CN1142290C - 一种椭圆偏振术检测dna芯片杂交的方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明是一种椭圆偏振术检测DNA芯片杂交效率的方法及其装置。现有技术的检测方法多是将探针固定在基片上，去检测标记过的样品，这样的检测需要时间的等待，而且检测信号会随标记物信号的衰减而失去准确性。本发明用椭圆偏振仪检测DNA芯片杂交效率，通过生物分子本身的光学性质，测得其椭圆偏振参数ψ、Δ，定义与探针完全匹配的样品和只有探针存在时的芯片杂交效率分别为极大值和极小值，从而获得待测样品的杂交效率。本发明装置简捷，测量快速准确。

Description

一种椭圆偏振术检测DNA芯片杂交的方法及其装置

本发明是一种用椭圆偏振术检测DNA芯片杂交效率的方法及涉及该检测方法的装置。

传统的杂交都在膜上进行，即将样品固定在膜上，用荧光、生物素或者同位素标记过的探针对样品进行检测，其检测效果和标记有很大关系，并且必须及时进行。现在生物芯片多采用固态基片，即将探针固定在基片上，去检测标记过的样品。由于检测需要等待时间，因此该方法不适合临床和普及检查的需要，而且由于标记物的信号会衰减导致无法检测，因此人们都在寻求不加标记运用DNA分子本身的光学性质来检测杂交的有效方法。

本发明的目的是研究一种快速、简便的检测DNA芯片杂交的技术及其装置。

本发明是用椭圆偏振光谱测量技术检测DNA芯片杂交的方法。分子杂交是当一个核酸分子与另一个核酸分子的碱基有相对应的排列关系时，两个核酸分子即稳定组合。DNA芯片也称基因芯片，芯片的基质一般是玻璃或硅单晶，在数平方厘米区域根据用途划分出数百个甚至数百万个小区，在指定小区内固定有大量特定功能的核酸分子。由于被固定的分子探针在基质上形成不同的探针阵列，利用分子杂交及平行处理原理，基因芯片可对遗传物质进行分子检测。本发明中利用椭圆偏振光谱测量中的两个椭偏参量Ψ和Δ：ρ＝Rp/Rs＝(r_p/r_s)exp[i(δp-δs)]＝tanΨexp(iΔ)，式中ρ为膜层的复反射比，Rp和Rs分别为光束倾斜入射时，p偏振光和s偏振光的复反射率，tanΨ和Δ分别表示p偏振光和s偏振光的振幅比和相位差，由上式可得下式：

          tanΨ＝r_p/r_s        Δ＝δp-δs

对杂交检测，只要Ψ和Δ其中的一个在某波长下的值能区别样品即可，实验得到，450-550nm波长范围内不同样品的Ψ和Δ测量值可以明显区别，并且和该样品的序列匹配程度成比例关系。因此对于一个样品，测得某波长下的Ψ或Δ值，可以用该波长下杂交完全匹配以及只有探针存在时的Ψ或Δ作为极大值和极小值，近似按照线性关系来定义杂交的效率。

例如：同样入射角下，选择三个样品，样品A和探针的序列完全匹配，定义其杂交效率η_A定义为100％；样品B是无杂交反应的探针，定义其杂交效率η_B定义为零；样品C是待检测样品，其杂交效率是η_C，则η_C＝|Ψ_C-Ψ_B|/|Ψ_A-Ψ_B|。其中Ψ_C是待测样品C杂交后的Ψ测量值，Ψ_A是样品A杂交后的Ψ测量值，Ψ_B是样品B的Ψ测量值。利用450-550nm范围内某个波长，测量得Ψ_A、Ψ_B、Ψ_C，从而得到η_c值。

若从Δ计算，待测样品C的杂交效率η_c＝|Δ_C-Δ_B|/|Δ_A-Δ_B|。其中Δ_C是待测样品C杂交后的Δ测量值，Δ_A是样品A杂交后的Δ测量值，Δ_B是样品B的Δ测量值。利用450-550nm范围内某个波长，测量得ΨΔ_A、Δ_B、Δ_C，从而得到η_c值。

本发明检测时可用单晶硅片，先对基片进行硅烷化处理，然后在表面修饰醛基。探针固定在硅基片上，通过硅片上的醛基和探针DNA片段上的胺基进行醛胺结合反应，探针DNA片段以共价键形式结合在硅片上，这样结合上去的DNA片段分子基本是单分子层，比较均匀。最后将待测样品与基片上固定的探针杂交，杂交后的基片通过椭圆偏振术检测。上述过程均为该领域技术人员的现有技术，在此不多赘述。

上述椭圆偏振术检测DNA杂交效率的装置是按下列顺序装配的：光源→单色仪→起偏器→共聚焦系统→样品→步进转动检偏器→电荷耦合二极管光敏探测器(CCD)→图象采集卡→计算机。光束经过共聚焦后到达样品，样品是杂交后的DNA芯片，芯片上光束照射部分是一个检测单元，每个检测单元的杂交情况对应于CCD的各独立光敏单元的检测信号。

当光束经过共聚焦系统后直径可达5-50μm，CCD为面阵型，光敏单元尺寸与聚焦后光束直径匹配，芯片上每个探针样点的直径为几十微米，包含了一到几十个之间的检测单元。样品和CCD置于二维平台上，由计算机控制在x-y二维平面里精密快速步进移动。

该装置检测时，在样品和CCD处于某个位置时，由CCD将得到的光信号转换成电信号，再由图象采集卡转换为数字信号输入计算机，计算得到椭圆偏振参数Ψ和Δ，再由上述定义的计算方法得到样品该点的杂交效率，然后移动样品和CCD，得到芯片其余点的Ψ和Δ，计算出杂交效率。

由于芯片上的各检测单元的检测信号对应于CCD的各独立光敏单元，芯片快速扫描一遍的信息能被CCD及时响应处理，所以可以实现高速处理，因此该套装置即为用于芯片无标记检测的“芯片椭圆偏振仪”。

椭圆偏振光谱测量术是研究薄膜材料常用的高精度测量手段，测量灵敏度以及精确度都很高，本发明将基因芯片杂交效率用该测量方法获得，取得了十分满意的效果。由于在单入射角下测得单波长的Ψ和Δ值是非常快速的，仅几秒种即可完成，用CCD来检测还可更大程度地提高检测速度。入射光束经过共聚焦系统，其线度达几十微米以下，可以用于芯片的扫描检测。对于1000点阵的芯片，几分钟内即可检测完毕。本发明方法由于将不进行标记的探针固定在基片上，所以检测效果不受标记信号的影响，大大提高了检测的准确度。本发明装置简捷，测量稳定。由于本发明装置和方法能快速准确测量，因此可高效地应用于基因研究、医学鉴定、疾病检测和药物筛选等，是传统生物技术的创新和飞跃。

图1是实施例1中5份样品在65度入射角下的Ψ谱，其它2个入射角的图谱和此近似。

图2是实施例1中5份样品在65度入射角下的Δ谱，其它2个入射角的图谱和此近似。

实施例1：硅片晶向为(100)的N型抛光单晶硅片，将其切割成2×3cm²大小若干片，清洗后做硅烷化处理，然后在表面修饰醛基。探针    (上海生工订购)NH2-5’TTGAG ATCTT CTGCG ACGCG G3’样品    (上海生工订购)样品1.5’CCGCG TCGCA GAAGA TCTCA A3’和探针完全匹配样品2.5’CCGCG TCG TT GAAGA TCTCA A3’有2个碱基和探

                                  针不匹配样品3.5’ACTCA GTAGC TCCTG CCATG C3’和探针完全不匹

                                  配探针固定1.将订购的氨基修饰DNA片段溶解于双蒸水，10-100pm/ul，和5^*SSC以1∶1比例混合，上下摇动10次，取15ul点样到基片上。基片放置于培养皿内，半盖，在室温25度，相对湿度小于30％条件下干燥12小时。用0.2％SDS和双蒸水依次漂洗。再把基片放置于硼氢化钠溶液里，5分钟后取出用0.2％SDS和双蒸水漂洗，然后晾干。在室温下放置于储存盒内可以保存1年。2.硅片上的醛基和DNA片段的胺基进行醛胺结合反应，将DNA片段以共价键形式结合在硅片上。这样结合上去的DNA片段分子基是单分子层，比较均匀。杂交1.把固定探针的基片放在杂交盒里，加3ul 5^*SSC和0.1％SDS混合杂交液湿润基片。把5ul样品放置在22mm的盖玻片上，再盖到基片上，密封好杂交腔。放在62度水浴下杂交6小时。然后用1^*SSC和0.1％SDS室温下清洗，再用0.1^*SSC清洗以去除SDS，在空气中干燥。2.将样品1，2，3分别放置于3块基片上和固定的探针杂交。得到三块待测样品。待测样品样品1：固定探针的硅片+完全匹配片段           杂交样品2：固定探针的硅片+有2个碱基不匹配的片段  杂交样品3：固定探针的硅片+完全不匹配的片段       杂交样品4：固定探针的硅片样品5：只有醛基修饰的硅片

本发明用椭圆偏振光谱仪，对5块样品做检测。用氙灯做光源，经光栅单色仪输出单色光，测量光谱范围为250-830nm。实验在同样的室温下在暗室里进行。测量中，对同一个样品，光源入射角分别取60°、65°和70°三组进行宽谱扫描，扫描光谱范围从1.5-4.8eV，步长为0.05eV。得到这两个椭偏参数的谱，见图1、图2。

对于杂交检测，只要Ψ和Δ其中的一个在某个波长下的值能区别样品即可，由图可见，450-550nm波长范围内不同样品的Ψ和Δ测量值可以明显区别，并且和该样品的序列匹配程度成比例关系。因此对于一个样品，测得某波长下的Ψ或Δ值，可以用该波长下杂交完全匹配以及只有探针存在时的Ψ或Δ作为极大和极小值，近似按照线性关系来定义杂交的效率。

本实施例取λ＝532nm来计算。1.以Ψ值为例来计算杂交效率η。

532nm波长处5个样品的Ψ值分别为：

Ψ₁＝44.2，Ψ₂＝42.9，Ψ₃＝36.9，Ψ₄＝33.7，Ψ₅＝24.8，

定义：完全匹配的样品1的杂交效率η₁＝100％，

      没有进行杂交反应的探针的杂交效率η₄＝0，

计算2个碱基失配的样品2的杂交效率

η₂＝|Ψ₂-Ψ₄|/|Ψ₁-Ψ₄|

   ＝|42.9-33.7|/|44.2-33.7|

   ＝87.6％

计算完全失配的样品3的杂交效率

η₃＝|Ψ₃-Ψ₄|/|Ψ₁-Ψ₄|

   ＝|36.9-33.7|/|44.2-33.7|

   ＝34.8％2.以Δ值为例来计算杂交效率η。

532nm波长处5个样品的Δ值分别为：

Δ₁＝-146.9，Δ₂＝-137.6，Δ₃＝-106.9，Δ₄＝-110.6，Δ₅＝-133.1，

杂交效率的极大和极小值定义同上。

计算2个碱基失配的样品2的杂交效率

η₂＝|Δ₂-Δ₄|/|Δ₁-Δ₄|

   ＝|(-137.6)-(-110.6)|/|(-146.9)-(-110.6)|

   ＝74.4％

计算完全失配的样品3的杂交效率

η₃＝|Δ₃-Δ₄|/|Δ₁-Δ₄|

   ＝|(-106.9)-(-110.6)|/|(-146.9)-(-110.6)|

   ＝10.2％

样品2的碱基匹配率为19/21＝90％，样品3的碱基匹配率为0，可以看到，我们由测量计算出的杂交效率在将完全失配样品3的杂交效率当做本底扣除后，可以用来描述杂交的两个序列的匹配程度。

实施例2：

用椭圆偏振术检测DNA杂交效率的装置：光源→单色仪→起偏器→共聚焦系统→样品→步进转动检偏器→CCD→图象采集卡→计算机。

光束经过共聚焦后直径为20μm，以65°入射角到达样品，样品是杂交后的DNA芯片，光束照射部分是一个检测单元，芯片上点样面积为1×1cm²，每个样点直径为50μm，相邻样点中心距离为100μm，芯片共有100×100个样点单元，每个样点单元包含有25个检测单元。CCD的光敏单元尺寸与聚焦后光束直径匹配，每个检测单元的杂交情况对应于CCD的各独立光敏单元的检测信号。样品和CCD置于二维平台上，由计算机控制在x-y二维平面里快速精密移动，每步移动距离和光束直径相等。该装置检测时，在样品和动，每步移动距离和光束直径相等。该装置检测时，在样品和CCD处于某个位置时，由CCD将得到光的光信号转换成电信号，然后再通过图象采集卡转换成数字信号输入计算机，再计算得到椭圆偏振参数Ψ和Δ，再由上述定义的计算方法得到样品该点的杂交效率，然后移动样品和CCD，得到芯片其余点的Ψ和Δ，计算出杂交效率。

每个检测单元的信号采集和计算以及平台移动一步需要的时间一共约为几十毫秒，以50ms来计算，检测该100*100点阵芯片需要的时间为20分钟。而对于一般临床应用的只有400点阵左右的芯片，可以增加光束直径和平台步进距离，只要几分钟左右即可检测完毕。

Claims (2)

1.一种椭圆偏振术检测DNA芯片杂交的方法，椭偏光谱测量中两个椭偏参量是Ψ和Δ：ρ＝Rp/Rs＝(r_p/r_s)exp[i(δp-δs)]＝tanΨexp(iΔ)，式中ρ为膜层的复反射比，Rp和Rs分别为光束倾斜入射时，p偏振光和s偏振光的复反射率，tanΨ和Δ分别表示p偏振光和s偏振光的振幅比和相位差，由上式可得下式：

            tanΨ＝r_p/r_s    Δ＝δp-δs选择λ＝450-550nm范围测量，定义完全匹配的样品杂交效率是100％，没有进行杂交反应的探针的杂交效率是零，则杂交效率η＝|Ψ_样品-Ψ_B|/|Ψ_A-Ψ_B|，其中Ψ_样品是待测样品杂交后的Ψ测量值，Ψ_A是完全匹配序列杂交后的Ψ测量值，Ψ_B是没有进行杂交反应的探针的Ψ测量值，若用Δ来计算，方法相同；检测步骤如下：同样入射角下，选择三个样品，样品A和探针的序列完全匹配，定义其杂交效率η_A定义为100％，样品B是无杂交反应的探针，定义其杂交效率η_B定义为零，样品C是待检测样品，其杂交效率是η_C，则η_C＝|Ψ_C-Ψ_B|/|Ψ_A-Ψ_B|，其中Ψ_C是待测样品C杂交后的Ψ测量值，Ψ_A是样品A杂交后的Ψ测量值，Ψ_B是样品B的Ψ测量值，利用450-550nm范围内某个波长，测量得Ψ_A、Ψ_B、Ψ_C，从而得到η_c值。

2.一种用于实施权利要求1所述的椭圆偏振术检测DNA芯片杂交方法的装置，主要由光源、单色仪、起偏器、聚焦系统、检偏器、检测器等部件构成，其特征是该装置各部件安置顺序是：光源→单色仪→起偏器→共聚焦系统→样品→步进转动检偏器→CCD→图象采集卡→计算机，其中光束经过共聚焦系统后到达样品，样品是杂交后的DNA芯片，芯片上光束照射部分是一个检测单元，每个检测单元的杂交情况对应于CCD的各独立光敏单元的检测信号，芯片上每个探针样点由多个检测单元组成，芯片样品置于二维平台上，计算机控制平台精密步进二维移动。

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