CN106460034B - 具有高准确度的单分子分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分析单分子、特别地用于单个核酸分子的测序的方法。

Description

具有高准确度的单分子分析
描述
本发明涉及用于分析单分子，特别是用于单个核酸分子的测序的方法。
对近3×109个碱基组成的人类基因组、或其它生物体的基因组的测序，以及单个序列变体的测定和比较需要提供测序方法，所述方法首先是快速的，其次可被常规且成本效益地应用。已作出巨大的努力来加速熟悉的测序方法(例如根据Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74(1977),5463)的酶链终止法)，特别地通过自动化(Adams等，Automated DNA Sequencing and Analysis(1994),New York,Academic Press)。
对具有成本效益的测序的高度需求已经驱动着平行测序方法从而同时产生多个序列的高通量测序技术的发展。这些测序技术的实例是大规模平行指纹测序(LynxTherapeutics)、聚合酶克隆(polony)测序(Life Technologies)、454焦磷酸测序(RocheDiagnostics)、Illumina测序(Solexa Inc.)、连接法测序(Life Technologies)、离子洪流半导体测序(Life Technologies)或DNA纳米球测序(Complete Genomics)。这些技术允许快速分析核酸群中的共有序列。然而，存在于待分析的核酸群中的少数序列中(例如少数细胞基因组中)的突变将不会被检测到，因为它们被存在于群中的大多数其它序列所掩盖(obscured)。
另一个方法是单分子测序(
Figure BDA0001079455620000011
等，Bioimaging 5(1997),139-152)，其中通过荧光标记的单链DNA分子的渐进式酶促降解(progressive enzymatic degradation)和通过在微观结构通道中连续释放的单体分子的检测进行核酸的测序。该方法具有仅单分子靶核酸就足以进行序列测定的优点。
PCT/EP01/07462公开了多重测序法(multiplex sequencing process)，其包括以固定的形式提供在载体上具有多个荧光标记基团的核酸分子，和基于所述核酸分子和/或切掉的核苷酸构件块的时间依赖性荧光变化(当所述核苷酸构件块被切掉时引起的)同时测定多个核酸分子的碱基序列。根据WO 2003/052137，通过将光照射至载体上，并通过固定的核酸分子区域中的载体表面上的内反射产生倏逝激发场来测定序列。
WO 2006/013110描述了多重测序法，其包括以固定的形式提供核酸降解和/或核酸合成酶分子，将固定的酶与游离核酸分子接触，以及基于时间依赖性荧光变化(当核酸构件块被掺入核酸分子和/或从核酸分子切掉时引起的)同时测定多个核酸分子的碱基序列。
WO 2013/131888公开了用于核酸分子(特别地在单个分子中)的平行高通量测序的方法，所述方法涉及环状核酸模板分子的使用。
最近，已开发了用于测定单个DNA链的序列的单分子测序技术，例如heliscope单分子测序(Helicos Biosciences)或单分子实时测序(Pacific Bioscience)。
目前的商业单分子DNA测序技术的方法涉及DNA序列的所谓的共有序列测定(consensus determination)。这意味着其意欲通过分析若干相似DNA片段和通过使用复杂性统计算法(complex statistical algorithms)评估正确的DNA序列来提供DNA片段序列的准确测定(优选99.9％或更好)。这些算法基于在待分析的样品中只存在单个序列的假定。因此，如果在样品中存在与所述样品中另外的DNA分子区别在于它们的序列的少数序列变体，则这样的少数序列变体将不会被考虑，而是会通过算法被处理为“噪声”或“误差”。如果样品含有浓度大致相同的不同DNA序列变体的混合物，则基于算法的分析将不能得出“共有”序列并且结果将作废(无效)。然而复杂性算法的使用是补偿目前的商购可得的单分子DNA测序技术只具有约85-90％的低初始准确度(primary accuracy)所必需的。
为了克服与现有测序方法相关的准确度问题，本发明提供了获得足够的精密度以允许分析单个链突变以及它们在DNA分子群中的分布的单分子测序方法。
因此，本发明提供了用于分析单分子，特别地用于分析多个单分子，更特别地用于对单个核酸分子进行测序的方法和设备，所述方法和设备包括以特性：
-载体，其具有至少一个样品点以用于将待分析的单分子放置在载体上，
-光源，特别是多点式激光，其在载体上的至少一个单分子的位置上提供至少一个照射体积元(illuminated volume element)，例如共聚焦体积元，和
-检测器，特别是多像素检测器，其允许从载体上的单个单分子进行单光子检测。
通过光源、载体和检测器之间的光学路径，检测器上(即图像平面中)的检测像素被光学投影至载体上，即至物体平面上。由此，图像平面中的检测像素的尺寸相较于检测像素在载体上的光学投影的尺寸被放大，例如10-200倍，优选40-120倍。
根据本发明，将载体上的样品点与单个检测像素的光学投影、优选与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。样品点的中心与像素投影中心之间的对齐优选被以例如5nm或更小，2nm或更小或甚至1nm或更小的公差(tolerance)提供。可通过衍射光学元件和/或调整元件来提供对齐。这样将样品点定位在载体上以及这样将像素光学投影在载体上以使得载体上的单个样品点之间的距离优选等于像素在载体上的光学投影之间的距离。由此，来自单个检测器像素的信息之间的串扰被避免，并且可通过单次测量和任选地多达10次，例如1、2、3、4或5次测量重复，以高准确度，优选以至少99.0％、至少99.3％、至少99.6％或至少99.9％的准确度分析单个单分子。
本发明的进行DNA测序的方法是具有优选至少99.9％的初始准确度的单分子DNA测序的方法。由于该方法是高度准确的，因此每一个单个DNA分子的序列被正确读取，并且无需超过可能数次例如1、2或3次重复的每一个单个DNA分子的测量来获得几乎100％的准确度。“共有”序列的概念不适用于本DNA测序，并且不需要复杂性算法来解释测量数据。
假如初始准确度(即单碱基的成功鉴定的概率)为p(0<p<1)，则当对长度为N个碱基对的DNA片段测序时以ε(0<ε<1)的准确度获得测序结果所需的测序轮的平均轮数为
Figure BDA0001079455620000031
在下文表1中，方程式(1)用于计算长度分别为100个碱基对和1000个碱基对的DNA片段的所需测序轮数。
表1:本技术对比其它DNA单分子测序技术的比较概述
Figure BDA0001079455620000041
获得准确读出所需的重新测序轮数的计算(方程式1的推导)
定义p为初始准确度＝单碱基的成功鉴定的概率。p是定义在0至1的闭区间中的实值数。
N为待测序的DNA分子中的碱基数。N为正整数。
pseq为N个碱基的完整序列被正确读取的概率。pseq为定义在0至1的闭区间中的实值数。则：
pseq＝pN (2)。
定义r为该方法将从给定的DNA分子分析和读出DNA序列的次数。R为正整数。R还可被称为“重新测序轮数”。
那么每r轮进行的测序中至少一个读出将是正确的概率ε通过下面的方程式给出:
Figure BDA0001079455620000051
ε为0与1之间的闭区间中的实值数。
在方程式(3)中的插入方程式(2)得到
ε＝1–(1–pN)r，其等于
1-ε＝(1–pN)r (4)。
此外，通过对方程式(4)的两边运用对数函数得到
ε＝1-(1-pN)r其等于
1-ε＝(1-pN)r (4)。
此外，通过对方程式(4)的两边应用对数函数得到
log(1-ε)＝log((1-pN)r)其等于
log(1-ε)＝rlog((1-pN))其等于
Figure BDA0001079455620000052
本发明涉及用于分析单分子的方法，其包括以下步骤：
(a)提供至少一个定位在载体的单个样品点处的待分析的单分子，其中所述点具有在约1nm–20nm的范围内的直径并且每一个单个点之间的距离为点直径的至少约2倍，优选约3-10倍，
(b)用光源单个地照射单个样品点处的单分子，其中所述光源在样品点上提供至少一个照射体积元，
(c)利用光检测器单个地检测来自所述单分子的光，所述光检测器包含至少一个检测像素，其中检测器上的所述检测像素具有在约0.5μm-50μm的范围内的直径，并且每一个检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少约2倍，优选约3-10倍，特别地至少3倍或至少5倍，和
(d)使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，
其中检测像素在载体上的光学投影具有在约100nm-5μm的范围内的直径并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影，特别地与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。
本发明特别地涉用于分析单分子的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供多个待分析的单分子，每一个单分子被定位在载体上的单个样品点处，其中所述点具有在约1nm-20nm的范围内的直径，并且单个点之间的距离为所述点的直径的至少约2倍，优选约3-10倍，
(b)用光源单个地照射单个样品点上的单分子，其中所述光源在样品点处提供多个单个的照射体积元，
(c)利用光检测器单个地检测从所述单分子发射的光，其中所述光检测器包含多个检测像素，其中检测器上的所述检测像素具有在约0.5μm-50μm的范围内的直径，并且所述检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少约2倍，优选约3-10倍，特别地至少3倍或至少5倍，和
(d)使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，
其中检测像素在载体上的光学投影具有在约100nm-5μm的范围内的直径并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影，特别地与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。
本发明的方法涉及单分子的分析，特别地涉及多个单分子的平行分析。其适合用于检测相互作用，例如单分子之间的结合和/或反应，例如单分子的延伸或降解。特别地，本发明的方法涉及单个核酸分子的测序。
在本发明中，提供了包含至少一个样品点和特别地多个单个的样品点(以用于将待分析的单分子定位在其上)的载体。所述点可具有在约1-20nm，例如约2-15nm或约4-12nm的范围内的直径。为了避免单个点之间的串扰，载体上单个样品点的中心之间的距离(即样品点距离)优选为点直径的尺寸的至少约2倍，至少约3倍，至少约5倍以上，至少约10倍，诸如约3倍-10倍，或约20倍至500倍，例如约50倍至400倍。样品点距离优选为约50nm-5000nm，例如约150nm-3000nm。
可将待分析的单分子结合于载体的表面。在其它实施方案中，不将待分析的单分子结合于样品点处的载体表面，而是以游离形式存在，或结合于位于样品点处的纳米颗粒，例如具有例如约0.5-20nm，优选约1-5nm的直径的颗粒。
为了照射载体上单个样品点处的单分子，可使用适合用于多点照射的光源，例如激光光源。优选地，光源是多点光源，例如多点激光光源。光源能够在单个样品点处提供多个单个的照射体积元。体积元具有10-10至10-24l，例如10-12至10-24l的尺寸。体积元可以是共聚焦体积元或由通过全内反射(TIR)获得的倏逝场提供的体积元。优选地，由通过全内反射(TIR)获得的倏逝场提供体积元。
本发明的方法包括检测从定位在载体上的单分子发射的光。优选地，从光学上可检测的标记基团，特别地从荧光标记基团发射检测光。随后用光检测器检测发射光，将发射光与定位在载体上的单个点的单分子相关的事件相关联。
发射光的检测可包括检测激发状态的寿命，和/或检测自旋运动和/或检测侧向运动和/或检测特定波长。此外，可使用基于拉曼光谱、拉曼光谱/Antistokes和/或表面增强拉曼光谱(SER)的检测方法来鉴定单分子。优选地，发射光的检测包括任选地与特定波长的检测组合的寿命检测。例如，已显示，如果它们的平均寿命相差约一纳秒，则可以0.998的准确度区分不同的组分。
待检测的事件可由例如标记基团与待分析的单分子的缔合和/或解离或由引起光发射的时间依赖性变化例如时间依赖性荧光变化的任何其它事件导致。
照射体积元(例如共聚焦体积元)激发存在于所述体积中的标记基团，以使得它们发射光(例如荧光)，其通过检测器进行测量。被照射的体积元的图案可由经由衍射光学元件产生的激光点的矩阵(例如，如WO2002/097406(其内容通过引用并入本文)中描述的)，或量子阱激光产生。优选地，光源是多点光源，例如多点激光光源。光源能够适当地通过在光路中应用适当的光学元件来在单个样品区域提供多个单个照射体积元。体积元可具有10-10至10-24l，例如10-12至10-21l的尺寸。
在优选实施方案中，将光照射至载体中，借以通过待分析的分子区域中载体表面处的内反射产生倏逝激发场。待分析的分子区域中载体表面的一个或多个位置上的内反射产生引起存在于各自点中的标记基团的激发的倏逝激发场。在特别优选实施方案中，检测包括全内反射(TIR)，特别是全内反射荧光(TIRF)检测。
衍射光学元件(DOE)可用于在载体上提供多点照射。DOE还可用于涉及内反射的检测方法，例如通过将衍射光学元件引入TIR(F)装置中的激发光束中。
根据本发明，利用光检测器检测从单分子发射的光，所述光检测器包含多个与载体上的样品点矩阵对齐的检测像素。优选地，所述检测器是多点单光子雪崩检测器(SPAD)。它将在宽光谱范围(例如350-900nm)内的高灵敏度与例如≤1ns的高时间分辨率组合，当将把激发荧光状态的寿命用于分子分析时，这是有利的。
为了进行标记基团例如荧光标记基团的精确鉴定，优选将激发状态的寿命与特定波长的发射一起测定。所述寿命优选在1-6ns的范围内。根据选自寿命、每分子的特征计数率(通过波长依赖性激光强度测定的)、激发系数(例如约105/M cm)、量子产率(例如0.3-0.9)和/或波长依赖性检测器灵敏度的参数的组合，可进行标记基团的鉴定而无需应用特定波长依赖性发射滤波器。
另外，优选地进行待分析的单分子的脉冲激发，以消除或减少由Raleigh和拉曼散射引起的漫射光以及三重态和光子漂白的形成。优选的脉冲激发时间短于1ns，例如，约50–500ps。
检测器上的单个检测像素的直径通常为约0.5μm-50μm。所述单个检测像素间隔以一定的距离(即像素间距长度)，其长度至少为所述像素的直径，优选为所述检测像素直径的至少约2倍，更优选至少约3-10倍。优选地，检测器上像素之间的距离为约2-200μm，更优选约4-150μm。
如上概述的，在载体上形成检测像素的光学投影。载体上的光学投影小至为检测器上的检测像素的尺寸的例如约1/10-1/200，或约1/40-1/120。因此，所述光学投影通常具有约20nm至约1μm，优选约100-600nm的直径。单个检测像素在载体上的投影中心之间的距离(即投影间距长度)优选为检测像素投影的直径的至少约2倍，优选约3-10倍，特别地至少3倍或至少5倍。基本上，单个点或载体之间的距离应当匹配检测器的每一个检测像素之间的距离。所述投影间距长度优选地等于样品点距离，例如约50-5000nm，优选约150-3000nm。
在优选实施方案中，本发明的方法用于单个核酸分子的测序。在该实施方案中，所述方法优选包括以下步骤：
-在载体的单个样品点处提供(i)单个核酸分子，(ii)核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子，和(iii)以游离形式存在的和/或掺入核酸分子中的荧光标记的核苷酸构件块，
-进行酶促反应，其中将核苷酸构件块掺入所述单个核酸分子中和/或从其切掉，和
-基于时间依赖性荧光变化(当核苷酸构件块被掺入所述单个核酸分子和/或从其切掉时引起的)单个地测定所述核酸分子的碱基序列。
核苷酸构件块至核酸分子的掺入以及核苷酸构件块从核酸分子的切掉均可引起标记基团的荧光发射的时间依赖性变化。
在涉及通过降解进行测序的实施方案中，将核酸降解酶分子与待测序的具有掺入的标记基团，特别是荧光标记基团的核酸分子接触。
在涉及通过延伸进行测序的实施方案中，将核酸合成酶分子与待测序的具有与其退火的引物的核酸分子和具有标记基团，特别是荧光标记基团的游离核苷酸构件块接触。
在一个实施方案中，可将核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子固定在例如载体上，或定位于载体上的纳米颗粒上。在另一个实施方案中，可将待测序的核酸分子固定在例如载体上或定位于载体上的纳米颗粒上。
在一个实施方案中，本申请涉及用于对单个核酸分子测序的方法，其包括以下步骤：
(a)以固定的形式提供至少一个核酸合成酶分子、环状或线性核酸模板、与所述模板退火或能够与所述核酸模板退火的引物和荧光标记的核苷酸构件块,
(b)在通过所述固定的核酸合成酶分子催化的引物延伸中，产生已掺入所述核苷酸构件块的与核酸模板分子互补的核酸分子，
(c)任选地将所述产生的核酸分子与核酸降解酶分子接触，并在由所述核酸降解酶分子催化的核酸酶降解中从所述产生的核酸分子切掉单个核苷酸构件块，和
(d)基于时间依赖性荧光变化(当在引物延伸过程中掺入核苷酸构件块和/或在核酸酶消化过程中切掉所述核苷酸构件块引起的)测定所述核酸模板分子的碱基序列。
在其它实施方案中，本申请涉及用于对单个核酸进行测序的方法，其包括以下步骤：
(a)以固定的形式提供核酸合成酶、环状或线性核酸模板分子、与所述模板退火或能够与所述核酸模板退火的引物和荧光标记的核苷酸构件块,
(b)在通过所述核酸合成酶分子催化的引物延伸中，产生已掺入所述核苷酸构件块的与所述固定的核酸模板分子的序列互补的核酸分子，
(c)任选地将所述产生的核酸分子与核酸降解酶分子接触，并在由所述核酸降解酶分子催化的核酸酶降解中从所述产生的核酸分子切掉单个核苷酸构件块，和
(d)基于时间依赖性荧光变化(当在引物延伸过程中掺入核苷酸构件块和/或在核酸酶消化过程中切掉所述核苷酸构件块引起的)测定所述核酸模板分子的碱基序列。
在其它实施方案中，本发明涉及方法，其包括以下步骤：
(a)提供至少一个固定形式的核酸降解酶分子、包含荧光标记的核苷酸构件块的核酸分子，
(b)将所述核酸降解酶分子与所述核酸分子接触，并在由所述核酸降解酶分子催化的核酸酶降解中从所述核酸分子切掉单个核苷酸构件块，和
(c)基于时间依赖性荧光变化(当在核酸酶消化过程中切掉核苷酸构件块时引起的)测定所述核酸分子的碱基序列。
在其它实施方案中，本发明涉及用于对单个核酸进行测序的方法，其包括以下步骤：
(a)提供至少一个包含荧光标记的核苷酸构件块的固定形式的核酸分子和核酸降解酶分子，
(b)将核酸分子与核酸降解酶分子接触，并在由所述核酸降解酶分子催化的核酸酶消化中从所述核酸分子切掉单个核苷酸构件块，和
(c)基于时间依赖性荧光变化(当在核酸酶消化过程中切掉核苷酸构件块时引起的)测定所述核酸分子的碱基序列。
本发明的方法是基于载体的多重测序法，其使得大量单个核酸分子能够被测序。这通过提供包含待测序的核酸分子和核酸降解酶和/或核酸合成酶的反应空间(用以在多个核酸合成和/或降解反应中平行测定时间依赖性荧光变化)来实现。优选以平行高通量单分子分析的形式进行所述方法。
在优选实施方案中，以固定的形式提供核酸合成酶分子。核酸降解酶分子也可以固定的形式或以游离形式存在。在又一些其它实施方案中，可使用核酸合成酶分子与核酸降解酶分子的杂交体和/或缀合物，例如通过双功能接头分子连接的基因融合物和/或缀合物。
在其它优选实施方案中，提供了具有大量固定形式的核酸分子的载体。在该实施方案中，可以游离形式使用核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子或其杂交体和/或缀合物。
用于所述方法的载体可以是任何平面载体或结构化载体。优选地，载体是平面的。合适的载体材料的实例是玻璃、石英、塑料、金属、半金属诸如硅，例如，金属氧化物诸如二氧化硅，例如，或包含所述材料的复合材料。载体可以至少在样品点的区域中具有足够的光学透明度和合适的表面性质，以进行利用荧光激发光和/或通过载体的荧光发射光的反向散射的照射，或进行基于倏逝的荧光检测。原则上，载体也可具有任意设计，只要能够形成反应空间，所述空间使得能够在液体反应混合物中将单个核苷酸构件块掺入与所述载体接触的核酸中和逐渐地从所述核酸切掉。
可在跨载体或其部分形成的单个反应空间中进行本发明的方法，酶或核酸分子被固定在所述载体上。或者，还可在跨载体的大量分开的反应空间中进行所述方法，其中分开的反应空间至少在所述方法的某些步骤过程中彼此互不连通。多个分开的反应空间可以例如通过载体上的纳米孔和/或微米孔和/或纳米点或微米点形成。
可通过共价或非共价相互作用固定酶或核酸分子。例如，特定结合对的伴侣例如生物素/链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、半抗原/抗半抗原抗体、糖/凝集素等之间的高亲和力相互作用可介导多肽或核酸的固定。因此，有可能将生物素化的酶或核酸分子偶联于包被链霉抗生物素蛋白的表面。或者，可通过吸附作用固定酶或核酸分子。因此，通过掺入烷烃巯醇基团修饰的酶或核酸分子可结合于金属载体，例如由金制成的载体。又一种替代方式是其中可以通过氧化硅(silica)表面上的反应性硅烷基团介导酶或核酸分子结合的共价固定。
根据本发明，分析至少一个单分子。优选地，分析多个单分子。这些分子位于载体上的样品点处。它们与样品液体接触，所述样品液体含有游离反应伴侣。因此，界定一个或多个反应空间。优选地，可在单个载体例如单个平面载体上分析至少100个，特别优选至少1000个，以及特别优选至少10 000个，以及至多超过106个分子。
将待分析的分子(例如酶或核酸分子)施加至载体表面上的特定点，例如通过将生物素化分子的稀释溶液与载体(只有其特定的区域包被有链霉抗生物素蛋白)接触。在其中将核酸降解酶分子固定的实施方案中，将它们与核酸合成酶分子共固定，即将两种类型的酶分子结合在载体表面的相同的点中。
序列有待测定的核酸分子可选自例如DNA分子诸如基因组DNA片段、cDNA分子、质粒等，或选自RNA分子诸如mRNA分子。核酸分子可来源于从细胞或生物体(例如真核或原核细胞或生物体)产生的基因组文库或表达文库。本发明的方法允许多个不同核酸模板分子，例如至少10个、100个、1.000个或10.000个和多达100.000个、106个或107个或甚至更多个不同的核酸分子的平行测序。
优选地，待测序的核酸分子是以线性或环状形式存在的(例如以共价连接的环状形式存在的)单链核酸分子。为了获得环状核酸模板，可将线性核酸分子在样品制备过程中经历环化操作和任选地链分离操作。环化可通过根据已知的操作方案的连接，例如使用DNA或RNA连接酶来实现。在一些实施方案中，可将衔接子和/或标识分子(即具有已知序列的核酸分子)偶联于核酸分子。
核酸分子的长度优选为20-100 000个核苷酸，特别优选20-50 000个核苷酸，更优选20-10 000，20-5000个核苷酸，特别优选50-2000个或100-1000个核苷酸。核酸序列测定可包括核酸延伸和/或核酸降解。测序方法包括一个或多个测序循环。
核酸合成酶分子能够延伸与核酸模板分子退火的引物。优选地，通过在正在生长的核酸链的3'-末端逐渐地掺入单个核苷酸构件块来进行引物延伸，其中产生与环状核酸模板的序列互补的核酸分子。核酸合成酶选自能够进行模板特异性核酸聚合的聚合酶，优选选自DNA聚合酶和RNA聚合酶，例如天然的或经修饰的聚合酶，包括热稳定性DNA聚合酶。
合适的DNA聚合酶的具体实例包括Taq聚合酶、外切核酸酶缺陷型Taq聚合酶、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、Klenow片段、逆转录酶、Φ29-相关聚合酶，包括野生型Φ29聚合酶和此类酶的衍生物，诸如外切核酸酶缺陷形式、T7DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、RB69聚合酶及其它聚合酶。
核酸降解酶分子能够从核酸分子逐渐切掉单个核苷酸构件块。优选地使用外切核酸酶，更优选地以3’→5’方向或以5’→3’方向降解的单链外切核酸酶。特别优选地使用的外切核酸酶是3'→5'外切核酸酶诸如，大肠杆菌外切核酸酶I和大肠杆菌外切核酸酶III，和5'→3'外切核酸酶诸如T7外切核酸酶、大肠杆菌外切核酸酶II和大肠杆菌外切核酸酶VIII。另外，可使用各种聚合酶(例如Klenow片段、Taq聚合酶或T4聚合酶)的外切核酸酶活性。
将核酸合成酶分子与线性或环状核酸模板分子(例如单链DNA或RNA)和与核酸模板分子退火或能够与其退火的引物分子接触。引物分子优选为具有游离3'-端的单链核酸或核酸类似物，其可通过由固定的核酸合成酶分子催化的酶促反应延伸。引物分子的长度被选择来允许在反应条件下与模板有效退火。通常，引物分子的长度为至少8个、至少10个、至少12个或至少15个核苷酸和例如至多20个、25个、50个或100个核苷酸，或甚至更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述引物耐受核酸降解酶分子的消化，例如通过在核苷酸构件块之间掺入核苷酸类似物构件块和/或键，其稳定耐降解。在其它实施方案中，引物对核酸降解酶分子的消化是敏感的。
选择引物的序列，以便其在反应条件下有效地与模板分子退火。例如，引物可以是能够在统计上与未知核酸序列退火的通用简并引物。在其它实施方案中，引物可以能够与核酸模板分子的已知序列部分退火。在该实施方案中，可将已知的衔接子和/或标识序列掺入核酸模板分子。引物可以未被标记或包含荧光标记基团。
另外，需要具有至少一个荧光标记基团的核苷酸构件块的存在。优选地，每一个不同的核苷酸构件块(A、G、C、T/U)含有不同的荧光标记基团。
荧光标记基团可选自用于标记生物多聚体，特别是核酸的已知荧光标记基团，诸如，例如，荧光素、罗丹明、噁嗪，例如Evoblue或Gnothis Blue、藻红蛋白、Cy3、Cy5、IR染料或其衍生物等。
核苷酸构件块可携带(i)当构件块在由核酸合成酶分子催化的引物延伸过程中被掺入核酸分子时与构件块一起保留的荧光标记基团，和/或(ii)当构件块在通过核酸合酶分子催化的引物延伸过程中被掺入核酸分子时从构建块切掉的荧光标记基团。与构件块一起保留的荧光标记基团优选地被附接于α-磷酸基团，糖和/或核碱基基团。优选地，与构件块一起保留的荧光标记基团例如，通过可具有达到15个，优选10至12个碳原子的链长度，任选地包括杂原子例如N、O或S原子的接头附接于核碱基。可将当构件块被掺入核酸分子时被切掉的荧光标记基团附接于例如，六、五、四或三磷酸构件块的末端磷酸基团，诸如三磷酸构件块的γ-磷酸基团。在某些实施方案中，选择构件块，其含有以下二者：(i)在掺入后保留的荧光标记基团和(ii)在掺入过程中被切掉的荧光标记基团。在该情况下，可选择能够例如通过猝灭和/或能量转移彼此相互作用的荧光基团。
如果将核酸分子经历使用核酸降解酶分子的直接测序，则待测序的核酸分子将含有荧光标记基团。在另一方面，如果核酸分子在引物延伸中被用作模板，则待测序的核酸分子可不含荧光标记基团。
本发明的方法可涉及在由核酸合成酶分子催化的引物延伸中产生具有掺入的核苷酸构件块的核酸分子的步骤，和/或由核酸降解酶分子催化的从所产生的核酸分子切掉单个核苷酸构件块的第二步骤。取决于荧光标记的类型，可在引物延伸过程中和/或在降解过程中进行核酸序列测定。
在引物延伸过程中进行的序列测定涉及具有荧光标记基团的核苷酸构建块的使用，所述荧光标记基团在核苷酸构建块被掺入核酸分子时被从所述构建块切掉。在该情况下，可测定通过从核苷酸构件块切掉荧光标记基团引起的时间依赖性荧光变化。在核酸降解过程中进行的序列测定涉及核苷酸构件块的使用，所述核酸构件块具有当核苷酸构件块被掺入核酸分子时与其一起保留的荧光标记基团。当标记的核苷酸构件块从核酸分子释放时，单个核苷酸构件块从核酸分子的逐渐切割引起时间依赖性荧光变化。在某些实施方案中，还可以在延伸和降解过程中(即当使用具有与构件块一起保留的荧光标记基团和当构件块被掺入核酸分子时被从所述构件块切掉的荧光标记基团二者的核苷酸构件块时)进行序列测定。在该实施方案中，两种荧光基团可以相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的方法涉及一个或多个循环的核酸合成和核酸降解，以测定核酸分子模板的碱基序列。核酸合成涉及由核酸合成酶分子催化的与核酸模板分子退火的引物的延伸，其中产生与核酸模板序列互补的核酸分子。在下一步骤中，所产生的核酸分子被核酸降解酶分子降解。
当核苷酸构件块被掺入延伸的核酸分子时，可发生荧光的时间依赖性变化，这可如上所指示的进行检测。优选地，核苷酸构件块至延伸的核酸分子的掺入与荧光的可检测的增强、优选地与荧光的瞬时增强相关。例如，可使用在核苷酸的部分上(例如在γ-磷酸基团上)具有荧光标记基团的核苷酸构件块，当所述构件块被掺入引物时所述荧光标记基团被切掉。
当核苷酸构件块被从合成的核酸分子切掉时，可因核酸链中掺入的荧光标记基团与相邻基团，例如与核酸的化学基团，特别是核碱基诸如G和/或相邻的荧光标记基团的相互作用而检测荧光的时间依赖性变化，并且这些相互作用导致相较于以“分离的”形式存在的荧光标记基团荧光，特别是荧光强度的变化，这归因于猝灭过程和/或能量转移过程。通过单个核苷酸构件块的切割进行的去除改变总体荧光，例如固定的核酸链的荧光强度，并且该变化是通过单个核苷酸构件块的切割进行的去除的函数，即时间的函数。
在某些实施方案中，标记的核苷酸与生物分子复合物的缔合通过测量发射的光子的极化来检测。激发状态的光子的极化被发射光的核苷酸标记的旋转运动改变，并且可用于鉴定在聚合过程中自由移动的相对结合(contra bound)的标记的核苷酸。
可平行记录大量核酸分子的延伸和/或降解过程中的荧光的时间依赖性变化，并将其与单个核酸链的碱基序列相关联。优先使用那些荧光标记基团，当被掺入核酸链时所述荧光标记基团被至少部分猝灭，以使得在含有标记基团的核苷酸构件块或引起猝灭的相邻构件块已通过切割被除去后荧光强度得以增强。
在单个核苷酸构件块的掺入和/或除去的过程中，归因于猝灭过程或能量转移过程，可以测量核酸链和/或所掺入或被切掉的核苷酸构件块的荧光强度的变化。该随时间的荧光强度的变化取决于所研究的核酸链的碱基序列，并因此可与序列相关联。
可通过使用在所有4种不同的碱基上例如A、G、C和T上，或两个或三个不同的碱基的组合上标记的核苷酸构件块的混合物来测定核酸分子的完整序列。在适当的情况下，可以例如使用连接酶和/或末端转移酶通过酶促反应将“序列标识”(即具有已知序列的标记核酸)附接于待研究的核酸链，以使得在测序开始时，最初获得已知的荧光模式，并且只有在此之后才获得对应于待研究的未知序列的荧光模式。
检测包括优选通过激光，或通过另一种适当的光源将光照射至载体中，以引起荧光标记基团的激发。就此而言，可以使用一个或多个激光束，例如具有约1-20mm的横截面的扩展激光束，和/或多个激光束。检测优选包括通过激光，例如经衍射光学(参考WO 2002/097406)或量子阱激光产生的激光点的点矩阵进行的多点荧光激发。
可使用检测器矩阵平行检测多个核酸链的荧光发射，所述检测器矩阵包含例如电子检测器矩阵，例如CCD照相机、CMOS检测器矩阵，例如CMOS照相机，或雪崩光电二极管矩阵。可以以对所有研究的核酸链平行进行荧光激发和检测的方式进行检测。对此的可能替代方式是在每一种情况下在若干步骤中研究核酸链的一部分。优先对通过反应空间或通过载体主体，基本上与载体表面正交地发射的荧光进行检测。
可以例如通过共聚焦单分子检测，例如通过荧光相关光谱学进行所述检测，所述检测涉及将非常小的、优选地共聚焦的体积元(例如10-21至10-10l)暴露于激光或另一种合适的光源的激发光，所述光激发存在于该测量体积中的受体，以使得后者发射荧光，通过光检测器测量从所述测量体积发射的荧光，并使随时间测得的发射的变化与分析物的浓度相关联，以使得可以在适当高的稀释度下鉴定所述测量体积中的单个分子。用于检测的操作和仪器的细节可见于欧洲专利0 679 251的公开内容中。在Rigler和Mets(Soc.Photo-Opt.Instrum.Eng.1921(1993),239ff.)以及Mets和Rigler(J.Fluoresc.4(1994)259-264)中进一步描述了单分子的共聚焦测定。
可替代地或另外，还可通过称为“时间选通(time gating)”的时间分辨衰减测量进行检测，所述测量是如，例如由Rigler等，“Picosecond Single Photon FluorescenceSpectroscopy of Nucleic Acids”在“Ultrafast Phenomenes”,D.H.Auston，编辑，Springer 1984中描述的。此处，在测量体积中激发荧光分子，随后优选以≥100ps的时间间隔，在光检测器上打开检测间隔。这样，有可能使由拉曼效应产生的本底信号保持足够低，以使得能够以基本无干扰的方式检测单分子。
本发明还涉及用于分析至少一个单个的单分子，例如用于对至少一个核酸分子测序的仪器，其包含：
(a)载体，其包含至少一个样品点以用于将待分析的单分子定位在单个点上，其中所述点具有在约1nm-20nm的范围内的直径，并且单个点之间的距离为点直径的至少约10倍，优选约20-500倍，
(b)光源，其在载体上的样品点处提供至少一个单个的照射体积元，以单个地照射单个点处的单分子，
(c)光检测器，其包含至少一个检测像素以用于单个地检测从单个点处的单分子发射的光，其中所述检测像素具有在约0.5μm–50μm的范围内的直径，并且所述检测像素之间的距离为检测像素直径的至少约2倍，优选约3-10倍，和
(d)装置，其用于使所检测的来自单个检测像素的信号与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，
其中检测像素在载体上的光学投影具有在约100nm-5μm的范围内的直径，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影，特别地与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。
本发明还涉及用于平行分析多个单个的单分子或多个单个的核酸分子的仪器，其包含：
(a)载体，其包含多个样品点以用于将待分析的单分子定位在单个点上，其中所述点具有在约1-20nm的范围内的直径，并且单个点之间的距离为点直径的至少约10倍，优选约20-500倍，
(b)光源，其在载体上的点处提供多个单个的照射体积元以用于单个地照射单个点处的单分子，
(c)光检测器，其包含多个检测像素以用于单个地检测从单个点处的单分子发射的光，其中检测器上的所述检测像素具有在约0.5μm-50μm的范围内的直径，并且所述检测像素之间的距离为检测像素直径的至少约2倍，优选约3-10倍，和
(d)装置，其用于使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，
其中点可包含载体表面上的区域，例如金属、半金属或硅烷的区域。
可通过金属诸如Au、Ag、Al、Cr、Ni和其他金属的蒸发沉积制备金属点，将所述金属在覆盖有格子掩模的载体上蒸发，所述格子掩模可通过电子束平板印刷术或等效技术来产生。格子掩模中空穴的尺寸可对应于载体表面上的点的尺寸。优选地，格子掩模中空穴的直径为5nm或更小。或者，载体上的点可通过例如具有2-10nm的尺寸的纳米颗粒的定点沉积，通过颗粒在载体上，特别地在具有平坦表面的载体上的zeptoliter精密移液(precisionpipetting)来制备。颗粒可具有选自金属诸如Au、Ag、Al、Cr、Ni或其他金属、半金属或硅烷的表面。或者，颗粒可由可具有荧光性质的量子点制成。载体和/或颗粒上的点表面区域可通过生物素和/或链霉抗生物素蛋白或如上所述的其它亲和试剂来进行修饰。
优选将载体上的样品点与单个检测像素的投影中心对齐。可在检测器驱动的反馈环中通过纳米精密压电调整元件进行样品点与检测像素投影之间的对齐的调整。样品点中心与检测像素投影中心之间的调整公差优选为约5nm或更小，约2nm或更小或约1nm或更小。
可以例如在基因组和转录组的分析中或在示差分析(例如关于单个物种或物种内的生物体的基因组或转录组中的差异的研究)中，应用本发明的方法和本发明的仪器。特别优选的是序列的群，例如至少10个，至少102个，至少103个或至少104个单个序列的群内单个子序列的频率和/或分布的测定。
在优选实施方案中，本发明的方法和本发明的仪器可用于准种序列的分析(参考M.Eigen等，"Molecular Quasi Species",J.Phys.Chem.92,December1988,6881-6891；M.Eigen&C.Biebricher,"Role of Genome Variation in Virus Evolution",在RNAGenetics，第3卷中：Variability of RNA Genomes；CRC Press 1988；M.Eigen&R.Winkler-Oswatitsch,"Statistical Geometry on Sequence Space",在Molecular Evolution:Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences,Academic Press,1990中,M.Eigen等，"The Hypercycle-Coupling of RNA and Protein Biosynthesis in theInfection Cycle of an RNA Bacteriophage",Biochemistry 30,November 1991,11005-11018,M.Eigen,"Viral Quasispecies",Scientific American,July 1993,42-49,E.Domingo等"Quasispecies and RNA Virus Evolution:Principles andConsequences",Landes Bioscience Madame Curie Database,2000以及其中引用的参考文献)。
通过单分子测序，可测定种内的生物体群内或生物体内的细胞群内的单个序列的分布。例如，生物体(诸如细菌或病毒)群，或细胞(诸如精子)群在它们的基因组的某些序列中不含相同的基因信息。相反地，存在不同的单个序列(对应于所谓的准种或亚种)，其在给定的长度上区别在于一个或数个，例如2个、3个或4个核苷酸。本发明现允许通过单分子测序，特别地通过单个变体的单分子测序的重复循环来对单个变体序列进行精确测定。由此，可测定生物体(例如病毒或细菌生物体)群，或细胞(例如精子)群内的单个子序列的频率和分布。通过该信息，可精确地测定给定的生物体群或细胞群内的亚种的分布。这允许(在病原生物体诸如细菌或病毒的情况下)改进的诊断和疗法，例如通过检测耐药突变的存在或不存在。在细胞(诸如精子)的情况下，可进行改进的遗传分析，例如，通过检测某些基因型的存在或不存在。
测序的准确度可甚至通过对所谓的靶双链DNA的正和负链二者测序来进一步提高。通过对正和负链二者测序，可以获得106个分析的核苷酸具有一个错误核苷酸读出的准确度。DNA由两条核碱基链组成。一条链中的每一个核碱基类型与另一条链的碱基类型互补，每一条互补链称为正和负链。在下文中我们使用术语“碱基配对”来描述一条DNA链与另一条DNA链的碱基类型互补以使得A与T以及C与T总是以相同碱基数位于彼此对面。此外，我们将互补DNA链称为“正链”和“负链”。
根据本发明的实施方案，可以分析单个DNA分子的正链以及负链。根据该实施方案，核酸靶由单个双链核酸的两条互补链组成。因此，两条互补链称为正链和负链。因此，在一个实施方案中，核酸靶由正链和负链组成。
初始准确度p在此处被定义为所述方法只使用单链(正链或负链)正确地鉴定和报告单个DNA分子中的单个碱基的类型(A、T、C或G之任一)的概率。
在单个DNA分子的正链和负链二者按照本发明的一个实施方案均被读出的情况下，所述方法的初始准确度相较于其中只分析单个DNA分子的单条链的情况得以增加。通过使用碱基配对法则的事先知识，每一个碱基类型的测定的统计准确度得以增加，如下文中进一步描述的。
当测量双链DNA分子中的两个互补碱基时，唯一逻辑上正确的结果应是碱基类型遵守碱基配对法则。这样，可鉴定并抛弃碱基的错误测量。不能被鉴定的唯一事件是所述方法以错误结果遵守碱基配对法则的方式不正确地测定两个互补碱基的事件。如先前句子中定义的事件的概率是(1-p)2。因此，所述方法正确地测定双链DNA(包含正链和负链二者的核酸靶)中的碱基的概率是1-(1-p)2，其等于
P(使用双链DNA通过所述方法正确地测定一个碱基)＝p(2-p)(6)。
在图6中，将初始准确度p与当DNA的双链被测量时一个碱基的正确读出的概率一起显示。
此外，下面的图旨在举例说明本发明。
图1显示如WO 2002/097406中描述的通过衍射光学元件产生的具有共聚焦照射体积元的激光点矩阵。
图2显示1024-像素SPAD检测器。SPAD检测器将在例如350-900nm的宽光谱范围上的高灵敏度与高时间分辨率(≤1ns)组合。
检测器的像素数优选为约100个至约500.000个。检测器上的像素直径优选为约1-20μm并且检测器的间距长度(即检测器上单个像素之间的距离)为约2-200μm。
在下文中，表2显示检测器上的优选像素直径和间距长度尺寸。
Figure BDA0001079455620000211
图3显示载体上检测像素的光学投影中心(灰色)中的样品点(黑色)的对齐。
表3示出了样品点直径(SD)、像素投影直径(PD)和序列准确度(A)的关系。另外显示了等于像素投影距离(投影间距)的样品点距离和像素放大倍数(像素直径与像素投影直径的比)。可如下计算测序准确度：A＝exp–(SD/PD)2
Figure BDA0001079455620000221
检测器像素矩阵与样品点矩阵的对齐优选通过检测器驱动的反馈环中的纳米精密x-y压电调整来进行(Physik Instrumente GmbH&Co.KG,Karlsruhe,Germany)。
图4显示具有基于激光的激发的内反射型(TIR)物镜设置。将准直激光束聚焦在高NA物镜的后焦点面。准直激光束被照射区域的玻璃表面完全反射。在与距表面的距离呈指数衰减的倏逝场中激发表面上的荧光分子以产生荧光。通过在聚焦准直激光束的透镜之后引入衍射光学元件，可产生多个通过TIR反射的激光束。SPAD矩阵的像素与它们在TIR表面上的投影一起，可产生许多共聚焦体积元。
缩写：OL，物镜；BFP，后焦平面；DM，二向色镜；DOE，衍射光学元件；GC，角度光束控制(angular beam control)；EMF，发射滤波器；SPAD，单光子雪崩二极管矩阵。
图5显示TIR(F)设置允许调整入射和全反射光束的角度，从而调整倏逝场的尺寸。可特别地通过使用DOE分离激光束达到数zeptoliter的体积。平坦表面的优点是将自由流应用于表面上以及对非扭结的DNA链进行酶促操作。
图6：将初始准确度p与当测量DNA的两条链时一个碱基的正确读出的概率一起显示。

Claims (21)

1.一种用于分析单分子的方法，其包括以下步骤：
(a)提供至少一个定位在载体上的单个样品点上的待分析的单分子，其中所述点具有在1-20nm的范围内的直径，并且每一个单个点之间的距离为所述点的直径的至少10倍，
(b)用光源单个地照射单个样品点上的单分子，其中所述光源在样品点处提供至少一个照射体积元，
(c)利用包含至少一个检测像素的光检测器单个地检测来自所述单分子的光，其中检测器上的所述检测像素具有在0.5μm-50μm的范围内的直径，并且每一个检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少2倍，
(d)通过光源、载体和检测器之间的光学路径，所述检测像素被光学投影至载体上，
其中光学投影具有在100nm-5μm的范围内的直径，并且检测器上检测像素的尺寸是光学投影的尺寸的10-200倍，
(e)将载体上的单个样品点与单个检测像素在载体上的光学投影对齐，
其中载体上的单个样品点之间的距离等于检测像素在载体上的光学投影之间的距离，以及
(f)使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，
其中通过光学透明的载体照射待分析的分子，并且其中测定通过载体发射的发射光，其中通过载体发射光，并通过内反射在所照射的样品点的区域中的载体表面上引起倏逝激发场的形成。
2.权利要求1的方法，其中每一个单个点之间的距离为所述点的直径的20-500倍，每一个检测像素之间的距离为检测像素的直径的3-10倍，将载体上的单个样品点与单个检测像素在载体上的投影中心对齐，并且内反射是全内反射(TIR)。
3.权利要求1或2的方法，其包括以下步骤：
(a)提供多个待分析的单分子，每一个单分子被定位在载体上的单个样品点处，其中所述点具有在1-20nm的范围内的直径，并且单个点之间的距离为所述点的直径的至少10倍，
(b)用光源单个地照射单个样品点上的单分子，其中所述光源在样品点处提供多个单个的照射体积元，
(c)利用光检测器单个地检测从所述单分子发射的光，其中所述光检测器包含多个检测像素，其中检测器上的所述检测像素具有在0.5μm-50μm的范围内的直径，并且所述检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少2倍，以及
(d)使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，
其中检测像素在载体上的光学投影具有在100nm-5μm的范围内的直径，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影对齐。
4.权利要求1或2的方法，其中单个点之间的距离为所述点的直径的20-500倍，所述检测像素之间的距离为检测像素的直径的3-10倍，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。
5.权利要求1或2的方法，其中
(i)以≤5nm、≤2nm或≤1nm的位置准确度将单个样品点中心与单个检测像素在载体上的投影中心对齐，
和/或
(ii)从可检测的标记基团发射检测光。
6.权利要求1或2的方法，其中从荧光标记基团发射检测光。
7.权利要求1或2的方法，所述方法用于对单个核酸分子进行测序，或用于对多个单个核酸分子进行平行测序，其包括以下步骤：
-在载体的单个样品点处提供(i)环状的或线性的单个核酸分子，(ii)核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子，和(iii)以游离形式存在的和/或掺入核酸分子中的荧光标记的核苷酸构件块，
-进行酶促反应，其中将核苷酸构件块掺入所述单个核酸分子中和/或从其切掉，以及
-基于当核苷酸构件块被掺入所述单个核酸分子和/或从其切掉时引起的时间依赖性荧光变化，单个地测定核酸分子的碱基序列。
8.权利要求7的方法，其中
(i)核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子以固定的形式存在，
或
(ii)核酸分子以固定的形式存在。
9.权利要求1或2的方法，其中
(i)载体具有平坦表面，
和/或
(ii)载体具有选自玻璃、塑料、金属、石英、半金属、金属氧化物的材料或包含多种所述材料的复合材料的表面，
和/或
(iii)样品点包含载体上的涂覆的表面区域或沉积在载体的表面上的颗粒，
和/或
(iv)样品点和/或沉积在其上的颗粒的表面是金属、半金属或硅烷，
和/或
(v)用捕获试剂修饰样品点和/或沉积在其上的颗粒的表面。
10.权利要求9的方法，其中捕获试剂是生物素、链霉抗生物素蛋白或另一种高亲和力捕获试剂。
11.权利要求1或2的方法，其中
(i)检测器为多点单光子雪崩检测器(SPAD)，
和/或
(ii)检测器包含103个至106个单个检测像素，
和/或
(iii)通过调整元件将样品点相对于检测像素的位置对齐，
和/或
(iv)光源是多点激光。
12.权利要求11的方法，其中调整元件是压电调整元件。
13.权利要求1或2的方法，其中由衍射光学元件提供多个单个的照射体积元。
14.权利要求1或2的方法，其中将衍射光学元件引入TIR装置中的激发光束。
15.权利要求1或2的方法，其中检测包括与波长特异性检测组合检测激发状态的寿命。
16.权利要求1-15的任一项的方法用于测定序列群内的子序列的频率和/或分布的用途，其中群包含至少10个、至少102个、至少103个或至少104个单个成员。
17.一种用于分析至少一个单个的单分子，或用于对至少一个核酸分子进行测序的设备，其包含：
(a)载体，其包含至少一个样品点以用于将待分析的单分子定位在单个点上，其中所述点具有在1nm-20nm的范围内的直径，并且单个点之间的距离为点的直径的至少10倍，
(b)光源，其在载体上的样品点上提供至少一个单个的照射体积元以用于单个地照射单个点处的单分子，
(c)光检测器，其包含至少一个检测像素以用于单个地检测从单个点处的单分子发射的光，其中所述检测像素具有在0.5μm–50μm的范围内的直径，并且所述检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少2倍，和
(d)装置，其用于使所检测的来自单个检测像素的信号与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，
其中检测像素在载体上的光学投影具有在100nm-5μm的范围内的直径，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影对齐。
18.权利要求17的设备，其中单个点之间的距离为点的直径的20-500倍，所述检测像素之间的距离为检测像素的直径的3-10倍，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。
19.权利要求17或18的设备，其包含：
(a)载体，其包含多个样品点以用于将待分析的单分子定位在单个点上，其中所述点具有在1-20nm的范围内的直径，并且单个点之间的距离为点的直径的至少10倍，
(b)光源，其在载体上的点上提供多个单个的照射体积元以用于单个地照射单个点上的单分子，
(c)光检测器，其包含多个检测像素以用于单个地检测从单个点上的单分子发射的光，其中所述检测器上的所述检测像素具有在0.5μm-50μm的范围内的直径，并且所述检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少2倍，和
(d)装置，其用于使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，
其中检测像素在载体上的光学投影具有在100nm-5μm的范围内的直径，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影对齐。
20.权利要求19的设备，其中单个点之间的距离为点的直径的20-500倍，所述检测像素之间的距离为检测像素的直径的3-10倍，并且其中将单个样品点与单个检测像素在所述载体上的投影中心对齐。
21.权利要求17-20的任一项的设备用于权利要求1-15的任一项的方法的用途。
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