CN102414555A - 在两液体间的薄固态界面上成像的方法 - Google Patents

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Abstract

在此描述了一种用于光学显微工具的流体室，其具有固态膜，该固态膜具有第一侧和相对的第二侧；位于所述膜第一侧的第一流体腔，包括具有第一折射率的第一液体；以及位于所述膜第二侧的第二流体腔，包括具有第二折射率的第二液体，其中，第二折射率与第一折射率不同。在此还描述了把单个的生物分子成像的方法，该方法包括在具有不同折射率的第一液体和第二液体之间的固态膜处产生隐失照明场；以及探测位于所述固态膜处的单个的生物分子所连接的光学探测标记所发射的光。

Description

在两液体间的薄固态界面上成像的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年3月26日递交的第61/211,260号美国临时专利申请的所有权益。通过参考引用，该专利申请的全部内容被并入本申请。
政府支持
本发明是在第HG-004128号合同下，在国家卫生研究院拨款的政府支持下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本发明是有关光学显微镜领域。更具体地，本发明利用两液体间的薄固态界面改进了生物分子的成像。
背景技术
第一个参照人基因组序列的完成标志着一个时代的到来，基因体变异直接影响了药物发现和医疗。这个新的范式产生了对便宜和超快的DNA测序方法的急迫需求。在不久的将来，医疗从业者将能够在临床场合，在开处方之前常规地分析患者的DNA，并且与记载有和任何药品相关的基因信息的在线数据库进行核对。此外，负担得起的测序技术将改变比较基因组学和分子生物学的研究，允许科学家快速测序来自细胞变异体的整个基因组。为了实现超快和便宜的DNA测序，需要新技术来代替基于Sanger双脱氧链终止协议的经典方法。这些新技术应该解决两个主要的瓶颈：(1)样本尺寸应该被降到最低，使得可以从单个的DNA分子或少量的拷贝读出序列；以及(2)与当前的现有技术相比，读出速度应该提高几个数量级。
固态表面，如氮化硅、氧化硅及其他，已经被很多生物医学应用所采用，包括组织工程、可植入装置以及基本研究。薄固态表面已经被用于不同的微米级和纳米级结构装置，如生物传感和DNA测序应用中所采用的纳米缝隙和纳米孔阵列。最近有资料显示氮化硅膜适于作为衬底，以为例如生物分子探测和DNA测序这些应用产生固态纳米孔。涉及DNA易位的单分子光学探测的，以及通过固态纳米孔解链的固态装置已经被认为对生物传感和基因组测序非常关键。对于通过这些装置进行单分子的体外光学信号测量，采用显微镜的隐失模式非常有用。
在生物医学研究和医疗装置领域，希望能够利用目标材料通过成像来研究分子、细胞和组织。全内反射荧光显微镜(TIRFM或TIRF)就是一项这样的成像技术。固态材料已经被用于那些情况，然而它们与最新的光学显微方法不兼容，如TIRF。在现有的技术中，很难把这些固态材料表面带入另一表面，如盖玻片的隐失场，并且构造把氮化硅膜和生物样本带入TIRF隐失场环境所要求的纳米流体通道非常繁琐。此外，由于微粒所固有的密度(即使在干净的房间环境里)、在处理这些氮化硅晶圆的过程中所产生的颗粒物以及这些氮化硅膜芯片的温度约束限制，用氮化硅表面密封这些纳米孔非常困难。
发明内容
本发明的实施例通过横亘这些固态膜的两介质之间的折射率匹配的TIRFM(全内反射荧光显微镜)，在这些固态膜(携带纳米孔装置和其他生物样本)处实现了隐失模式激发。这使得可以获得膜上的一个或者更多生物分子的高分辨率、高对比度以及高感光度图像。
根据本发明的一个方面，披露了光学显微工具的流体室，其包括具有第一侧和相对的第二侧的固态膜，位于膜第一侧的第一流体腔，该第一流体腔包括具有第一折射率的第一流体，以及位于膜第二侧的第二流体腔，该第二流体腔包括具有第二折射率的第二流体，其中，第一折射率高于第二折射率。
固态膜可以是氮化硅、氧化硅、氧化铝、氧化钛或其他介电材料。
固态膜可以包括沉积在硅晶圆上的氮化硅层。该氮化硅层可以是5～50nm厚。该硅晶圆可包括一窗口，所述氮化硅层覆盖或延伸跨越该窗口。
第一液体可以是水性缓冲溶液或水。第二液体可以是细胞液、细胞膜或甘油。第一液体可以是浓缩的尿素溶液或CsCl溶液。
可以在所述膜的第二侧提供连接到光学生物标记的生物分子。该生物分子可以是DNA分子。该生物分子可以是RNA分子。该生物分子可以是蛋白分子。该光学生物标记可以是易激发的荧光团。
第一液体腔可以是微通道。
固态膜可以包括至少一个纳米孔，在一些实施方式中，其包括多个纳米孔。这些纳米孔可以排布成圆形或多边形阵列。
根据本发明的又一方面，披露了用于把单个的DNA分子成像的光学显微工具，其包括流体室，该流体室包括覆盖硅晶圆的窗口的固态膜，位于该固态膜一侧的第一液体腔，该第一液体腔内的具有第一折射率的第一液体，位于该固态膜另一侧的第二液体腔，该第二液体腔内的具有第二折射率的第二液体，其中，第二折射率低于第一折射率；盖玻片，流体室安置在盖玻片上，使得盖玻片形成所述第一液体腔的底面；物镜；物镜和盖玻片之间的浸镜油；光源，被设置成把光导向所述物镜，所述物镜被设置成把所述光聚焦，使得产生小于所述固态膜覆盖的窗口的隐失照明场；以及图像探测器，探测所述固态膜处的单个的DNA分子发出的光。
所述光源可以包括至少一个激励激光器，在一些实施方式中，包括多个产生不同波长激光束的激光器。所述图像探测器可以包括电子倍增电荷耦合器件(CCD)摄像机或光探测器。
生物素-链霉亲和素化学法可被用于把单个的DNA分子固定在所述固态膜上。
根据本发明的又一方面，披露了用于成像单个的生物分子的光学显微工具，其包括用于产生位于固态膜的隐失照明场的装置，该固态膜位于具有不同折射率的第一液体和第二液体之间；以及用于探测位于所述固态膜上的单个的生物分子所连接的光学标记发射出的光的装置。
所述用于产生位于固态膜的隐失照明场的装置可以包括激励激光器和聚焦透镜。所述用于探测由光学标记发射的光的装置可以包括光探测器或电子倍增CCD摄像机。
所述光学显微工具还可以包括用于把所述单个的生物分子固定于所述固态膜的装置。
所述隐失照明场可以小于所述固态膜的尺寸。
根据本发明的又一方面，披露了成像单个的生物分子的方法，其包括在固态膜处产生隐失照明场，该固态膜位于具有不同折射率的第一液体和第二液体之间；以及探测位于所述固态膜的单个的生物分子所连接的光学标记发射的光。
所述方法还包括把所述单个的生物分子固定于所述固态膜。
从所述探测到的光产生图像。
根据本发明的又一方面，披露了成像单个的DNA分子的方法，其包括把光导向光学显微工具的物镜；引导光穿过第一液体；在氮化硅膜处反射该光以在第二液体内产生隐失照明场；以及把所述隐失照明场激发的并连接至所述单个的DNA分子的光学标记所发射的光导向成像探测器。
所述隐失照明场可以在所述第二液体内产生。所述单个的DNA分子可以被固定在所述第二液体内氮化硅膜上。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例的流体室的示意图。
图2是根据本发明一个实施例的流体室的界面的透视图。
图3是根据本发明一个实施例的界面处TIR的示意图。
图4是根据本发明一个实施例的光学显微工具的示意图。
图5是根据本发明一个实施例的在TIRF下成像的单个的DNA分子的荧光图像。
图6是根据本发明一个实施例的DNA测序方法的示意图。
图7是根据本发明一个实施例的利用一比特(a)和两比特(b)DNA读出的同时进行电子光学探测的示意图。
图8是根据本发明一个实施例的多色光学显微工具设置的示意图。
图9是根据本发明一个实施例的孔定位计数的直方图。
图10A和10B根据本发明的一个实施例展示了多孔探测中的额外步骤，包括从多个孔同时读出(图10A)和多个比特的同时读出(图10B)。
图11是根据本发明一个实施例的流体室的示意图。
图11A是根据本发明一个实施例的图11所示的流体室的详细示意图。
图11B是根据本发明一个实施例的图11所示的界面的详细示意图。
图12是根据本发明一个实施例的在TIRF下成像的单个的DNA分子的荧光图像。
图13是根据本发明一个实施例的分析硬件的方块图。
图14A～C根据本发明一个实施例展示了电和光信号的同步。
图15A～15B根据本发明一个实施例展示了DNA分子穿过纳米孔的过程。
图16A～16B展示了在如图15A～15B所示的穿过事件过程中，电和光信号的同步。
图17是根据本发明一个实施例的界面处TIR的示意图。
具体实施方式
本发明的实施例是有关通过厚度为纳米级的固态膜成像单个的分子和生物材料的方法。该方法具有优势，因为除了可以对单个的分子和生物材料进行传统的电测量外，还可以进行光学(如荧光)测量。在一个实施例中，通过两易混的/不相混的液体间的薄固态界面，在隐失模式下成像单个的分子或生物材料。流体室提供了具有不同折射率的两易混液体间的固态界面。该固态界面的厚度可以是几纳米或几十纳米，并可以用氮化硅、氧化硅和/或类似物制成。
可以在所述两液体上施加电势，使得生物分子(如DNA、RNA或蛋白)穿过所述固态界面中的纳米孔或纳米孔阵列。在DNA易位中，单链DNA分子被电泳驱动，以单列形式穿过纳米孔。在该实施例中，通过生物化学转化，目标DNA序列的每一碱基首先被映射至2或4单元代码，2 10-20bp核苷酸序列。接着，这些2-单元或4-单元代码被杂交成互补的，荧光标记的，以及自我猝灭的分子信标。因为在穿过纳米孔的易位过程中，分子信标是连续地解链，它们的荧光标记没有灭失，并且由单色或多色(如两种或更多颜色)全内反射荧光显微镜(TIRF)读取。接着，把获得的单色或多色光学信号关联至所述目标DNA序列。
本发明的实施例有优势，因为其可以获得高分辨率和高感光度的单个的生物分子或生物材料的图像，这些生物分子或生物材料被固定在所述固态界面上，位于“厚”的水性液体层(即高折射率液体)之上。更具体地，通过在所述“厚”的水性液体层内的深处实现隐失场，在该薄固态界面处的分子或生物材料的高光学对比度探测可被用于成像所述单个的生物分子或生物材料。
图1展示了本发明一个实施例的流体室。如图1所示，流体室100包括第一腔104和第二腔108。第一液体112在第一腔104内，而第二液体116在第二腔108内。如此选择该两液体112和116，使得它们具有不同的折射率。第一液体112的折射率比第二液体116的高。这样选择两液体112和116的折射率，以在界面120处达成全内反射(TIR)。例如，第一液体112可以是细胞质(n＝1.36)或细胞膜(n＝1.47)，而第二液体116可以是水性缓冲溶液(n＝1.33)。在又一实施例中，第一液体112含有盐。两液体112和116均为水性溶液。
流体室100还包括界面120。界面120包括固态膜124。界面120位于第一腔104和第二腔108之间，以把两液体112和116隔离。两液体112和116之间的界面120使得可以发生全内反射(TIR)。更具体地，TIR照明在固态膜124(如SiN膜)处发生，并且在第一腔104内产生隐失波。界面120，尤其是膜124形成了生物分子互动的基底。
图2详细展示了界面120。如图2所示，界面220包括具有窗口224的芯片228。芯片228作为框架支持覆盖窗口224的固态膜。该芯片的尺寸的例子可以是5mm*5mm*300μm，而该膜的尺寸的例子可以是50μm*50μm*5～50nm。界面220可以用任何合适的固态材料(如硅基材料)，以传统的技术制成，包括化学气相沉积(CVD)、湿蚀刻以及光刻法。
在一个实施例中，芯片228是硅，并且覆盖有氮化硅膜。可以理解，该膜可以是任何能形成薄膜的介电材料。膜的材料的其他例子包括氧化硅、氧化铝、氧化钛等。芯片材料的其他例子包括玻璃、熔融硅石、石英等。
在此描述的固态膜的厚度可以是大约5～60nm。例如，固态膜可以是大约10nm厚。然而，可以理解，可以根据两易混液体间由TIR照明产生的隐失波的期望的尺寸和衰减，来选择所述膜的厚度，其可以小于5nm或大于60nm。膜的纳米级厚度帮助界定了两液体间界面的清晰的边界，TIR就在该界面处发生。
可以理解，在一些实施例中，固态膜可以包括纳米孔、纳米缝隙或纳米孔阵列。这些纳米孔(1～100nm)或纳米孔阵列跨越界面连接了这些液体。固态纳米孔具有可调的尺寸，并且可以承受较大范围的温度、pH以及化学变化。可以用例如Ar离子束或电子束雕刻，或反应性离子蚀刻等方法来制作纳米孔。
图3展示了设于普通显微镜盖玻片240上的流体室100，用于和光学显微工具一起进行基于TIR的测量。盖玻片240设于物镜236上，盖玻片240和物镜236之间有浸镜油238。一种或更多连接至光学标记，例如荧光团，的生物分子或生物材料被固定在膜224上，以进行成像。
光学标记可以是任何暴露于隐失波时照明或者发射辐射的材料。光学生物标记的例子包括荧光丙烷或荧光共振能量转移(FRET)标记(如荧光团)、量子点或有机化合物。如业界一般技术人员所能理解的，可以利用已知的技术把光学生物标记和目标生物分子缔合，例如共价或非共价缔合。在本发明的一个实施例中，光学标记可以是化学缀合的。在本发明的一个替代实施例中，可以通过融合把生物分子和光学标记缔合，如绿荧光蛋白融合至细胞受体或信号分子。
激光束242被聚焦于物镜236的后焦面。由于浸镜油238和盖玻片240之间的折射率匹配，光反射进入介质1 216。在膜224处，由于两液体212和216的折射率不匹配，光全内反射246。当光从更高折射率介质(更稠)到更低折射率(更稀)介质，其反射离开表面的法线。当该两介质的界面处的入射角大于临界角时，光全内反射回较稠的介质内。在较稀的介质内产生隐失波246，其具有指数衰减强度，可激发膜224表面的荧光团(激发光的“趋肤”深度的数量级一般为几十纳米)。由激发荧光团250产生的光可被位于盖玻片240下方的物镜236聚焦，被成像装置测量，如CCD摄像机或光探测器。
在一个实施例中，这样产生光，使得隐失波246的面积小于膜224的面积。在又一实施例中，这样产生光，使得隐失波246的面积等于膜224的面积。
可以理解，在一些实施例中，可利用各种刺激剂，用膜上的纳米孔、纳米缝隙或纳米孔阵列来局部刺激活细胞表面。利用在此描述的隐失模式成像，在细胞膜的末端位置，可以测量对这些刺激的响应。
生物分子或生物材料(如细胞)可被直接放置于将被成像的膜224上。作为替代方案，可以在膜224和将被成像的生物分子或生物材料之间提供薄的缓冲或中间层。例如，有机聚合物薄层可被用作该中间层。
图4展示了根据本发明一个实施例的光学显微工具400的一个例子。可以理解，显微工具400的元件和元件的设置可以与如图4所示的不同。显微工具400包括激光源402、x轴位移台406、透镜414、透镜418、白光源422、偏振分光镜(PBS)426、透镜430、物镜436、双色镜(DM)468、滤镜472、反光镜476、透镜480以及探测器484，如CCD。流体室被置于盖玻片440上，该流体室包括第一液体412，折射率不同于第一液体412的第二液体416，以及固态膜424。在盖玻片440和物镜436之间提供浸镜油。
在所展示的显微工具400中，激光或白光可被用于进行全内反射荧光显微。在一个实施例中，激光410由激光源402产生，并且由透镜414和418导向和整形。透镜430被配置成降低激光束的光斑大小。可以理解，透镜414和418也可以降低激光束的光斑大小。利用x轴位移台406沿x轴移动光纤耦合器，可以使光偏移光轴。在又一实施例中，白光由白光源422产生。在又一实施例中，白光和激光均可被用于进行全内反射荧光显微。分光器426被配置成把由激光源和/或白光源422产生的光导向第一液体412内的样本(如生物分子)。在又一实施例中，可以同时使用多个激光波长，或者一次使用一个波长，来激励单色或多色荧光团。
经过透镜430和双色镜468后，所产生的光被物镜436所限制，从而足够导致全内反射的光被导向样本。可以理解，物镜436可以进一步降低激光束的光斑大小。可以理解，激光束的光斑尺寸可以是直径大约为0.5～1mm。透镜414、418、430和/或436收敛光束，使得光束在硅膜处产生的光点的尺寸为直径大约为5μm至大约与膜424的面积相当。例如，如果膜424的尺寸为50*50μm2，那么可以产生尺寸为5～50μm的光点。
光442在固态膜424处全内反射至盖玻片440，从而在第二液体416内产生隐失场。位于固态膜424附近的荧光团被隐失波激发，其使得荧光团发射荧光。接着，荧光和反射光452被双色镜468导向滤光镜472。双色镜468和滤光镜472过滤光，使得只有荧光发射通过。反射镜476引导荧光通过透镜480到达探测器484。
探测器484可以是EMCCD摄像机，比如可以从北爱尔兰贝尔法斯特的AndorTechnology plc.(Andor)处购买的iXon BV887。探测器484的其他例子包括雪崩光电二极管(APD)和光电倍增管(PMT)。探测器484可以连接至合适的成像系统，比如基于微软Windows的个人计算机和成像软件，比如Solis软件(也来自Andor)，用于处理由探测器484产生的数据信号，以产生图像或一系列图像。定制的软件可用于分析这些数据信号，探测荧光发射，并确定受检测的生物分子或生物材料的序列或其他特征。
可以理解，界面处TIR激发的面积取决于激发光束的性质。利用已知的光束整形技术可以把激光束整形，以控制TIR模式下的激光照明场。这样，就可以根据需要提高或降低光束的直径，或将其拉长。
图5展示了用显微工具，如显微工具400，产生的图像的例子。在图5中，展示了一个示例性样本的TIRF照明504的视野。图5还展示了用具有两个代表性液体的显微工具成像的单个的荧光DNA分子508，具体而言，这两种液体是7M CsCl(n＝1.416)和8M尿素(n＝1.416)。然而，可以理解，根据本发明的实施例，可以用其他液体来成像单个的生物分子。在图5中，单个的DNA分子在氮化硅膜上被成像，信号背景比约为2.5，图像获取为5帧每秒。
图6～10B展示了本发明的一个实施例，其中膜124包括纳米孔600。如图6所示，包括具有纳米孔610的膜124尤其适用于利用DNA易位进行DNA测序。可以理解，包括具有纳米孔600的膜124的实施例并不限于利用DNA易位进行DNA测序。例如，该实施例可以适用于基因型鉴定应用、生物分子成像以及生物分子筛选。在又一例子中，可以通过纳米孔600把蛋白成像。
在DNA易位中，单链DNA分子被电泳驱动以单列的方式穿过纳米孔600。可以理解，在这些实施方式中，流体室100还进一步包括与电源连接的电极，其被配置成产生施加于液体112和116的电势，以电泳驱动DNA分子穿过纳米孔600。
在图6中，待探测的连接至光学标记的单个的生物分子是与代表核苷酸A、T、U、C或G的序列代码杂交的寡核苷酸。在一个实施例中，光学标记是特异性报告所述DNA序列的荧光标记。在标记操作的一个例子中，原始的DNA是核苷酸基团取代的(每一碱基型由3～16个核苷酸的唯一序列取代)。这样，在纳米孔测序的过程中，当杂交寡核苷酸从待测序的编码的核酸解链时，可以探测到连接至光学标记的寡核苷酸。
例如，在DNA转换操作中，原始DNA序列中的每一碱基由2个二进制代码单元的唯一组合表示(开口圆和实心圆分别标记为0和1)。在该例子中，0和1被定义为10个核苷酸的唯一DNA序列，分别为“S0”和“S1”。被转换的单链DNA与两种分子信标杂交，该两种分子信标与所述2个代码单元互补，并且该被转换的单链DNA显示最小的横截面。例如，一个信标可以在5’端含有红色荧光团并在3’端含有猝光剂Q，而另一信标可以在5’端含有绿色荧光团并在3’端含有相同的猝光剂分子。广谱猝光剂Q对两种荧光团都有抑制作用。这两种不同颜色的荧光团使得可以区分这两个信标。在又一DNA转换操作中，原始DNA序列中的每一碱基由四个独特代码(序列)中的一个来表示，接着，这四个代码分别与对应的4色分子信标杂交。在这两个操作中，经转换的DNA序列诱导相邻的信标的排布，使得相邻信标上的猝光剂抑制荧光发射，从而使DNA保持“暗”，直至各代码单元被相继地从DNA去除(除了第一个信标)。可用于本发明的荧光团的例子包括TMR和Cy5。可采用的其他类型的荧光分子包括CPM，Invitrogen提供的Alexa系列荧光标记，荧光红家族，以及德克萨斯红。业界技术人员所知的其他信号分子也在本发明的范围之内。可用于本发明的多种其他荧光团包括美国专利第6,528,258号中所列的那些，通过参考引用，其全部内容被并入本申请。可用于本发明的猝光分子包括Dabcyl、Dabsyl、甲基红以及Elle猝光剂。业界技术人员所知的其他猝光分子也在本发明的范围之内。这显著降低了由相邻分子和溶液中的自由信标所造成的荧光背景，从而获得较高的信号/背景比。
请再参图6，与经转换的DNA互补的荧光标记的寡核苷酸与所述DNA杂交，接着，通过电泳将该分子驱动通过膜124中的纳米孔600。当探测到由粘附的荧光团发出的不同颜色的闪光时，纳米孔600把寡核苷酸一个一个地从经转换的DNA相继剥离。当该分子被引入纳米孔，信标被一个一个地剥离。每次当一个新的信标被剥离，就有一个新的荧光团被取消抑制并被显微镜记录。被释放的信标被自动关闭，抑制其自己的荧光，然后其扩散离开纳米孔的附近。一旦第一信标被释放，来自第二信标的新的荧光团被点亮。
DNA易位速度由DNA解链动力学调节，通过采用光学探针(或信标)获取碱基之间的对比。DNA进入纳米孔600把离子电流突然降低到隔断的水平。当DNA从另一侧出来，恢复开孔电流水平。合适的电压可被用来调节DNA解链的时间(例如1～10ms)。例如，对于10-bp发夹序列，120mV的电压所导致的解链时间大约为10ms。用电场强度来调节该时间，以优化信号/背景水平。
在这样的方式下，可以确定任何核酸的序列。对把被测序的核酸转换为编码的序列、编码系统以及纳米孔测序的详细描述请参Soni和Meller(Soni G.V.and Meller A.，Progresstowards ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores，Clinical Chemistry 53，11(2007))，Meller等在2009年的发表(U.S.Patent Application publication 2009/0029477)，以及Meller和Weng(PCT Application No.PCT US 2009/034296)。通过参考引用，这些参考文献的全部内容被并入本申请。可以理解，该方法可用于平行纳米穿孔阵列。
图7展示了用1比特(如图7(a))和2比特(如图7(b))编码的纳米孔测序色彩。如图7所示，在此描述的装置和方法使得可以同时电和光探测1比特和2比特DNA读出，并且具有较高的信噪比和单个的荧光团分辨率。
可以利用多色光学显微工具实现2比特色彩编码，比如，如图8所示的多色TIRF显微镜。在如图8所示的实施例中，两个具有不同波长的激光源802a和802b可被单独或同时点亮，以产生具有不同波长的隐失波，从而单独或同时激励不同光学标记。类似地，对于3个或更多色彩编码系统，可以单独或者同时点亮三个或四个具有不同波长的激光源，以产生三个或更多具有不同波长的隐失波，从而单独或同时激励不同光学标记。
如图8所示，第一激光源802a产生第一激光束810a，第二激光源802b产生第二激光束810b，第一和第二激光束810a和810b由透镜L整形并被导向物镜836。透镜L被配置成降低由第一和第二激光源802a和802b产生的激光束810a和810b的光斑尺寸。在一个实施例中，激光源802a和802b是可以照明样本的蓝色和红色二极管激光器(488nm和640nm)的组合。如以上结合图4所描述的，光802a和802b在膜124处发生全内反射，从而产生隐失场，其激励连接至在流体室内待成像的生物分子的荧光团。在如图8所示的实施例中，膜124包括纳米孔600，其使得可以进行如上所述的DNA易位。
接着，利用物镜836收集荧光850，由双色镜DM和滤镜F过滤并导向探测器884，比如用于成像的帧转移冷却式电子倍增电荷耦合器件摄像机或光探测器。探测器884可以连接至合适的成像系统来处理由探测器884产生的数据信号，以产生一幅或一系列图像，成像系统比如基于微软Windows的个人计算机和成像软件，例如Solis软件(也是由Andor提供)。定制的软件也可以用于分析这些数据信号，探测荧光发射，以及测定待测的生物分子(如DNA)的序列或其他特性。
图9展示了在DNA解链时，图8所示的多色光学显微工具的孔定位计数直方图的一个例子。
可以理解，可以利用在此描述的实施例实现纳米孔阵列的光学成像。例如，在此描述的光学成像可被用于从如图10A所示的多个孔同时读出，和/或如图10B所示同时读出多比特。
本发明的实施例还可用于成像细胞或组织粘附，以研究细胞毒性以及与固态材料的生物相容性，如SiN膜。
本发明的实施例还可用于通过纳米孔、纳米缝隙或纳米孔阵列，以穿过界面的介质中的刺激剂局部地激励细胞，并通过膜，利用光学显微镜测量细胞的反应。细胞对与新生物材料(比如SiN膜)或刺激剂的接触的反应，可以用细胞膜上生物标记的荧光读出来测量。
在荧光标记的核酸或其他生物聚合物穿越或暂时嵌入固态膜中的纳米孔的过程中，本发明的实施例可以用于以单分子分辨率成像这些核酸或其他生物聚合物。
本发明的实施例还可用于测量连接至在纳米孔中易位或暂时嵌入纳米孔的生物聚合物的荧光标记的蛋白的化学计量比，生物聚合物比如DNA。
本发明的实施例还可用于多色探测，从而可用于探测连接至DNA的生物独特的蛋白的空间定位。
本发明的实施例还可用于通过纳米孔进行DNA测序，以及高通量药物筛选。
可以理解，可以根据应用，通过改变光束直径和/或入射激光束的形状来改变TIR照明场的尺寸。
在一个实施例中，如图17所示，物镜236a可被置于cis腔208之上，而非trans腔204之下。物镜236a可用于成像。在该设置中，可利用透镜236b而非物镜236a把激光束242聚焦于膜224。如以上结合图3的描述，由于浸镜油238和盖玻片240的折射率匹配，来自激光器(通过透镜236b)的光242反射进入介质1 216。在膜224处，由于两液体212和216的折射率不匹配，光发生全内反射246。在较稀的介质即介质1 216内产生隐失波246，其具有指数衰减的强度，可激励膜224表面的荧光团(通常，激发光的“趋肤”深度为数十纳米)。由被激励的荧光团产生的光可以由置于cis腔208上方的物镜236a聚焦，并由CCD摄像机484或光探测器测量。
例子
例1
样本几何尺寸
以标准的光刻法，在通过LPCVD镀有SiN层的硅晶圆上，制作在中心处具有独立的20～50nm厚的氮化硅窗口[50μm*50μm]的硅芯片[5mm*5mm*300μm]。如图3所示，设计了具有两部分PTEE/CTFE的流体室，以把这些芯片安置于盖玻片之上，在芯片和盖玻片之间形成2～10μm厚的微通道。微通道即trans腔204充有具有较高折射率的液体(70％甘油[n＝1.42])，而cis腔208充有溶于水的样本溶液缓冲液[n＝1.33]。
TIRF设置和光束示意图
如图4所示设置全内反射(TIR)显微镜。激光束光斑尺寸被降低至0.7mm，射入市场上可买到的倒置显微镜(Olympus IX-71)的定制设计的后光埠，并通过外部安装的200mm焦距透镜聚焦于60X1.45NA油浸TIRF物镜的后焦面。通过沿X轴移动激光光纤耦合器，使得激光点偏离光轴。选择玻璃的折射率[n＝1.52]、70％甘油的折射率[n＝1.42]以及样本缓冲液的折射率[n＝1.33]，使得光反射穿过tans腔内的油、盖玻片以及70％甘油，直至到达氮化硅膜处的甘油-水界面。在该界面处，TIR模式的临界角与Snell定律中所描述的玻璃-水界面的相同，
nglasssin(θglass)＝nglysin(θgly)＝nwsin(θw)
其中，n表示玻璃、70％甘油或水的折射率，而θ表示对应界面处的入射角。视野的中心沿光传播的方向偏移，其取决于高折射率液体层的厚度。在经过合适的光学滤镜后，用外部透镜把荧光发射放大3倍，由同一物镜收集并成像于可购买获得的EMCCD摄像机(Andor iXon BV887)。用供应商提供的Andor Solis软件或定制编写的软件来进行成像。
样本固定
DNA分子[57bp]购自IDT Tech，在5’端具有生物素共轭，在从5’端起的位置20处具有胺修饰的胸腺嘧啶碱基。用供应商的方法，以ATTO647N染料分子[ATTO-tech]标记DNA分子。用生物素-链霉亲和素化学法把DNA分子固定在氮化硅表面。用新鲜制备的Piranha溶液(在容积比为7∶3的硫磺酸和过氧化氢溶液中清洗15分钟)清洁表面，再用DI-水充分冲洗。在0.1mg/ml的BSA-生物素中培养表面过夜，用结合缓冲液[10mM Tris-CL pH8.5]冲洗，在0.1mg/ml的链霉亲和素中培养30～60分钟，用结合缓冲液冲洗，再以生物素标记的DNA培养15～30分钟。接着，表面被安装在流体室内。在盖玻片和硅芯片之间的trnas微通道内充70％甘油，并在cis腔内充结合缓冲液。然后在氮化硅界面处用TIRFM把表面成像。
结果
如图4所示，氮化硅膜(例如，尺寸为20*40μm2，厚度为20nm)安装在盖玻片上。选择trans和cis腔内的两种液体分别为甘油70％(v/v)(n＝1.42)和水(n＝1.33)。
如图5所示，把激励激光束整形至形成小于膜尺寸的隐失照明场。通过降低光束直径至0.7mm，光斑尺寸小于SiN膜的尺寸。
进入物镜(n＝1.55)的光传播经过浸镜油(n＝1.52)、盖玻片(n＝1.55)、液体2(70％甘油)(n＝1.42)，穿过界面，最终穿过水(n＝1.33)。该光束在界面处发生全内反射，该界面把甘油和水分开。
为了校准激励场的几何尺寸，在膜的cis侧吸收20nm的TMR珠，并在TIRF模式下成像。通过沿X和Y轴移动这些TMR珠，以及利用成像光学组件的放大因子，计算获得隐失照明场大约为10*20μm2。
在该例子中，用生物素-链霉亲和素化学(即方法和材料)，把在3’生物素化并在5’以ATTO647N标记的单个的DNA分子固定在氮化硅表面的cis侧。
例2
TIRF设置
在实验中，包括独立的SiN膜(20*20μm2)1124的硅芯片1128被用作界面，其中，该SiN膜具有纳米孔600。该硅芯片1128被安放在盖玻片1140上，而该盖玻片1140被安放在定制的三氟氯乙烯(CTFE聚合物)流体室1138上，以产生如图11所示的微流体trans腔1100。该流体室1138包括保持硅芯片1128的嵌入件1138a和外细胞1138b，以形成所述流体腔。快速硬化的聚二甲硅氧烷(PDMS)薄层被用于把硅芯片1128和CTFE嵌入件1138a粘合，以及把盖玻片1140和外细胞1138b粘合。具有嵌入件1138a的流体腔是cis腔，而硅芯片1128和盖玻片1140之间的空间是trans腔。利用输入-输出流通道在trans腔内充折射率缓冲液1112。为了进行电测量，在流通道的侧开口内提供trans电极1140a，cis电极1140b被浸入嵌入件(均为Ag/AgCl)1116内的缓冲液。如图11A所示，纳米孔600用于把流体室1100与倒置显微镜1136对齐，以进行光学成像和测量。
cis腔内使用的缓冲液nw≈1.33(水缓冲液，1M KCl和10mM tris，pH 8.5)和trans腔内使用的缓冲液(具有较高折射率nCs的水性缓冲液)的折射率小于玻璃的折射率ng＝1.5(nw＜nCs＜ng)。更具体的，含有7M CsCl和10mM tris的pH 8.5的盐缓冲液(“Cs7M”，n＝1.4)被用作cis腔内的缓冲液。
如图11B所示，以小于玻璃/trans腔界面的临界反射角但稍大于trans/cis临界角的角度θg从盖玻片侧引入平行光束，以在SiN膜处产生TIR激励。用大数值孔径(NA)的物镜(Olympus 60X/1.45)来实现TIR，通过把入射激光束聚焦在其后焦面(d)上的轴外点上，从而控制入射角θg。TIR激励区域的平面位置被位移距离d＝h*tan(θCs)，其中，h是trans腔的高度。
用长焦距的消色差双合透镜(200mm)整形入射激光束的宽度，使得SiN膜上被照明的面积大约为10*20μm2。通过单模保偏光纤把640nm激光器(20mW)(iFlex2000，Point-Source，英国)耦合至系统，产生直径为0.7mm的准直高斯激光束。这样的高质量光束保证了物镜入口处的紧聚焦点，从而降低不希望的散射。用普通工艺在膜表面的cis侧用链霉亲和素涂层。每一个均标记有单个的ATTO647N荧光团的短的生物素化的DNA寡核苷酸被固定在膜表面，并通过把荧光投射在工作在最大EM增益和10ms积分下的电子倍增CCD摄像机上进行成像。电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)摄像机(Andor，iXonDU-860)被用于记录来自膜表面的荧光图像。图12展示了根据本发明一个实施例的，在TIRF下成像的，固定在膜表面的单个的分子的三个典型的图像。如图12所示，以高对比度分辨了单个的荧光团，从而无需进一步的图像处理。
随着入射角的提高，TIR的临界角导致(1)在膜的cis侧观察到的激光的突然消失，(2)出现移位的TIR激光束，用显微镜的目镜在物镜的后焦面上成像，以及(3)背景强度的突然降低，这为单个的分子成像提高了信号/背景比。在落射光照明下(从样本的一侧照明和探测)，实现了固定在SiN膜上的单个的荧光团的图像的信号/背景比的≥2倍的提高。
光和电信号的同时探测
为同时探测光和电信号设计了硬件(如兼容微软Windows或Linux的个人计算机)和LABVIEW软件的组合。图13示意性地展示了获取硬件。Axopath 200B放大器1386(Molecular Devices公司，Sunnyvale，加利福尼亚州，美国)通过探头1388连接至Ag/AgCl电极，以放大穿过纳米孔的离子电流信号。用外部四极巴特沃斯滤波器1390在50KHz处对离子电流信号进行低通滤波，并输入PC内的多功能数据采集卡1392，该PC通过数据采集卡1394(Andor iXon采集卡)从CCD摄像机接收图像数据。该多功能数据采集DAQ卡1392(National Instruments，PCI-6154)在16比特模数转换分辨率下获取离子电流信号。来自EM-CCD摄像机1384的“触发”脉冲(表示每一曝光开始的TTL脉冲)触发离子电流采集，并用于在计数卡(National Instruments，PCI-6602)上产生精确的时间戳。利用具有250KHz时钟频率的RTSI总线在内部使计数卡与DAQ卡同步。因此，组合的数据流包括每一CCD帧开始时的唯一时间戳，其与离子电流采样同步。当通过离子电流的下降探测到易位事件，软件1396在计数信息中搜索相应的帧号，并存储对应该帧号的实际图像。摄像机的帧速率被设置为大约1KHz(触发脉冲频率)。
图14A～C展示了电和光信号的同步。由信号发生器产生的毫秒长的电子脉冲被电耦合至所述放大器探头。这些电流脉冲的形状和时间量程与纳米孔信号相似。用同样的信号开/关调制激励激光器，提供同步的光源和电子脉冲。为了进行同步测试，荧光珠被固定于所述膜上，并用以上描述的摄像机成像。
在DNA通过纳米孔易位的过程中，组合这两种模式来测量同步的光和电信号。首先在所述膜上确定孔的位置。来自孔的荧光信号在位置上是稳定的，并且与所述电信号同步点亮。这样，对应孔位置的像素随时间累积最高的荧光强度，这些图像的总和在对应该孔在CCD上的位置处展示了一峰值。一旦确定了该孔的位置，来自对应该孔的像素的强度被用于进一步的数据分析。
例3
实施光和电信号的同时测量，以探测穿过4nm孔的以荧光团标记的dsDNA。在该实验中，样本浓度为0.1nM～0.2nM。图15A～15B示意性地展示了孔的几何尺寸以及大约为4nm的孔的例子的TEM照片。在与胺基反应性染料共轭之前的酶聚合链反应(PCR)过程中，采用与低浓度胺基修饰的胸腺嘧啶碱基结合的以Alexa647荧光团标记的421bp片段(DNA-A1647)。
如图16A～16B所示，展示了当在孔的cis侧加了DNA-A1647分子后，九个有代表性的离子电流及其对应的荧光强度(200mV偏压产生4nA的开孔电流；在最大EM增益下，以1ms积分获取图像)。按以上描述的方法确定孔的位置。所展示的荧光强度是从CCD上以纳米孔为中心的3*3像素区域提取获得。可以理解，电流和光学数据的同步采集有助于为每一事件定义内部背景阈值。电事件之前大约5ms时，孔位置处的强度被作为该事件的背景值。只有其中孔位置处的强度比对应的背景高出至少一个标准偏差的光事件才被包括在分析中，以保证该事件具有有意义的背景阈值，以消除乱真信号。
可以理解的，以上详细描述和后续的例子只是为了说明本发明，而非限制本发明的范围。对于业界的技术人员而言，在不超出本发明的精神和范围的前提下，很容易对所披露的实施例进行各种改动和修改。另外，出于描述和披露的目的，所有指出的专利、专利申请以及发表的内容被明确地并入本申请，比如，这些发表中所描述的方法学可以被用于本发明。这些发表在本申请的申请日之前被提供。但这不应被理解为承认由于先发明或其他原因使得发明人对这些披露没有权利。有关该日期的声明以及有关这些文件的内容的描述是基于申请人能够获得的信息，并不构成对于该日期或这些文件的内容的修改的承认。

Claims (71)

1.一种用于光学显微工具的流体室，包括：
固态膜，具有第一侧和相对的第二侧；
第一流体腔，位于所述膜的第一侧，该第一流体腔包括具有第一折射率的第一液体；以及
第二流体腔，位于所述膜的第二侧，该第二流体腔包括具有第二折射率的第二液体，其中，所述第一折射率高于所述第二折射率。
2.如权利要求1所述的流体室，其中，所述固态膜包括氮化硅。
3.如权利要求1所述的流体室，其中，所述固态膜包括单层介电材料。
4.如权利要求1所述的流体室，其中，所述固态膜包括多层介电材料。
5.如权利要求1所述的流体室，其中，所述固态膜包括沉积在硅晶圆上的氮化硅层。
6.如权利要求5所述的流体室，其中，所述氮化硅层的厚度为5～60nm。
7.如权利要求5所述的流体室，其中，所述硅晶圆包括窗口，而所述氮化硅层覆盖该窗口。
8.如权利要求1所述的流体室，其中，所述第一液体包括水性缓冲溶液、水或尿素。
9.如权利要求1所述的流体室，其中，所述第二液体是选自以下组：细胞液、细胞膜、甘油和CsCl。
10.如权利要求1所述的流体室，其中，所述第一液体和第二液体是水性缓冲液。
11.如权利要求1所述的流体室，其中，在所述膜的第二侧提供有连接至光学生物标记的生物分子。
12.如权利要求11所述的流体室，其中，所述生物分子包括DNA分子。
13.如权利要求11所述的流体室，其中，所述生物分子包括RNA分子。
14.如权利要求11所述的流体室，其中，所述生物分子包括蛋白分子。
15.如权利要求11所述的流体室，其中，所述光学标记包括可激发的荧光团。
16.如权利要求1所述的流体室，其中，所述第一流体腔是微通道。
17.如权利要求1所述的流体室，其中，所述固态膜包括至少一个纳米孔。
18.如权利要求1所述的流体室，其中，所述固态膜包括多个纳米孔。
19.如权利要求1所述的流体室，其中，所述固态膜包括至少一个纳米缝隙。
20.如权利要求17所述的流体室，其还包括第一和第二电极，被配置成施加跨越所述第一液体和第二液体的电势，以驱动待成像的生物分子穿过所述纳米孔。
21.一种用于把单个的DNA分子成像的光学显微工具，包括：
流体室，包括覆盖硅晶圆的窗口的固态膜，位于所述固态膜一侧的第一流体腔，所述第一流体腔内的具有第一折射率的第一液体，位于所述膜的另一侧的第二流体腔，以及所述第二流体腔内的具有第二折射率的第二液体，其中，所述第二折射率低于所述第一折射率；
盖玻片，所述流体室安置于该盖玻片上，使得该盖玻片形成所述第一流体腔的底面；
物镜；
所述TIRF物镜和所述盖玻片之间的浸镜油；
光源，被配制成把光导向所述物镜，所述物镜被配置成把所述光聚焦，使得产生小于所述固态膜覆盖的窗口的隐失照明场；以及
成像探测器，探测位于所述固态膜的单个的DNA分子所发射的光。
22.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括氮化硅。
23.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括氧化硅。
24.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括沉积在硅晶圆上的氮化硅层。
25.如权利要求24所述的光学显微工具，其中，所述氮化硅层的厚度为5～50nm。
26.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述第一液体包括水性缓冲溶液或水。
27.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述第二液体选自以下组：细胞液、细胞膜和甘油。
28.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述光源包括激励激光束。
29.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，用生物素-链霉亲和素化学法把单个的DNA分子固定在所述固态膜上。
30.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述单个的DNA分子连接至光学生物标记。
31.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括至少一个纳米孔。
32.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括多个纳米孔。
33.如权利要求21所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括至少一个纳米缝隙。
34.如权利要求31所述的光学显微工具，其还包括第一和第二电极，被配置成施加跨越所述第一液体和第二液体的电势，以驱动待成像的生物分子穿过所述纳米孔。
35.一种用于把单个的生物分子成像的光学显微工具，包括：
在固态膜处产生隐失照明场的装置，该固态膜位于具有不同折射率的第一和第二液体之间；以及
探测由光学探测标记发出的光，该光学探测标记连接至位于固态膜处的单个的生物分子。
36.如权利要求35所述的光学显微工具，其中，所述单个的生物分子包括DNA分子。
37.如权利要求35所述的光学显微工具，其中，所述在固态膜处产生隐失照明场的装置包括激励激光器和物镜。
38.如权利要求35所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括沉积在硅晶圆上的氮化硅层。
39.如权利要求38所述的光学显微工具，其中，所述氮化硅层的厚度为5～50nm。
40.如权利要求38所述的光学显微工具，其中，所述硅晶圆包括窗口，而所述氮化硅层覆盖该窗口。
41.如权利要求35所述的光学显微工具，其还包括把所述单个的生物分子固定在所述固态膜上的装置。
42.如权利要求35所述的光学显微工具，其中，所述隐失照明场小于所述固态膜的尺寸。
43.如权利要求35所述的光学显微工具，其还包括使至少一个所述单个的生物分子穿过所述固态膜上的纳米孔的装置。
44.一种把单个的生物分子成像的方法，包括：
在固态膜处产生隐失照明场，该固态膜位于具有不同折射率的第一和第二液体之间；以及
探测位于所述固态膜处的所述单个的生物分子所连接的光学探测标记所发出的光。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述固态膜包括沉积在硅晶圆上的氮化硅层。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述氮化硅层的厚度为5～50nm。
47.如权利要求45所述的方法，其中，所述硅晶圆包括窗口，而所述氮化硅层覆盖该窗口。
48.如权利要求44所述的方法，其还包括把所述单个的生物分子固定在所述固态膜上。
49.如权利要求44所述的方法，其中，所述隐失照明场小于所述固态膜的尺寸。
50.如权利要求44所述的方法，其还包括使至少一个所述单个的生物分子穿过所述固态膜上的纳米孔。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述至少一个单个的生物分子是DNA分子，所述方法还包括：
把所述DNA分子转化成DDP；
把所述DDP与带有所述光学探测标记的代表核苷酸A、T、U、C或G的序列进行杂交；
电泳驱动至少一个所述生物分子穿过所述纳米孔。
52.一种把单个的DNA分子成像的方法，包括：
把光导向光学显微工具的物镜；
引导所述光穿过第一液体；
在氮化硅膜处反射所述光，以在第二液体内产生隐失照明场；以及
引导由光学生物标记发射的光至成像探测器，其中，所述光学生物标记连接至所述单个的DNA分子并由所述隐失照明场激发。
53.如权利要求52所述的方法，其中，所述第一液体的折射率高于所述第二液体的折射率。
54.如权利要求52所述的方法，其中，所述隐失照明场是在所述第二液体内产生。
55.如权利要求52所述的方法，其中，所述单个的DNA分子是固定在所述氮化硅膜上。
56.如权利要求55所述的方法，其中，所述单个的DNA分子是固定在所述氮化硅膜上第二液体内。
57.如权利要求52所述的方法，其还包括使所述单个的DNA分子穿过所述氮化硅膜上的纳米孔。
58.一种光学显微工具，包括：
流体室，包括覆盖硅晶圆的窗口的固态膜，位于该固态膜一侧的第一流体腔，该第一流体腔内的具有第一折射率的第一液体，位于所述固态膜的另一侧的第二流体腔，以及该第二流体腔内的具有第二折射率的第二流体，其中，所述第二折射率低于所述第一折射率；
盖玻片，所述流体室安置于该盖玻片上，使得该盖玻片形成所述第一流体腔的底面；
聚焦透镜；
光源，被配置成把光导向所述聚焦透镜，该透镜被配置成聚焦所述光，使得产生的隐失照明场小于所述固态膜覆盖的所述窗口；
物镜，位于所述第二流体腔上方，并被配置成聚焦由所述固态膜处的光学生物标记所发射的光；以及
成像探测器，探测由所述光学生物标记发射的光。
59.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括氮化硅。
60.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括氧化硅。
61.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括沉积在硅晶圆上的氮化硅层。
62.如权利要求61所述的光学显微工具，其中，所述氮化硅层的厚度为5～50nm。
63.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述第一液体包括水性缓冲溶液或水。
64.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述第二液体选自以下组：细胞液、细胞膜和甘油。
65.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述光源包括激励激光束。
66.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，采用生物素-链霉亲和素化学法，把连接至所述光学生物标记的单个的DNA分子固定在所述固态膜上。
67.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述光学生物标记连接至单个的DNA分子。
68.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括至少一个纳米孔。
69.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括多个纳米孔。
70.如权利要求58所述的光学显微工具，其中，所述固态膜包括至少一个纳米缝隙。
71.如权利要求68所述的光学显微工具，其还包括第一和第二电极，被配置成施加跨越第一液体和第二液体的电势，以驱动连接至所述光学生物标记的待成像的生物分子穿过所述纳米孔。
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