高效毛细管电泳或毛细管分离法，是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术。其基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，以两个电解槽和与之相连的内径为20～100μm的毛细管为工具，其内填充有交联的聚丙烯酰胺凝胶或聚二甲基丙烯酰胺、线性聚丙烯酰胺、聚环氧乙烯等聚合物作为分离介质。
基于毛细管电泳原理的测序仪是一种重要的DNA分析手段，常规的测序仪一般每次读取DNA序列的长度为500个碱基(nt)左右，并且对复杂序列(如GC重复序列，单串联序列等)往往测序质量很差，得到的序列很短，甚至根本得不到有效结果。如何提高测序的长度以及测序的质量不仅决定了测序的成败，而且直接关系到测序成本的高低。
近年来，在毛细管电泳中的分离介质中加入各种添加剂以改善其筛分能力、粘度和自涂敷功能是最常用且非常有效的手段。
经对现有技术的文献检索发现，Zhou等在《Electrophoresis》(电泳)(2007年28期1072-1080页)上发表的“Novel quasi-interpenetrating network/glodnanoparticles composite matrices for DNA sequencing by CE”(用于毛细管电泳DNA测序的新型准互穿聚合物网络/金纳米粒子复合介质)，该文中提出含有胶体金粒子的溶液作为分离介质来分离DNA片段和测序，具体方法为：将具有自涂敷功能的准互穿聚合物网络与胶体金混合，得到准互穿聚合物网络/金纳米粒子复合介质，来分离DNA片段和测序，具有快速，分离能力高，重复性好等特点。其不足在于：要经过复杂的化学方法将胶体金粒子引入到用于DNA分离的聚合物中制备复合介质，还要将其事先装如毛细管中。不仅制备过程复杂，而且在使用过程中不能根据使用目的进行调整和改变。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法。本发明可以提高电泳的分辨率和毛细管电泳测序质量与有效测序长度。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在上样过程中在样品或上样缓冲液中添加胶体金，一方面，胶体金粒子可与单链DNA分子结合，不仅可以富集DNA分子，而且可以增加DNA移动的速度；另一方面，胶体金粒子在毛细管中的聚合物网络中形成交链点，从而增强了分离的有效性。通过使用不同直径和浓度的胶体金使有效测序长度和质量达到最佳。
所述胶体金，其粒径为5nm～60nm，用量为0.001nmol/L～1nmol/L。
所述胶体金，其粒径为10nm时，用量为0.1nmol/L～1nmol/L。
所述胶体金，其粒径为20nm时，用量为0.03～0.4nmol/L。
所述胶体金，其粒径为30nm～60nm时，用量范围为0.001nmol/L～0.03nmol/L。
所述的胶体金，可以是商业购买的，也可以是自行制备的，制备可以有多种方法，如白磷还原法、柠檬酸纳还原法、柠檬酸纳-鞣酸还原法都可用于制备胶体金。例如参照Freas在1973年创立的柠檬酸三纳还原法，先将0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1％柠檬酸三纳水溶液，开始是蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色即可，所有溶液采用灭菌后纯水配置。对粒径大小没有限制，使用前不需稀释。
本发明积极进步的效果在于：本发明使用简单，应用广泛，对电泳有显著增效效果等优点。具体表现在，1)与目前所使用的将胶体金制备成复合介质的方法相比，本发明的方法极为简单，使用方便，可根据实际需要使用不同大小和/或浓度的金纳米颗粒以实现不同的测序目的；2)本发明可以应用于任意厂家和型号的测序仪上，并且提高测序长度为100～1000nt，从而可降低测序价格20％以上。3)本发明可以明显改善富含GC等DNA复杂序列的测序效果。
附图说明
图1在上样样品中加入10nm胶体金(终浓度为0.34nmol/L)后的DNA测序图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面以在毛细管电泳(DNA测序仪)为例来说明本发明的方法与效果。
实施例1
1)按常规方法制备测序模板与测序反应以及其它上样前的准备；
2)每一样品加入上样缓冲液8μL，分别加入终浓度为0.34nmol/L，粒径为10nm的胶体金溶液(Sigma公司)，用普通膜封口，离心，将上样缓冲液和胶体金溶液甩至管底，则在加样孔中的样品为待测序样品、上样缓冲液和胶体金的混合物。然后将样品放进MegaBACE DNA测序仪中进行测序。
3)以测序软件输出测序图谱并对有效测序长度和测序质量进行打分评价，如图1所示，加入胶体金的样品有效测序长度为740nt(测序仪给出的测序图读长为755nt)，测序质量评分98分。而不加胶体金样品的有效测序长度为55nt(测序仪给出的测序图读长为282nt，之后无信号)，评分78。
本实施例中胶体金的直径为10nm；本实施例中的胶体金浓度为0.34nmol/L。
本实施例中的是从Sigma购买的胶体金。本实施例中的胶体金可以添加在样品中。本实施例中的使用是MegaBACE DNA测序仪。对于其它序列的DNA也可以采用上述方法提高有效测序长度与测序质量评分。
实施例2
1)按常规方法制备测序模板与测序反应以及其它上样前的准备；
2)每一样品加入上样缓冲液8μL，分别加入终浓度为0.26nmol/L，粒径为20nm的胶体金溶液(Sigma公司)，用普通膜封口，离心，将上样缓冲液和胶体金溶液甩至管底，则在加样孔中的样品为待测序样品、上样缓冲液和胶体金的混合物。然后将样品放进MegaBACE DNA测序仪中进行测序。
3)以测序软件输出测序图谱并对有效测序长度和测序质量进行打分评价，结果显示在上样样品中添加胶体金较未添加胶体金进行测序的处理其有效测序长度增加，质量评分也明显提高。
本实施例中胶体金的直径为20nm；本实施例中的胶体金浓度为0.26nmol/L。
本实施例中的胶体金是从Sigma商业购买的。胶体金可以添加在样品中。本实施例中的使用是MegaBACE DNA测序仪。对于其它序列的DNA也可以采用上述方法提高有效测序长度与测序质量评分。
实施例3
1)按常规方法制备测序模板与测序反应以及其它上样前的准备；
2)每一样品加入上样缓冲液8μL，分别加入终浓度为0.02nmol/L，粒径为30nm的胶体金溶液(Sigma公司)，用普通膜封口，离心，将上样缓冲液和胶体金溶液甩至管底，则在加样孔中的样品为待测序样品、上样缓冲液和胶体金的混合物。然后将样品放进MegaBACE DNA测序仪中进行测序。
3)以测序软件输出测序图谱并对有效测序长度和测序质量进行打分评价，结果显示在上样样品中添加胶体金较未添加胶体金进行测序的处理其有效测序长度增加，质量评分也明显提高。
本实施例中胶体金的直径为30nm；本实施例中的胶体金浓度为0.02nmol/L。
本实施例中的胶体金是从Sigma商业购买的。胶体金可以添加在样品中。本实施例中的使用是MegaBACE DNA测序仪。对于其它序列的DNA也可以采用上述方法提高有效测序长度与测序质量评分。
实施例4
1)按常规方法制备测序模板与测序反应以及其它上样前的准备；
2)每一样品加入上样缓冲液8μL，分别加入终浓度为0.005nmol/L，粒径为60nm的胶体金溶液(Sigma公司)，用普通膜封口，离心，将上样缓冲液和胶体金溶液甩至管底，则在加样孔中的样品为待测序样品、上样缓冲液和胶体金的混合物。然后将样品放进MegaBACE DNA测序仪中进行测序。
3)以测序软件输出测序图谱并对有效测序长度和测序质量进行打分评价，结果显示在上样样品中添加胶体金较未添加胶体金进行测序的处理其有效测序长度增加，质量评分也明显提高。
本实施例中胶体金的直径为60nm；本实施例中的胶体金浓度为0.005nmol/L。
本实施例中的胶体金是从Sigma商业购买的。胶体金可以添加在样品中。本实施例中的使用是MegaBACE DNA测序仪。对于其它序列的DNA也可以采用上述方法提高有效测序长度与测序质量评分。
Claims (4)
1.一种基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法，其特征在于，通过在上样过程中将胶体金添加到样品或上样缓冲液中，一方面胶体金粒子与单链DNA分子结合，富集DNA分子且增加DNA移动的速度，另一方面，胶体金粒子在毛细管中的聚合物网络中形成交链点，从而增强了分离的有效性；
所述胶体金，其粒径为5nm～60nm，用量为0.001nmol/L～1nmol/L。
2.根据权利要求1所述的基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法，其特征是，所述胶体金，其粒径为10nm，用量为0.1nmol/L～1nmol/L。
3.根据权利要求1所述的基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法，其特征是，所述胶体金，其粒径为20nm，用量为0.03～0.4nmol/L。
4.根据权利要求1所述的基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法，其特征是，所述胶体金，其粒径为30nm～60nm，用量范围为0.001nmol/L～0.03nmol/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100330006A CN101221148B (zh) | 2008-01-24 | 2008-01-24 | 基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008100330006A CN101221148B (zh) | 2008-01-24 | 2008-01-24 | 基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101221148A CN101221148A (zh) | 2008-07-16 |
| CN101221148B true CN101221148B (zh) | 2011-01-05 |
Family
ID=39631117
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008100330006A Expired - Fee Related CN101221148B (zh) | 2008-01-24 | 2008-01-24 | 基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101221148B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103995029B (zh) * | 2014-05-09 | 2016-08-24 | 山东大学 | 一种毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1112960A (zh) * | 1994-02-14 | 1995-12-06 | 株式会社京都第一科学 | 用于检测dna的特异碱基顺序的方法和装置 |
| JP2002034564A (ja) * | 2000-07-19 | 2002-02-05 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | コロイド状微粒子を用いた塩基配列検出方法 |
| CN1521273A (zh) * | 2003-02-14 | 2004-08-18 | 中国科学院上海原子核研究所 | Dna单分子有序化测序方法 |
| WO2005032686A3 (en) * | 2003-09-19 | 2005-07-07 | Univ New York State Res Found | Quasi-interpenetrating networks used as separation media |
| CN1932039A (zh) * | 2006-09-21 | 2007-03-21 | 上海交通大学 | 外切酶－纳米孔的单分子核酸测序方法 |
| CN1966719A (zh) * | 2006-10-27 | 2007-05-23 | 中国科学技术大学 | 一种用于毛细管电泳dna测序的聚合物/金纳米粒子复合介质及其制备方法 |
-
2008
- 2008-01-24 CN CN2008100330006A patent/CN101221148B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1112960A (zh) * | 1994-02-14 | 1995-12-06 | 株式会社京都第一科学 | 用于检测dna的特异碱基顺序的方法和装置 |
| JP2002034564A (ja) * | 2000-07-19 | 2002-02-05 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | コロイド状微粒子を用いた塩基配列検出方法 |
| CN1521273A (zh) * | 2003-02-14 | 2004-08-18 | 中国科学院上海原子核研究所 | Dna单分子有序化测序方法 |
| WO2005032686A3 (en) * | 2003-09-19 | 2005-07-07 | Univ New York State Res Found | Quasi-interpenetrating networks used as separation media |
| CN1932039A (zh) * | 2006-09-21 | 2007-03-21 | 上海交通大学 | 外切酶－纳米孔的单分子核酸测序方法 |
| CN1966719A (zh) * | 2006-10-27 | 2007-05-23 | 中国科学技术大学 | 一种用于毛细管电泳dna测序的聚合物/金纳米粒子复合介质及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Haikuo Li,et al..Nanoparticle PCR:nanogold-assisted PCR with enhanced specificity.《Angew Chem Int Ed Engl》.2005,第44卷(第32期),5100-5103. * |
| 吕鸣等.基于纳米操纵的基因组测序技术与策略.《电子显微学报》.2007,第26卷(第5期),488-493. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101221148A (zh) | 2008-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grossman et al. | Capillary electrophoresis: Theory and practice | |
| Feist et al. | Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples | |
| Breadmore et al. | Recent advances in enhancing the sensitivity of electrophoresis and electrochromatography in capillaries and microchips (2012–2014) | |
| Schnabel et al. | Determination of the p I of human rhinovirus serotype 2 by capillary isoelectric focusing | |
| Zhao et al. | Synthesis of molecularly imprinted polymer via emulsion polymerization for application in solanesol separation | |
| Datinská et al. | Recent progress in nucleic acids isotachophoresis | |
| Malá et al. | Analytical capillary isotachophoresis after 50 years of development: Recent progress 2014–2016 | |
| Duong et al. | Bottom-up proteomics: advancements in sample preparation | |
| Jessie et al. | Proteomic analysis of whole human saliva detects enhanced expression of interleukin-1 receptor antagonist, thioredoxin and lipocalin-1 in cigarette smokers compared to non-smokers | |
| CN104076004A (zh) | 一种检测样品中汞离子浓度的方法 | |
| Qu et al. | Simultaneous purification and fractionation of nucleic acids and proteins from complex samples using bidirectional isotachophoresis | |
| Kłodzinska et al. | Electrokinetic detection and characterization of intact microorganisms | |
| Raju et al. | Microfluidic platforms for the isolation and detection of exosomes: A brief review | |
| Guzman et al. | A two-dimensional affinity capture and separation mini-platform for the isolation, enrichment, and quantification of biomarkers and its potential use for liquid biopsy | |
| CN101788541B (zh) | 一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法 | |
| Hsieh et al. | On-line concentration and separation of cationic and anionic neurochemicals by capillary electrophoresis with UV absorption detection | |
| Zhang et al. | High selective and sensitive capillary electrophoresis-based electrochemical immunoassay enhanced by gold nanoparticles | |
| Dong et al. | Isolation of immunoglobulin G from bovine milk whey by poly (hydroxyethyl methacrylate)‐based anion‐exchange cryogel | |
| Poboży et al. | Application of capillary electrophoresis for determination of inorganic analytes in waters | |
| von Hagen | Proteomics sample preparation | |
| Piestansky et al. | Determination of branched-chain amino acids in food supplements and human plasma by a CE-MS/MS method with enhanced resolution | |
| CN101221148B (zh) | 基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法 | |
| Prosekov et al. | Determination of cinnamic acid by capillary zone electrophoresis using ion-pair reagents | |
| Xu et al. | Visual detection of chicken adulteration based on a lateral flow strip-PCR strategy | |
| Ye et al. | Maleopimaric acid anhydride‐bonded silica monolith as chiral stationary phase for separations of phenylthiocarbamyl amino acids by CEC |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110105 Termination date: 20140124 |