KR20060115368A

KR20060115368A - 표면 증강 라만 산란 (ｓｅｒｓ)을 이용한 ｄｎａ 시퀀싱방법 및 장치

Info

Publication number: KR20060115368A
Application number: KR1020067008000A
Authority: KR
Inventors: 싱 수; 셀레나 챈
Original assignee: 인텔 코포레이션
Priority date: 2003-09-26
Filing date: 2004-09-24
Publication date: 2006-11-08
Also published as: EP1675964A1; JP2007506432A; US20040110208A1; WO2005030997A1; CN1878875A; US20060068440A1

Abstract

본원에 개시된 방법 및 장치는 증강 라만 분광법에 의한 핵산 특징규명에 관한 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 핵산의 엑소뉴클레아제 처리는 뉴클레오티드를 방출시킨다. 이 뉴클레오티드는 미세유체 채널을 통해 반응 챔버를 통과하여 나노채널 또는 마이크로채널로 들어갈 수 있다. 상기 나노채널 또는 마이크로채널은 라만 검출을 위한 열점을 보유하는 나노입자 응집체로 채워질 수 있다. 뉴클레오티드가 나노입자 열점을 통과할 때, 이들은 라만 분광법으로 검출될 수 있다. 핵산으로부터 방출된 뉴클레오티드의 서열을 확인함으로써 예를 들어, 상기 핵산의 시퀀싱 또는 확인을 이용하여 상기 핵산의 특징을 규명할 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태는 핵산 시퀀싱용 장치에 관한 것이다.

라만 분광, 시퀀싱, 나노입자

Description

표면 증강 라만 산란 (ＳＥＲＳ)을 이용한 ＤＮＡ 시퀀싱 방법 및 장치 {METHODS AND DEVICE FOR DNA SEQUENCING USING SURFACE ENHANCED RAMAN SCATTERING (SERS)}

[관련 출원]

본원은 2002년 5월 26일에 출원된 미국 특허 출원 제10/108,128호의 일부계속출원이다.

본 방법, 조성물 및 장치는 분자생물학 및 게놈학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 방법, 조성물 및 장치는 라만 분광법에 의한 핵산의 특징규명에 관한 것이다. 특징규명은 핵산의 동정 또는 시퀀싱을 수반할 수 있다.

유전 정보는 염색체로 조직화되어 있는 데옥시리보핵산 (DNA)이라는 매우 긴 분자의 형태로 저장된다. 인간 게놈은 대략 30억개의 염기로 된 DNA 서열을 포함한다. 이 DNA 서열 정보는 각 개체의 다수의 특징을 결정한다. 많은 흔한 질환들이 적어도 부분적으로 DNA 서열의 변화에 의거하고 있다

인간 게놈의 전체 서열의 결정은 이러한 질환들의 유전적 근거를 확인하기 위한 토대를 제공한다. 그러나, 각 질환과 관련된 유전적 변이를 확인하기 위해서 는 해야 할 많은 작업이 남아있다. 질환을 촉진하는 DNA 서열에서의 특정한 변화를 확인하기 위해서는, 개체 또는 이러한 각각의 질환을 나타내는 가족에서 염색체 일부의 DNA 시퀀싱을 필요로한다. 다양한 질환의 유전적 근거를 확인하기 위해, 유전 정보를 처리하는 데 있어서 중간 물질인 리보핵산 (RNA)을 시퀀싱할 수도 있다.

크기별로 분리되는, 형광물질로 표지된 핵산의 검출을 기초로 한, 기존 핵산 시퀀싱 방법은 시퀀싱될 수 있는 핵산의 길이에 의해 제한된다. 전형적으로, 핵산 서열 중 단지 500개 내지 1,000개의 염기를 한 번에 결정할 수 있다. 이것은 그 길이가 수만개 또는 심지어 수천만개의 염기일 수 있는 유전자로서 지칭되는, DNA의 기능 단위의 길이보다 훨씬 더 짧다. 현재의 방법을 이용하여 완전한 유전자 서열의 결정하기 위해서는, 많은 카피의 유전자가 생성되어 중첩되는 단편으로 절단되고 시퀀싱되어야 하며, 그 후에 중첩되는 DNA 서열이 완전한 유전자로 어셈블링될 수 있다. 이 방법은 어려운 일이며, 비용이 많이 들고, 비효율적이며 시간이 많이 소요된다. 또한, 상기 방법은 전형적으로 잠재적으로 안전성 및 폐기물 처리 문제를 야기할 수 있는 형광 또는 방사성 표지의 사용을 필요로 한다.

보다 최근에는, 정해질 서열을 가지며 DNA 칩 상의 특정 위치에 부착되어 있는 짧은 올리고뉴클레오티드에의 혼성화를 수반하는 핵산 시퀀싱 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 짧은 핵산 서열을 추측하는 데 사용할 수 있거나 샘플 중의 특정 핵산의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있지만, 긴 핵산 서열을 확인하는 데에는 적합하지 않다.

도면의 간단한 설명

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 개시된 방법 및 장치의 특정 측면을 더 설명하기 위해 포함되어 있다. 본 방법 및 장치는 본 명세서에서 제시된 특정 실시양태들의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.

도 1은 예시적 장치 (100) (확대되지 않음)를 도시하고, 표면 증강 라만 분광법 (SERS), 표면 증강 공명 라만 분광법 (SERRS) 및/또는 가간섭성 반-스토크스 라만 분광법 (CARS) 검출에 의한 핵산 (109) 시퀀싱 방법을 도시한다.

도 2는 100 밀리초 데이타 회수 시간을 이용한, 100 mM 농도에서의 모든 4가지 데옥시뉴클레오시드 모노포스페이트 (dNTP)의 라만 스펙트럼을 보여준다. 특징적인 라만 방출은 각각의 상이한 유형의 뉴클레오티드에 대해 도시된 바와 같이 정점에 도달한다. 데이타는 뉴클레오티드의 표면-증강 또는 표지화 없이 모았다.

도 3은 문헌 (Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L. B. Townsend and R. S. Tipson (Eds.), Wiley-Interscience, New York, 1978)에 따라 산 처리하여 dGMP로부터 얻은, 1 nM 구아닌의 SERS 검출을 보여준다.

도 4는 100 nM 시토신의 SERS 검출을 보여준다.

도 5는 100 nM 티민의 SERS 검출을 보여준다.

도 6은 산 처리에 의해 dAMP로부터 얻은, 100 pM 아데닌의 SERS 검출을 보여준다.

도 7은 플루오레세인으로 공유결합 표지된 데옥시아데노신 트리포스페이트 (상부 흔적)와 표지되지 않은 dATP (하부 흔적)으로 된 500 nM 용액의 비교 SERS 스펙트럼을 보여준다. dATP-플루오레세인은 로쉐 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science; 인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 구입하였다. 플루오레세인으로 표지된 dATP에서 SERS 신호의 강한 증가를 검출하였다.

도 8은 0.9 nM (나노몰) 아데닌 용액의 SERS 검출을 보여준다. 검출 부피는 대략 60개 분자의 아데닌을 함유하는 100 내지 150 펨토리터이었다.

도 9는 단일-가닥 원형 M13 DNA 주형을 사용한, 롤링 서클 증폭 생성물의 SERS 검출을 보여준다.

예시적 실시양태의 설명

개시된 방법, 조성물 및 장치는 신속하고 자동화된 핵산 시퀀싱에 유용하다. 본 방법 및 장치는 길이가 1,000개보다 많은 염기, 2,000개보다 많은 염기, 5,000개보다 많은 염기, 10,000개보다 많은 염기, 20,000개보다 많은 염기, 50,000개보다 많은 염기, 100,000개보다 많은 염기 또는 심지어 더 많은 수의 염기로 된 매우 긴 핵산 분자의 서열을 얻기에 적합할 수 있다. 선행 기술의 방법보다 우수한 이점으로는 일회의 시퀀싱 런에서 긴 핵산 서열을 판독할 수 있는 능력, 보다 빠른 서열 데이타 획득 속도, 감소된 시퀀싱 비용, 및 서열 데이타의 단위 당 필요한 총 작업 시간의 관점에서의 보다 높은 효율이 있다.

핵산 서열 정보는 단일 핵산 분자를 사용한 일회 시퀀싱 런의 과정 동안 얻을 수 있다. 별법으로, 핵산 서열을 확신하기 위해 또는 완전한 서열 데이타를 얻기 위해 많은 카피의 핵산 분자를 병렬식으로 또는 순차적으로 시퀀싱할 수 있다. 다른 별법에서, 핵산 분자 및 이의 상보적 가닥 둘다를 시퀀싱하여 서열 정보의 정확성을 확인할 수 있다. 뉴클레오티드는 예를 들어, 엑소뉴클레아제 처리에 의해 표면-부착 핵산으로부터 방출될 수 있다. 방출된 뉴클레오티드는 예를 들어, 미세유체 (microfluidic) 시스템을 통해 라만 검출기로 운반되고, 이 라만 검출기는 상기 시스템의 핵산, 엑소뉴클레아제 및/또는 다른 성분들에 의한 배경 라만 신호 없이 방출된 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 본 명세서에 개시된 일부 방법이 핵산 시퀀싱을 수반한다고 하더라도, 당업자는 동일한 유형의 방법을 이용하여 핵산에 대한 기타 정보, 예컨대, 샘플에 존재하는 1종 이상의 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP) 또는 다른 유전적 변이의 형태를 얻을 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, RNA 또는 합성 뉴클레오티드 동족체를 포함하는 다른 핵산도 시퀀싱될 수 있다는 것도 예상될 수 있지만 시퀀싱될 핵산은 DNA이다. 하기 상세한 설명은 개시된 방법 및 장치의 보다 철저한 이해를 제공하기 위하여 수많은 특정한 세부사항을 포함한다. 그러나, 본 방법 및 장치가 이들 특정한 세부사항 없이도 실시될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 당분야에 잘 공지된 장치, 방법, 절차 및 개별 구성요소들은 본 명세서에서 상세히 기재되지 않았다.

본 발명의 다양한 실시양태에서, 라만 분광법, 예를 들어, 표면 증강 라만 분광법 (SERS), 표면 증강 공명 라만 분광법 (SERRS), 가간섭성 반-스토크스 라만 분광법 (CARS) 또는 다른 공지된 라만 검출 기술로 표지되지 않은 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 별법으로, 라만 신호를 증강하기 위하여 뉴클레오티드를 라만 표 지에 공유결합시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표준 핵산 중합 기술을 이용하여 표지된 뉴클레오티드를 새로 합성된 핵산 가닥 내로 도입시킬 수 있다. 전형적으로, 특정한 서열의 프라이머 또는 1종 이상의 랜덤 프라이머를 주형 핵산에 혼성화시킬 수 있다. 폴리머라제 및 표지된 뉴클레오티를 첨가할 때, 라만 표지된 뉴클레오티드가 프라이머의 3' 말단에 공유결합되어, 주형에 대한 상보적 서열인 표지된 핵산 가닥이 형성된다. 표지된 가닥은 예를 들어, 약 95℃에서 가열시킴으로써 또는 다른 공지된 방법으로 표지되지 않은 주형으로부터 분리할 수 있다. 두 가닥은 당분야에 잘 공지되어 있는 기술로 서로로부터 분리시킬 수 있다. 예를 들어, 프라이머 올리고뉴클레오티드는 바이오틴 잔기로 공유결합적으로 변형될 수 있고, 생성된 바이오티닐화 핵산은 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅된 표면에 결합됨으로써 분리될 수 있다.

표지된 또는 표지되지 않은 단일-가닥 핵산 분자를 1종 이상의 엑소뉴클레아제로 분해할 수 있다. 당업자는 개시된 방법이 엑소뉴클레아제 그 자체에 제한되지 않고 핵산의 적어도 한 말단으로부터 뉴클레오티드를 순차적으로 제거할 수 있는 임의의 효소 또는 다른 시약을 사용할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 표지된 또는 표지되지 않은 뉴클레오티드는 핵산의 3'-말단으로부터 순차적으로 방출될 수 있다. 핵산의 분리 후, 뉴클레오티드를 라만 검출 유니트로 검출할 수 있다. 순차적으로 검출된 뉴클레오티드에 대한 정보를 이용하여 핵산의 서열을 상세히 파악할 수 있다. 핵산의 3'-말단으로부터 방출된 뉴클레오티드는 라만 검출기를 지나 미세유체 유동 경로로 운반될 수 있다. 상기 검출기는 단일 분자 수준에서 표지된 또는 표지되지 않은 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 라만 검출기에 의한 뉴클레오티드의 검출 순서는 뉴클레오티드가 핵산의 3'-말단으로부터 방출되는 순서와 동일하다.

따라서, 핵산의 서열은 방출된 뉴클레오티드가 검출되는 순서로 결정할 수 있다. 상보적 가닥이 시퀀싱되는 경우, 주형 가닥은 표준 와슨-크릭 수소 결합 염기-페어링 (즉, 아데노신 "A" 대 티민 "T" 및 구아노신 "G" 대 시티딘 "C")에 따라 서열에서 상보적일 것이다.

일부 별법에서, 검출 유니트의 반응 챔버 또는 유동 경로 상류에 태그 분자를 첨가할 수 있다. 태그 분자는 태그가 없는 뉴클레오티드가 핵산 분자로부터 방출될 때 상기 뉴클레오티드에 결합한다. 이 방출-후 태깅은 핵산 분자의 뉴클레오티드가 용액 내로 방출되기 전에 상기 뉴클레오티드가 태깅되는 경우 발생하는 문제점을 피한다. 예를 들어, 거대한 라만 표지 분자의 사용은 핵산 분자 내로 도입된 각 뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제 처리 전에 표지되는 경우 입체 장애를 제공할 수 있고, 이는 효율을 감소시키고 시퀀싱 반응에 필요한 시간을 증가시킨다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 4가지 유형의 뉴클레오티드 각각은 식별가능한 라만 표지에 부착될 수 있다. 다른 별법, 예컨대 라만 표지를 피리미딘 잔기 (C 및 T) 내로 도입하는 방법이 이용가능하다. 피리미딘만을 표지하고 이중-가닥 DNA의 양 가닥을 시퀀싱함으로써, DNA 분자의 완전한 서열을 얻을 수 있다. 단일-가닥 DNA 분자의 각 뉴클레오티드는 퓨린 또는 피리미딘이어야 한다. 뉴클레오티드가 퓨린인 경우, 이 퓨린은 상보적 가닥의 피리미딘에 수소 결합되어야 한다. 따라서, 양 가닥에서 모든 피리미딘을 시퀀싱함으로써, 완전한 서열을 얻는다. 한 예시적 실시양태에서, 표지된 뉴클레오티드는 바이오틴으로 표지된 데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 (바이오틴-dCTP) 및 디곡시제닌으로 표지된 데옥시유리딘-5'-트리포스페이트 (디곡시제닌-dUTP)를 포함할 수 있다.

별법에서, 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 표지되지 않은 뉴클레오티드는 라만 분광법으로 확인한다. 상술된 바와 같이, 뉴클레오티드의 절반만을 확인할 수 있고 이중-가닥 DNA의 양쪽 가닥을 시퀀싱함으로써 완전한 서열 데이타를 얻을 수 있다. 예를 들어, 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드만을 확인할 수 있고, 양쪽 가닥을 시퀀싱함으로써, 완전한 서열을 결정할 수 있다.

도 1에 예시된, 본 발명의 다양한 실시양태에서, 뉴클레오티드 (110)는 예를 들어, 엑소뉴클레아제를 사용한 처리에 의해 하나 이상의 핵산 분자 (109)로부터 순차적으로 제거된다. 뉴클레오티드 (110)는 반응 챔버 (101)로부터 나오고 미세유체 채널 (102) 내로 들어간다. 미세유체 채널 (102)은 나노채널 또는 마이크로채널일 수 있는 채널 (103)과 유체 통신 상태에 있다. 뉴클레오티드 (110)는 미세유체 채널 (102) 측면에서 음성이고 나노채널 (103) 또는 마이크로채널 (103) 측면에서 양성인 전기장에 반응하여 나노채널 (103) 또는 마이크로채널 (103)에 들어갈 수 있다. 전기장은 예를 들어, 음극 (104) 및 양극 (105)의 사용을 통해 가해질 수 있다. 뉴클레오티드 (110)가 나노채널 (103) 또는 마이크로채널 (103)을 통과하여 내려갈 때, 뉴클레오티드는 밀접하게 팩키징된 나노입자 (111)의 영역을 통과할 수 있다. 나노입자 (111)는 "열점"을 형성하도록 처리할 수 있다. "열점"과 결합하는 뉴클레오티드 (110)는 예를 들어, 레이저 (106) 및 CCD 카메라 (107)을 포함하는 검출 유니트를 사용하여 검출할 수 있는 증강된 라만 신호를 생성한다. CCD 카메라 (107)에 의해 검출된 라만 신호는 부착된 컴퓨터 (108)로 처리할 수 있다. 나노입자 (111)를 통한 각 뉴클레오티드 (110)의 통과의 확인 및 시기를 기록할 수 있고 이를 이용하여 핵산 (109)의 서열을 구축할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 뉴클레오티드 (110)는 변형되지 않는다. 본 발명의 대체 실시양태에서, 뉴클레오티드 (110)는 예를 들어, 라만 표지의 부착에 의해 공유결합적으로 변형될 수 있다.

정의

본 명세서에 사용된 바와 같이, "단수형"은 하나 이상의 항목을 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 항목의 "복수형"은 둘 이상의 항목을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "마이크로채널"은 1 마이크로미터 (㎛) 내지 999 ㎛의 횡단 직경을 가진 임의의 채널인 한편, "나노채널"은 1 나노미터 (nm) 내지 999 nm의 횡단 직경을 가진 임의의 채널이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, "나노채널 또는 마이크로채널"의 직경은 약 1 ㎛ 미만일 수 있다. "미세유체 채널"은 액체가 미세유체 흐름으로 이동할 수 있는 채널이다. 채널 직경, 유체 점도 및 미세유체 흐름의 유속의 효과는 당분야에 공지되어 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 커플링된"은 2개 이상의 유니 트 사이에 기능적 상호작용이 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드와 같은 피분석물이 나노채널 또는 마이크로채널을 통과할 때 라만 검출기가 상기 피분석물을 검출할 수 있도록 정렬되어 있는 경우, 상기 라만 검출기는 나노채널 또는 마이크로채널에 "작동가능하게 커플링되어" 있을 수 있다.

"핵산"은 DNA, RNA, 단일-가닥, 이중-가닥 또는 삼중-가닥 및 이의 임의의 화학적 변형체를 포괄한다. 실제로, 상기 핵산의 임의의 변형체가 예상된다. "핵산"은 거의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 150,000, 200,000, 500,000, 1,000,000, 1, 500,000, 2,000,000, 5,000,000 또는 이보다 훨씬 더 많은 염기수의 길이를 가질 수 있고, 심지어 전장 염색체 DNA 분자일 수 있다.

"핵산"은 데옥시리보스 또는 리보스와 같은 오탄당 또는 오탄당의 유도체 또는 동족체에 공유결합적으로 부착된 퓨린 염기, 피리미딘 염기 또는 이의 임의의 화학적 변형체 또는 구조적 동족체를 포함하는 분자이다.

"뉴클레오티드"는 오탄당에 공유결합적으로 부착된 하나 이상의 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드를 말한다. 뉴클레오시드 디포스페이트 또는 트리포스페이트가 사용될 수 있다 하더라도, 검출될 뉴클레오티드는 리보뉴클레오시드 모노포스페이트 또는 데옥시리보뉴클레오시드 모노포스페이트일 수 있다. 별법으로, 뉴클레오시드는 핵산으로부터 방출되어 검출될 수 있다. 다른 별법에서, 퓨린 또는 피리미딘은 예를 들어, 산 처리에 의해 방출될 수 있고, 라만 분광법에 의해 검출될 수 있다. 뉴클레오티드가 예를 들어, 엑소뉴클레아제 활성에 의해 핵산으로부터 여전히 방출될 수 있는 한 다양한 치환 또는 변형이 뉴클레오티드의 구조에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 잔기는 또 다른 오탄당 또는 오탄당 동족체로 치환될 수 있다. 포스페이트기는 다양한 동족체로 치환될 수 있다. 퓨린 또는 피리미딘 염기는 치환되거나 공유결합적으로 변형될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드를 수반하는 실시양태에서, 표지는 이 표지가 엑소뉴클레아제 처리를 방해하지 않는 한 뉴클레오티드의 임의의 부분에 부착될 수 있다.

"라만 표지"는 검출가능한 라만 신호를 생성할 수 있는 임의의 유기 또는 무기 분자, 원자, 결합체 또는 구조체일 수 있고, 그 예에는 합성 분자, 안료, 천연 발생 색소, 예컨대 피코에리쓰린, 유기 나노구조체, 예컨대 C60, 벅키볼 및 탄소나노튜브, 금속 나노구조체, 예컨대 금 또는 은 나노입자 또는 나노프리즘, 및 나노-스케일 반도체, 예컨대 양자점이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

라만 표지의 무수한 예는 아래에 개시되어 있다. 당업자는 이러한 예가 비-제한적이고, "라만 표지"가 라만 분광법에 의해 검출될 수 있는 것으로 당분야에 공지되어 있는 임의의 유기 또는 무기 원자, 분자, 화합물 또는 구조체를 포괄한다는 것을 인식할 것이다.

나노입자

본 발명의 일부 실시양태는 뉴클레오티드로부터 얻은 라만 신호를 증강시키 기 위한 나노입자의 사용을 수반한다. 표면 증강 라만 분광법 (SERS), 표면 증강 공명 라만 분광법 (SERRS) 및/또는 가간섭성 반-스토크스 라만 분광법 (CARS) 신호를 제공할 수 있는 임의의 나노입자를 사용할 수 있다 하더라도, 나노입자는 은 또는 금 나노입자일 수 있다. 직경이 1 nm 내지 2 ㎛인 나노입자를 사용할 수 있다. 별법으로, 직경이 2 nm 내지 1 ㎛, 5 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 200 nm, 20 nm 내지 100 nm, 30 nm 내지 80 nm, 40 nm 내지 70 nm 또는 50 nm 내지 60 nm인 나노입자를 사용할 수 있다. 일부 적용에 있어서 평균 직경이 10 내지 50 nm, 50 내지 100 nm 또는 약 100 nm인 나노입자가 예상된다. 임의의 형태 또는 불규칙한 형태의 나노입자를 사용할 수 있다 하더라도, 나노입자는 대략 구 형태일 수 있다. 나노입자의 제조 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,054,495호; 제6,127,120호; 제6,149,868호; Lee and Meisel, J. Ploys. Chem. 86: 3391-3395, 1982). 나노입자는 구입할 수도 있다 [예를 들어, 나노프로브스 인코포레이티드 (Nanoprobes Inc.), 뉴욕주 야판크 소재; 폴리사이언스 인코포레이티드 (Polysciences, Inc.), 펜실베니아주 와링톤 소재; 테드-펠라 인코포레이티드 (Ted-pella Inc.), 캘리포니아주 레딩 소재].

본 발명의 일부 실시양태에서, 나노입자는 나노입자의 랜덤 응집체 (콜로이드 나노입자)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 나노입자는 가교-결합되어 이량체, 삼량체, 사량체 또는 다른 응집체와 같은 나노입자의 특정 응집체를 생성할 수 있다. SERS, SERRS 및/또는 CARS 검출을 위한 "열점"의 형성은 나노입자의 특정 응집체와 관련될 수 있다. 일부 대체 실시양태는 다양한 크기의 나노입자 응집체의 불균일 혼합물 또는 나노입자 응집체의 균일 혼합물을 사용할 수 있다. 선택된 수의 나노입자 (이량체, 삼량체 등)을 함유하는 응집체는 수크로스 용액 중에서의 초원심분리와 같은 공지된 기술로 농축되거나 정제될 수 있다. 크기가 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 내지 1000 nm이거나 이보다 더 큰 나노입자 응집체가 예상된다. 나노입자 응집체의 크기는 약 100 nm 내지 약 200 nm일 수 있다. 나노입자를 가교-결합시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다 [예를 들어, 문헌 (Feldheim, "Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges," The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25)을 참조함). 말단 티올기 또는 술프히드릴기를 보유하는 링커 화합물과 금 나노입자의 반응은 공지되어 있다 (Feldheim, 2001). 단일 링커 화합물은 양 말단에서 티올기로 유도체화될 수 있다. 금 나노입자와의 반응시, 상기 링커는 링커의 길이에 의해 분리되는 나노입자 이량체를 형성할 수 있다. 3개 이상의 티올기를 가진 링커를 사용하여 다수의 나노입자에 동시에 부착시킬 수 있다 (Feldheim, 2001). 링커 화합물에 대한 과량의 나노입자의 사용은 다수의 가교-결합의 형성 및 나노입자 침전을 방해한다. 은 나노입자의 응집체는 당분야에 공지된 표준 합성 방법으로 형성할 수 있다.

별법으로, 사용되는 링커 화합물은 티올기와 같은 단일 반응성 기를 보유할 수 있다. 단일 부착 링커 화합물을 보유하는 나노입자는 예를 들어, 두 가지 상이한 나노입자에 부착된 링커 화합물의 비-공유 상호작용에 의해 이량체로 자가-응집될 수 있다. 예를 들어, 링커 화합물은 알칼 티올을 포함할 수 있다. 티올기가 금 나노입자에 부착된 후, 알칸기는 소수성 상호작용에 의해 결합되는 경향을 가질 것이다. 다른 별법에서, 링커 화합물은 각 말단에서 상이한 작용기를 보유할 수 있다. 예를 들어, 링커 화합물은 한 말단에서 술프히드릴기를 보유하여 금 나노입자에 부착될 수 있고, 반대 말단에서 상이한 반응성 기를 보유하여 다른 링커 화합물에 부착될 수 있다. 이러한 많은 반응성 기는 당분야에 공지되어 있고 본 방법 및 장치에 사용될 수 있다.

금 또는 은 나노입자는 아미노실란, 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 (GDP) 또는 아미노프로필트리메톡시실란 (APTS)과 같은 유도체화된 실란으로 코팅될 수 있다. 실란의 말단에 있는 반응성 기는 나노입자의 가교-결합 응집체를 형성하는 데 사용할 수 있다. 사용된 링커 화합물의 대략적인 길이는 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 내지 100 nm의 길이 또는 심지어 이보다 더 큰 임의의 길이일 수 있다. 길이가 불균일한 링커들을 사용할 수 있다.

나노입자는 다양한 반응성 기를 보유하도록 변형된 후 링커 화합물에 부착될 수 있다. 변형된 나노입자, 예컨대 나노프로브스, 인코포레이티드 (Nanoprobes, Inc.; 뉴욕주 야판크 소재)로부터 시판되는 나노입자인 나노골드^{(등록상표)}를 구입할 수 있다. 나노입자 당 한 개 또는 다수의 말레이미드, 아민 또는 다른 기가 부착된 나노골드^{(등록상표)} 나노입자를 얻을 수 있다. 나노골드^{(등록상표)} 나노입자를 양으로 또는 음으로 하전된 형태로 사용하여 전기장에서의 나노입자의 조작을 용이하게 할 수도 있다. 이러한 변형 나노입자는 다양한 공지된 링커 화합물에 부착되어 나노입자의 이량체, 삼량체 또는 다른 응집체를 제공할 수 있다.

링커 화합물이 용액에서 침전되지 않을 작은 나노입자 응집체를 생성시키는 한, 사용되는 링커 화합물의 유형은 제한되지 않는다. 링커기는 페닐아세틸렌 중합체를 포함할 수 있다 (Feldheim, 2001). 별법으로, 링커기는 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 또는 다른 공지된 중합체를 포함할 수 있다. 사용되는 링커 화합물은 중합체에 한정되지 않지만 실란, 알칸, 유도체화 실란 또는 유도체화 알칸과 같은 다른 유형의 분자를 포함할 수도 있다. 알칸 또는 실란과 같은 비교적 단순한 화학 구조의 링커 화합물을 사용하여 뉴클레오티드로부터 방출되는 라만 신호를 간섭하는 것을 피할 수 있다.

나노입자를 나노채널 또는 마이크로채널 내로 채워넣는 경우, 나노입자 응집체는 미세유체 또는 나노유체, 유체역학적 집속 또는 전기-삼투와 같은, 당분야에 공지된 임의의 방법으로 채널 내로 채워넣을 수 있다. 전기 구배의 이용을 통해 채널 내로 나노입자를 용이하게 채워넣기 위해 하전된 링커 화합물 또는 하전된 나노입자를 사용할 수 있다.

채널, 반응 챔버 및 통합된 칩

재료

반응 챔버, 미세유체 채널, 나노채널 또는 마이크로채널 및 장치의 다른 구 성요소를 예를 들어, 반도체 칩에서 공지된 칩 및/또는 마이크로캐필러리 또는 미세유체 칩의 형태의 단일 유니트로서 형성시킬 수 있다. 규소, 이산화규소, 질화규소, 폴리디메틸 실록산 (PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 플라스틱, 유리, 석영 등을 비롯하여, 이러한 칩들에서 사용되는 것으로 공지된 임의의 물질을 본원에 개시된 장치에 사용할 수 있다. 상기 장치의 일부 또는 전부는 라만 분광법에 사용되는 여기 및 방사 진동수에서 전자기적 방사선이 투과할 수 있도록 선택될 수 있고, 예컨대 유리, 규소, 석영 또는 임의의 다른 광학 투명 물질이 선택될 수 있다. 핵산 및/또는 뉴클레오티드에 노출될 수 있는, 유체-충진 구성요소, 예컨대, 반응 챔버, 미세유체 채널 및 나노채널 또는 마이크로채널의 경우, 이러한 분자에 노출될 표면은 코팅으로 변형시켜 예를 들어, 표면을 소수성 표면에서 친수성 표면으로 변화시키고(시키거나) 표면에의 부착의 흡착을 감소시킬 수 있다. 유리, 규소 및/또는 석영과 같은 통상적으로 사용되는 칩 물질의 표면 변형은 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,263,286호). 이러한 변형에는 시판되는 캐필러리 코팅제 (Supelco, Bellafonte, PA), 폴리에틸렌옥사이드 또는 아크릴아미드와 같은 다양한 작용기를 가진 실란, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 코팅제를 사용한 코팅이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

통합된 칩 제조

칩의 배치 (batch) 제작을 위한 기술은 컴퓨터 칩 제조 및/또는 마이크로캐필러리 칩 제조의 분야에서 잘 공지되어 있다. 이러한 칩은 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 포토리쏘그래피 (photolithography) 및 에칭, 레이저 증착, 사출 성형, 캐스팅, 분자빔 증착, 딥-펜 나노리쏘그래피, 화학 기상 증착 (CVD) 제작법, 전자빔 또는 집속 이온빕 기술 또는 임프린팅 기술로 제조할 수 있다. 비-제한적 실시예에는 유동가능한 광학 투명 물질, 예를 들어, 플라스틱 또는 유리를 사용한 통상적인 성형; 이산화규소의 포토리쏘그래피 및 건식 에칭; 이산화규소 기판 상에서 알루미늄 마스크를 본뜨기 위한 폴리메틸메타크릴레이트 레지스트를 사용한 전자빔 리쏘그래피 후의 반응성 이온 에칭을 포함한다. 미세유체 채널은 문헌 [Anderson et al. ("Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping, "Anal. Chem. 72: 3158-3164, 2000)]에 따라 폴리디메틸실록산 (PDMS)을 성형함으로써 만들 수 있다. 나노전자기계적 시스템의 제조 방법을 이용할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Craighead, Science 290: 1532-36, 2000)을 참조함]. 미세제작된 칩은 칼리퍼 테크놀로지스 인코포레이티드 (Caliper Technologies Inc.; 캘리포니아주 마우틴 뷰 소재) 및 아클라라 바이오사이언스 인코포레이티드 (ACLARA BioSciences Inc.; 캘리포니아주 마우틴 뷰 소재)와 같은 공급처로부터 구입할 수 있다.

미세유체 채널 및 마이크로채널

하나 이상의 핵산 분자로부터 방출된 뉴클레오티드는 미세유체 채널로 내려간 후 나노채널 또는 마이크로채널일 수 있는 채널로 이동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마이크로채널 또는 나노채널의 직경은 약 3 nm 내지 약 1 ㎛일 수 있다. 상기 채널의 직경은 여기 레이저 빔보다 크기 면에서 약간 더 작도록 선택할 수 있다. 미세유체 채널 및/또는 채널은 마이크로캐필러리 (예를 들어, 캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재하는 아클라라 바이오사이언스 인코포레이티드로부터 시판됨) 또는 액체 통합 회로 (예를 들어, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 칼리퍼 테크놀로지스 인코포레이티드로부터 시판됨)를 포함할 수 있다. 이러한 미세유체 플랫폼은 나노리터 부피의 샘플만을 필요로 한다. 뉴클레오티드는 거대한 용매 흐름, 전자-삼투 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 기술에 의해 미세유체 채널로 내려갈 수 있다.

별법으로, 마이크로캐필러리 전기영동을 이용하여 뉴클레오티드를 운반할 수 있다. 일반적으로, 마이크로캐필러리 전기영동은 특정한 분리 매질로 채워질 수 있거나 채워질 수 없는 얇은 캐필러리 또는 채널의 사용을 수반한다. 음으로 하전된 뉴클레오티드와 같은 적절하게 하전된 분자 종의 전기영동은 가해진 전기장에 반응하여 일어난다. 전기영동이 마이크로캐필러리에 동시에 첨가되는 성분들의 혼합물의 크기 분리에 종종 이용될지라도, 전기영동은 핵산 분자로부터 순차적으로 방출되는 유사한 크기의 뉴클레오티드를 운반하는 데에도 이용할 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드보다 더 커서 보다 더 느리게 이동할 것이기 때문에, 다양한 채널의 길이 및 검출기를 지나는 상응하는 통과 시간을 최소한으로 유지하여 차등적 이동이 핵산으로부터 방출되는 뉴클레오티드의 순서를 혼합시키는 것을 막을 수 있다. 별법으로, 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 이동 속도가 유사하거나 동일하도록 마이크로캐필러리를 채우는 분리 매질을 선택할 수 있다. 마이크로캐필러리 전기영동의 방법은 예를 들어, 문헌 [Woolley and Mathies (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11348-352, 1994)]에 개시되어 있다.

마이크로캐필러리 전기영동 장치를 비롯한 미세유체 장치의 미세제작은 예를 들어 문헌 [Jacobsen et al. (Anal. Biochem, 209: 278-283, 1994); Effenhauser et al. (Anal. Chem. 66: 2949-2953,1994); Harrison et al. (Science 261: 895- 897,1993)] 및 미국 특허 제5,904,824호에 논의되어 있다. 전형적으로, 이들 방법은 실리카, 규소 또는 다른 결정형 기판 또는 칩 상의 마이크론 스캐일 채널의 포토리쏘그래픽 에칭을 포함하고, 개시된 본 방법 및 장치에서의 사용에 쉽게 적응될 수 있다. 직경을 좁히기 위해 마이크로채널의 내부를 코팅하는 방법과 같은 공지된 방법 또는 나노리쏘그래피, 집속 전자 빔, 집속 이온 빔 또는 집속 원자 레이저 기술을 이용하여 나노채널과 같은 보다 작은 직경의 채널을 제조할 수 있다. 뉴클레오티드의 검출을 용이하게 하기 위해, 사용된 여기 주파수 및 방사 진동수에서 전자기적 방사선이 투과될 수 있도록, 나노채널 또는 마이크로채널을 포함하는 물질을 선택할 수 있다. 유리, 규소, 및 라만 분광법에 사용되는 진동수 범위에서 일반적으로 투과성을 나타내는 임의의 다른 물질을 사용할 수 있다. 나노채널 또는 마이크로채널은 사출 성형 또는 다른 공지된 기술을 이용하여 반응 챔버의 제작에 사용되는 물질과 동일한 물질로부터 제작될 수 있다.

나노채널

나노채널의 제작은 나노스케일 제조에 대해 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용할 수 있다. 하기 기술은 단지 예시를 위한 것이다. 나노채널은 예를 들어, 고효율 전자 빔 리쏘그래피 시스템을 이용하여 제조할 수 있다. 전자 빔 리쏘그래피를 이용하여 규소 칩 상에서 5 nm만큼 작은 소자를 형성할 수 있다. 규소 표면 상에 코팅된, 폴리메틸-메타크릴레이트와 같은 민감성 레지스트를 마스크의 사용 없이 패턴화할 수 있다. 전자 빔 어레이는 전계 방사자 다발을 마이크로채널 증폭기과 결합시켜 전자 빔의 안정성을 증가시킬 수 있고, 이로써 낮은 전류에서 작업할 수 있게 한다. 소프트마스크^(상표명) 컴퓨터 제어 시스템을 이용하여 규소 또는 다른 칩 상에서 나노스캐일 소자들의 전자 빔 리쏘그래피를 제어할 수 있다.

별법으로, 나노스캐일은 집속 원자 레이저를 사용하여 제조할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Bloch et al., "Optics with an atom laser beam," Phys. Rev. Lett. 87: 123-321, 2001)]. 집속 원자 레이저는 표준 레이저 또는 집속 전자 빔과 마찬가지로 리쏘그래피에 사용할 수 있다. 이러한 기술은 칩 상에서 마이크론 스캐일 또는 심지어 나노스캐일 구조체를 생성할 수 있다. 딥-펜 나노리쏘그래피를 이용하여 나노채널을 형성할 수도 있다. [예를 들어, 문헌 (Ivanisevic et al., "Dip-Pen Nanolithography on Semiconductor Surfaces," J. Am. Chem. Soc., 123: 7887-7889, 2001). 딥-펜 나노리쏘그래피는 규소 칩과 같은 표면 상에 분자를 부착시키기 위해 원자력 현미경을 사용한다. 15 nm 크기만큼 작은 소자를 10 nm의 공간 분해능으로 형성할 수 있다. 나노스캐일 채널은 표준 포토리쏘그래피 기술과 딥-펜 나노리쏘그래피를 함께 이용하여 형성할 수 있다. 예를 들어, 레지스트층의 마이크론 스캐일 선은 표준 포토리쏘그래피로 형성할 수 있다. 딥-펜 나노리쏘그래피를 이용하여, 상기 레지스트의 가장자리 상에 추가 레지스트 화합물을 퇴적시킴으로써 상기 선의 폭 (및 에칭 후 상기 채널의 상응하는 직경)을 좁힐 수 있다. 보 다 얇은 상기 선의 에칭 후, 나노스캐일 채널을 형성할 수 있다. 별법으로, 원자력 현미경을 이용하여 광레지스트를 제거함으로써 나노미터 스캐일 소자를 형성할 수 있다.

이온-빔 포토리쏘그래피를 사용하여 칩 상에서 나노채널을 생성시킬 수도 있다 [예를 들어, 문헌 (Siegel, "Ion Beam Lithography," VLSI Electronics, Microstructure Science, Vol. 16, Einspruch and Watts eds., Academic Press, New York, 1987)]. 미세하게 집속된 이온 빔은 마스크를 사용하지 않고 레지스트의 층 상에 나노채널과 같은 소자를 직접 형성하는 데 사용할 수 있다. 별법으로, 넓은 이온 빔을 마스크와 함께 사용하여 100 nm 스캐일 만큼 작은 소자들을 형성할 수 있다. 예를 들어, 불소산을 사용한 화학적 에칭을 이용하여 레지스트에 의해 보호되지 않는 노출된 규소를 제거할 수 있다. 당업자는 상기 개시된 기술들이 비제한적이고 상기 나노채널들이 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 형성될 수 있음을 인식할 것이다.

반응 챔버

반응 챔버는 수성 환경에서 핵산 분자 및 엑소뉴클레아제를 보유하도록 디자인될 수 있다. 반응 챔버는 핵산 분자가 부착될 수 있는 고정화 표면을 보유할 수도 있다. 반응 챔버는 예를 들어, 펠레티에르 (Pelletier) 요소의 삽입 또는 다른 공지된 방법으로 온도를 제어할 수 있게 디자인될 수 있다. 작은 부피의 액체의 온도를 조절하는 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다 [예를 들어, 미국 특허 제5,038,853호, 제5,919,622호, 제6,054,263호 및 제6,180,372호 참조]. 반응 챔버 는 약 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500 또는 750 피코리터, 약 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500 또는 750 나노리터, 약 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500 또는 750 마이크로리터, 또는 약 1 밀리리터의 내부 부피를 가질 수 있다. 반응 챔버는 상술된 공지된 칩 기술들을 이용하여 제조할 수 있다.

핵산

시퀀싱될 핵산 분자는 당분야에 공지된 임의의 기술로 제조할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 천연 발생 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 사실상, 염색체 DNA, 미토콘드리아 DNA, 엽록소 DNA, 리보좀 RNA, 전달 RNA, 불균일 핵 RNA 및 메신저 RNA를 포함하는 이에 제한되지 않는 임의의 천연 발생 핵산을 개시된 방법들로 제조하고 시퀀싱할 수 있다. 세포 핵산의 다양한 형태를 제조하고 단리하는 방법은 공지되어 있다 [예를 들어, 문헌 (Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger and Kimmel, Academic Press, New York, NY, 1987; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)을 참조함]. 인용 문헌에 개시된 방법들은 단지 예시적인 것이며 당분야에 공지된 임의의 변법을 이용할 수 있다. 단일 가닥 DNA (ssDNA)가 시퀀싱될 경우, 임의의 공지된 방법으로 이중 가닥 DNA (dsDNA)로부터 ssDNA를 제조할 수 있다. 이러한 방법은 dsDNA를 가열하여 가닥이 분리되게 하는 것을 수반할 수 있거나, 별법으로 공지된 증폭 또는 복제 방법, 예를 들어, M13으로의 클로닝으로 dsDNA로부터 ssDNA를 제조하는 것을 수반할 수 있다. 임의의 이러한 공지된 방법을 이용하여 ssDNA 또는 ssRNA를 제조할 수 있다.

사실상, 엑소뉴클레아제에 대한 기질 또는 이의 등가물로서 기능할 수 있는 임의의 유형의 핵산을 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR^(상표명))과 같은 다양한 증폭 기술로 제조한 핵산을 시퀀싱할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호를 참조함). 별법으로, 시퀀싱될 핵산은 플라스미드, 코스미드, BAC (박테리아 인공 염색체) 또는 YAC (효모 인공 염색체)와 같은 표준 벡터에 클로닝할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Berger and Kimmel, 1987; Sambrook et al., 1989)을 참조함]. 핵산 삽입물은 예를 들어, 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 절단 후 아가로스 겔 전기영동을 행하여 벡터 DNA로부터 단리할 수 있다. 삽입 핵산의 단리 방법은 당분야에 공지되어 있다.

단일 핵산 분자의 단리

시퀀싱될 핵산 분자는 ssDNA 또는 ssRNA의 단일 분자일 수 있다. 단일 ssDNA 또는 ssRNA 분자의 다양한 선별 및 조작 방법 예를 들어, 유체역학적 집속법, 미세조작기 커플링, 광학 트랩핑, 또는 이들 방법과 유사 방법들의 병용을 이용할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Goodwin et al., 1996, Acc. Chem. Res. 29: 607-619); 미국 특허 제4,962,037호; 제5,405,747호; 제5,776,674호; 제6,136,543호; 제6,225,068호를 참조함].

미세유체장치 또는 나노유체장치를 이용하여 핵산 분자를 분류하고 단리할 수 있다. 유체역학을 이용하여 마이크로채널, 마이크로캐필러리, 또는 미세공극 내로 핵산을 넣을 수 있다. 유체역학력을 이용하여 핵산 분자를 빗 형태의 구조를 가로질로 이동시켜 단일 핵산 분자를 분리할 수 있다. 핵산 분자가 일단 분리되면, 유체역학 집속을 이용하여 상기 분자를 반응 챔버 내에 위치시킬 수 있다. 열 또는 전기 포텐셜, 압력 또는 진공을 이용하여 핵산의 조작을 위한 원동력을 제공할 수도 있다. 시퀀싱을 위한 핵산의 조작은 미국 특허 제5,867,266호 및 제6,214,246호에 개시된 미세조립 채널과 완전한 겔 물질을 통합시키는 채널 블록 디자인의 이용을 수반할 수 있다.

핵산 분자를 함유하는 샘플을 희석한 후 고정화 표면에 커플링시킬 수 있다. 고정화 표면은 자기 또는 비-자기 비드 또는 다른 분리된 구조 유니트의 형태일 수 있다. 적절한 희석에서, 각 비드는 0 또는 1개의 핵산 분자와 결합할 통계적 확률을 가질 것이다. 하나의 부착된 핵산 분자를 가진 비드는 예를 들어, 형광 안료 및 유세포 분류기 (flow cytometer sorting) 또는 자기 분류기를 이용하여 확인할 수 있다. 비드와 핵산의 상대적인 크기 및 균일성에 따라, 자기 필터 및 질량 분리를 이용하여 결합된 단일 핵산 분자를 함유하는 비드를 분리시킬 수 있다. 별법으로, 단일 비드 또는 다른 고정화 표면에 부착된 다수의 핵산을 시퀀싱할 수 있다.

코팅된 섬유 팁을 사용하여 시퀀싱용 단일 핵산 분자를 생성시킬 수도 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,225,068호를 참조함). 아비딘 또는 다른 가교-결합제의 단일 분자를 함유하는 고정화 표면을 제조할 수 있다. 이러한 표면에는 시퀀싱할 단일 바이오티닐화 핵산 분자가 부착될 수 있다. 이 방법은 아비딘-바이오틴 결합 시스템에 한정되지 않고, 당분야에 공지된 임의의 커플링 시스템에 적용할 수 있다.

다른 별법에서, 광학 트랩을 이용하여 시퀀싱용 단일 핵산 분자의 조작을 할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,776,674호를 참조함). 예시적 광학 트랩핑 시스템은 셀 로보틱스 인코포레이티드 (Cell Robotics, Inc.; 뉴멕시코주 알부퀘르크 소재), S+L GmbH (Heidelberg, Germany) 및 P.A.L.M. Gmbh (Wolfratshausen, Germany)로부터 시판된다.

고정화 방법

본 발명의 다양한 실시양태에서, 시퀀싱할 핵산 분자를 고체 표면에 부착시킬 수 있다 (고정화시킴). 핵산 분자의 고정화는 상기 핵산 분자와 상기 표면 사이의 비-공유 또는 공유 결합을 수반하는 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 고정화는 스트렙타비딘 또는 아비딘을 사용한 표면의 코팅 및 바이오티닐화 핵산의 부착에 의해 달성될 수 있다 (Holmstrom etal., Anal. Biochem. 209: 278-283,1993). 고정화는 규소, 유리 또는 다른 표면을 폴리-L-Lys (리신) 또는 폴리-L-Lys, Phe (페닐알라닌)으로 코팅한 후, 이작용성 가교결합제를 사용하여 아미노- 또는 술프히드릴-변형 핵산을 공유 부착시킴으로써 달성할 수도 있다 (Running et al., BioTechniques 8: 276-277, 1990; Newton et al., Nucleic Acids Res. 21: 1155-62, 1993). 아미노 잔기를 가교-결합을 위한 아미노실란을 사용하여 표면 상에 도입시킬 수 있다.

고정화는 5'-인산화 핵산을 화학적으로 변형된 표면에 직접 공유 부착시켜 달성할 수 있다 (Rasmussen et al., Anal. Biochem. 198: 138-142, 1991). 핵산과 표면 사이의 공유결합은 수용성 카르보디이미드를 사용한 축합에 의해 형성된다. 이 방법은 5'-포스페이트를 통한 핵산 분자의 5'-부착을 압도적으로 용이하게 한다.

DNA는 통상적으로 먼저 유리 표면을 실란화한 후, 카르보디이미드 또는 글루타르알데히드를 사용한 활성화를 행하여 유리에 결합시킨다. 별법은 DNA 분자의 3' 또는 5' 말단에 도입된 아미노 링커를 통해 결합된 DNA를 가진 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 (GOP) 또는 아미노프로필트리메톡시실란 (APTS)와 같은 시약을 사용할 수 있다. DNA는 자외선을 이용하여 막 표면에 직접 결합시킬 수 있다. 핵산을 위한 고정화 기술의 다른 비-제한적 예는 미국 특허 제5,610,287호, 제5,776,674호 및 제6,225,068호에 개시되어 있다.

핵산의 고정화에 사용될 표면의 유형은 제한되지 않는다. 고정화 표면은 그 물질이 충분한 내구성 및 비활성을 가져 핵산 시퀀싱이 일어나게 하는 한, 자기 비드, 비-자기 비드, 평평한 표면, 뽀족한 표면, 또는 대부분의 임의의 물질을 포함하는 고형 표면의 임의의 다른 형태일 수 있다. 사용할 수 있는 표면의 비-제한적 예에는 유리, 실리카, 규산염, PDMS, 은 또는 다른 금속 코팅 표면, 니트로셀룰로스, 나일론, 활성화된 석영, 활성화된 유리, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF), 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리(염화비닐), 폴리(메틸 메타크릴레이트) 또는 폴리(디메틸 실록산)과 같은 다른 중합체, 핵산 분자와 공유결합을 형성할 수 있는 니트렌, 카르벤 및 케틸 라디칼과 같은 광반응성 종을 함유하는 광중합체가 포함된다 (미국 특허 제5,405,766호 및 제5,986,076호를 참조함).

이작용성 가교-결합제를 사용하여 핵산 분자를 표면에 부착시킬 수 있다. 이작용성 가교-결합제는 이의 작용기, 예를 들어, 아미노, 구아니디노, 인돌 또는 카르복실 특이적 기의 특이성에 따라 구분될 수 있다. 이들 중, 자유 아미노기에 대해 특이적인 시약을 많이 사용하는데, 이는 이의 구입용이성, 합성의 용이함 및 이들이 적용될 수 있는 순한 반응 조건 때문이다. 가교-결합 분자의 예시적 제조 방법은 미국 특허 제5,603,872호 및 제5,401,511호에 개시되어 있다. 가교-결합제에는 글루타르알데히드 (GAD), 이작용성 옥시란 (OXR), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (EGDE), 및 카르보디이미드, 예컨대, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)가 포함된다.

핵산 합성

폴리머라제

본원에 개시된 일부 방법은 DNA 폴리머라제와 같은 합성 효소를 프라이머 분자에 결합시키는 단계와 라만 표지 뉴클레오티드를 상기 프라이머의 3' 말단에 부가시키는 단계를 수반할 수 있다. 폴리머라제의 비-제한적 예에는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사효소 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제가 포함된다. "교정 (proofreading)" 활성 및 프라이머와 프로모터 서열의 필요 또는 불필요의 관점에서 이들 폴리머라제 사이의 차이는 당분야에 공지되어 있다. RNA 폴리머라제를 폴리머라제로서 사용하는 경우, 시퀀싱될 주형 분자는 이중-가닥 DNA일 수 있다. 폴리머라제의 비-제한적 예에는 써마토가 마리티마 (Thermatoga maritima) DNA 폴 리머라제, AmplitaqFS^(상표명)DNA 폴리머라제, 태퀘나제^(상표명) DNA 폴리머라제, 써모시퀘나제^(상표명), Taq DNA 폴리머라제, Q베타^(상표명) 레플리카제, T4 DNA 폴리머라제, 써머스 써모필루스 (Thermus thermophilus) DNA 폴리머라제, RNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제가 포함된다.

Pwo DNA 폴리머라제 (인디애나주 인디애나폴리스 소재의 베링거 만하임 바이오케미칼스 (Boehringer Mannheim Biochemicals)); Bst 폴리머라제 (캘리포니아주 허큘레스 소재의 바이오-라드 라보라토리스 (Bio-Rad Laboratories)); 이소썸^(상표명) DNA 폴리머라제 (위스콘신주 매디슨 소재의 에피센터 테크놀로지스 (Epicentre Technologies)); 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사효소, Pfu DNA 폴리머라제, 조류 골수아세포종 바이러스 역전사효소, 써머스 플라버스 (Thermus flavus) (Tfl) DNA 폴리머라제 및 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) (Tli) DNA 폴리머라제 (위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션 (Promega Corp.)); RAV2 역전사효소, HIV-1 역전사효소, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 이. 콜라이 (E. coli) RNA 폴리머라제, 써머스 아쿠아티커스 (Thermus auaticus) DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제 +/- 3'→5' 엑소뉴클레아제, DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편, 써머스 "유비퀴토스" DNA 폴리머라제, 및 DNA 폴리머라제 I (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 파마샤 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotec))를 비롯한 다수의 폴리머라제가 시판되고 있다. 표지된 뉴클레오티드의 주형 의존성 중합을 수행할 수 있는 당분야에 공지된 임의의 폴리머라제 를 사용할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Goodman and Tippin, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (2): 101-9, 2000); 미국 특허 제6,090,589호를 참조함]. 표지된 뉴클레오티드로부터 핵산을 합성하기 위해 폴리머라제를 사용하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,962,037호; 제5,405,747호; 제6,136,543호; 제6,210,896호).

프라이머

일반적으로, 긴 프라이머를 사용할 수 있을지라도, 프라이머의 길이는 10개 내지 20개의 염기일 수 있다. 프라이머는 주형 핵산 분자의 공지된 부분에 상보적인 서열이 되도록 디자인할 수 있다. 예를 들어, 공지된 일정 염색체 서열에 인접한 서열 변이체를 확인하기 위해 프라이머를 선택하는 경우, 공지되지 않은 핵산 서열을 공지된 서열을 가진 벡터 내로 삽입하는 경우, 또는 천연 핵산이 부분적으로 시퀀싱된 경우, 공지된 프라이머 서열을 이용할 수 있다. 임의의 서열을 가진 프라이머의 합성 방법은 공지되어 있다. 별법으로, 랜덤 프라이머, 예를 들어, 랜덤 헥사머 또는 랜덤 올리고머를 사용하여 공지된 프라이머-결합 부위의 부재 하에서 핵산 중합을 개시할 수 있다.

엑소뉴클레아제

핵산 시퀀싱 방법은 엑소뉴클레아제를 핵산 분자의 자유 말단에 결합시키는 단계 및 뉴클레오티드를 한번에 한 개씩 제거하는 단계를 수반할 수 있다. 사용될 수 있는 엑소뉴클레아제 유형은 제한되지 않는다. 사용할 수 있는 엑소뉴클레아제의 비-제한적 예에는 이. 콜라이 엑소뉴클레아제 I, III, V 또는 VII, Bal 31 엑소 뉴클레아제, 녹두 (mung bean) 엑소뉴클레아제, S1 뉴클레아제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I 완전효소 또는 클레나우 단편, RecJ, 엑소뉴클레아제 T, T4 또는 T7 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 T7 유전자 6, 뱀독 포스포디에스터라제, 비장 포스포디에스터라제, 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) DNA 폴리머라제, 피로코커스 종 (Pyrococcus sp .) GB-D DNA 폴리머라제, 람다 엑소뉴클레아제, 스테필라코커스 아우레우스 (S. aureus) 구균 뉴클레아제, DNase I, 리보뉴클레아제 A, T1 구균 뉴클레아제, 또는 당분야에 공지된 다른 엑소뉴클레아제가 포함된다. 엑소뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩 (New England Biolabs; 매샤추세츠 비벌리 소재), 아머샴 파마샤 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech; 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 프로메가 (Promega; 위스콘신주 매디슨 소재), 시그마 케미칼스 (Sigma Chemicals; 미조리주 세인트 루이스 소재) 또는 베링거 만하임 (Boehringer Mannheim; 인디애나주 인디애나폴리스 소재)과 같은 시판 공급처로부터 구입가능하다..

당업자는 엑소뉴클레아제 활성을 가진 효소가 당분야에 공지된 다양한 성질을 가진다는 것을 인식할 것이다. 엑소뉴클레아제 활성 속도는 검출기에 의한 뉴클레오티드 분석의 최적 속도와 일치하도록 조작할 수 있다. 반응 챔버 내의 온도, 압력, pH, 염 농도 또는 이가 양이온 농도의 조절을 비롯한, 엑소뉴클레아제 활성 속도의 조절을 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 엑소뉴클레아제 활성의 최적화 방법은 당분야에 공지되어 있다.

뉴클레오시드 모노포스페이트가 엑소뉴클레아제 활성에 의해 핵산으로부터 방출되는 것이 일반적일지라도, 개시된 본 방법은 임의의 특정 형태의 자유 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출에 한정되지 않고, 핵산으로부터 방출될 수 있는 임의의 단량체를 포괄한다. 일부 경우에서, 검출될 핵산 분자는 예를 들어, 하기한 바와 같이 산 가수분해에 의해 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드로부터 방출된 퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다.

라만 표지

본 명세서에 개시된 일부 방법은 표지를 1종 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기에 부착시켜 라만 검출기에 의한 이들의 검출을 용이하게 하는 단계를 수반할 수 있다. 라만 분광법에서 사용할 수 있는 표지의 비-제한적 예에는 TRIT (테트라메틸 로다민 이소티올), NBD (7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 텍사스 레드 안료, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 선명한 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리쓰로신, 바이오틴, 디곡시제닌, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플루오레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 숙시닐플루오레세인 및 아미노아크리딘이 포함된다. 이들 및 다른 라만 표지는 시판 공급처 (예를 들어, 몰레큐라 프로브스 (Molecular Probes); 오레곤주 유진 소재)로부터 구입할 수 있다.

폴리시클릭 방향족 화합물은 일반적으로 당분야에 공지된 바와 같이 라만 표지로서 기능할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 표지에는 시안화물, 티올, 염소, 브 롬, 메틸, 인 및 황이 포함된다. 탄소 나노튜브도 라만 표지로서 사용할 수 있다. 라만 분광법에서 표지의 사용은 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,306,403호 및 제6,174,677호). 당업자는 라만 표지가 다양한 유형의 뉴클레오티드에 결합될 때 식별가능한 라만 스펙트럼을 발생시켜야 한다는 것을 인식할 것이다.

표지는 뉴클레오티드에 직접 부착시킬 수 있거나, 다양한 링커 화합물을 통해 부착시킬 수 있다. 별법으로, 라만 표지에 공유부착되는 뉴클레오티드 전구체를 표준 시판 공급처 (예를 들어, 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로쉐 몰레큐라 바이오케미칼스; 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션; 텍사스주 오스틴 소재의 암비온 인코포레이티드; 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 파마샤 바이오테크)로부터 구입가능하다. 뉴클레오티드와 같은 다른 분자와 공유결합적으로 반응하도록 디자인된 반응성 기를 보유하는 라만 표지를 구입할 수 있다 (예를 들어, 오레곤주 유진 소재의 몰레큘라 프로브스). 표지된 뉴클레오티드를 제조하고 이를 핵산에 도입하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,962,037호; 제5,405,747호; 제6,136,543호; 제6,210,896호).

검출 유니트

본 명세서에 개시된 예시적 장치는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 퓨린 및/또는 피리미딘을 라만 분광법으로 검출하고(하거나) 정량하도록 디지안된 검출 유니트를 포함할 수 있다. 라만 분광법에 의한 뉴클레오티드의 다양한 검출 방법은 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,306,403호; 제6,002,471호; 및 제6,174,677호를 참조함). 이러한 공지된 방법은 전형적으로 형광 분광법과 같은 공지된 별법으로 확인할 수 있는 뉴클레오티드의 농도보다 더 높은 농도의 뉴클레오티드의 검출을 수반한다. 본 발명 이전에는, 단일 분자 수준에서의 뉴클레오티드의 라만 검출이 개시된 적이 없었다. 표면 증강 라만 분광법 (SERS), 표면 증강 공명 라만 분광법 (SERRS) 및 가간섭성 반-스토크스 라만 분광법 (CARS)에 대한 변법은 개시된 바 있다. SERS 및 SERRS에서, 라만 검출의 감도는 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 표면과 같은 거친 금속 표면 상에 흡착된 분자에 대해 10⁶ 이상의 계수만큼 증가된다. 라만 검출 유니트의 비-제한적 예는 미국 특허 제6,002,471호에 개시되어 있다.

여기 빔은 532 nm 파장에서의 Nd:YAG 레이저 또는 365 nm 파장에서의 Ti:사파이어 레이저에 의해 생성될 수 있다. 펄스 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔을 사용할 수 있다. 여기 빔은 공초점 광학계 및 현미경 대물렌즈를 통과할 수 있고, 채워진 나노입자를 함유하는 나노채널 또는 마이크로채널 상에 집속될 수 있다. 뉴클레오티드로부터의 라만 방사광은 현미경 대물렌즈 및 공초점 광학계로 모아, 분광 해리를 위해 모노크로미터 (monochromator)에 커플링시킬 수 있다. 공초점 광학계는 이변색성 필터, 차단 필터, 공초점 핀홀, 렌즈 및 배경 신호를 감소시키기 위한 거울의 조합을 포함할 수 있다. 공초점 광학계뿐만 아니라 표준 전계 장 광학계 (full field optics)도 사용할 수 있다. 라만 방사 신호는 상기 신호의 계수 및 디지탈화를 위한 컴퓨터와 인터페이스로 접속된 어밸런치 (avalanche) 광다이오드를 포함할 수 있는 라만 검출기로 검출할 수 있다.

단일-광자 계수 방식으로 작동하는 갈륨-아르세나이드 광전자증배관 (RCA 모델 C31034 또는 버를 인더스트리스 (Burle Industries) 모델 C3103402)이 장착된 스펙스 모델 1403 이중-격자 분광측정기를 비롯한 검출 유니트의 대체가능한 예는 예를 들어, 미국 특허 제5,306,403호에 개시되어 있다. 여기 공급원은 스펙트라피직스 (SpectraPhysics)사 모델 166의 514.5 nm 선 아르곤-이온 레이저, 및 647.1 nm 선의 크립톤-이온 레이저 (Innova 70, Coherent)를 포함할 수 있다.

대체 여기 공급원으로는 337 nm의 질소 레이저 (레이저 사이언스 인코포레이티드) 및 325 nm의 헬륨-카드뮴 레이저 (Liconox) (미국 특허 제6,174,677호) 등이 있다. 여기 빔은 밴드패스 필터 (코리온)를 사용하여 분광적으로 정제될 수 있고, 6X 대물렌즈 (뉴포트, 모델 L6X)를 사용하여 나노채널 또는 마이크로채널 상에 집속시킬 수 있다. 대물 렌즈는, 홀로그래픽 빔 스플리터 (카이저 옵티칼 시스템스, 인코포레이티드, 모델 HB 647-26N18)를 사용하여 뉴클레오티드를 여기시키고 라만 신호를 모아 여기 빔 및 방사된 라만 신호에 대한 직각-기하구조를 생성시키는 데 사용할 수 있다. 홀로그래픽 노취 필터 (카이저 옵티칼 시스템스, 인코포레이티드)를 사용하여 레일리 산란 방사선을 감소시킬 수 있다. 대체가능한 라만 검출기에는 레드-증강 강화 전하-커플링 장치 ((RE-ICCD) 검출 시스템 (프린스톤 인스트루먼츠)가 장착된 ISA HR-320 분광사진기가 포함된다. 다른 유형의 검출기, 예컨대, 하전된 주입 장치, 광다이오드 어레이 또는 광트랜지스터 어레이를 사용할 수 있다.

일반 라만 산란, 공명 라만 산란, 표면 증강 라만 산란, 표면 증강 공명 라 만 산란, 가간섭성 반-스토크스 라만 분광법 (CARS), 자극 라만 산란, 역 라만 분광법, 자극 이득 라만 분광법, 하이퍼-라만 산란, 분자 광학 레이저 조사 (MOLE) 또는 라만 마이크로프로브 또는 라만 현미경 또는 공초점 라만 마이크로분광측정법, 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광법, 시간 해상 공명 라만, 라만 디커플링 분광법 또는 UV-라만 현미경을 비롯한, 임의의 적당한 형태 또는 구조의 라만 분광법 또는 당분야에 공지된 관련 기술을 이용하여 뉴클레오티드를 검출할 수 있다.

정보 처리 및 조절 시스템과 데이타 분석

핵산 시퀀싱 장치는 정보 처리 시스템을 포함할 수 있다. 사용된 정보 처리 시스템의 유형은 제한되지 않는다. 예시적 정보 처리 시스템은 정보를 통신하기 위한 모선 및 정보를 처리하기 위한 프로세서를 포함하는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 상기 프로세서는 인텔 코포레이션 (캘리포니아주 산타 클라라 소재)으로부터 구입가능한 펜티엄^{(등록상표)} II 부류, 펜티엄^{(등록상표)} III 부류 및 펜티엄^{(등록상표)} 4 부류의 프로세서를 포함하나 이에 한정되지 않은 펜티엄^{(등록상표)} 부류의 프로세서로부터 선택할 수 있다. 별법으로, 세렐론^{(등록상표)}, 인타늄^{(등록상표)} 또는 펜티엄 제온^{(등록상표)}프로세서 (캘리포니아주 산타클라라 소재의 인텔 코포레이션)일 수 있다. 상기 프로세서는 인텔^{(등록상표)} IA-32 또는 인텔^{(등록상표)} IA-64 아키텍처와 같은 인텔^{(등록상표)} 아키텍처를 기초로 한 것일 수 있다. 별법으로, 다른 프로세서를 사용할 수 있다.

검출 유니트는 정보 처리 시스템에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 검출 유니트로부터의 데이타는 프로세서에 의해 처리될 수 있고 데이타는 주기억장치에 저장될 수 있다. 표준 뉴클레오티드에 대한 방사 프로필에 대한 데이타 또한 주기억장치 또는 ROM에 저장될 수 있다. 프로세서는 나노채널 또는 마이크로채널 내의 뉴클레오티드로부터 나온 방사 스펙트럼을 비교하여 핵산 분자로부터 방출된 뉴클레오티드의 유형을 확인할 수 있다. 주기억장치 또한 핵산 분자로부터 방출된 뉴클레오티드로 된 서열을 저장할 수 있다. 상기 프로세서는 검출 유니트로부터의 데이타를 분석하여 핵산의 서열을 결정할 수 있다. 퓨린 또는 피리미딘만이 표지되고(되거나) 검출되는 경우, 상기 프로세서는 2개의 상보적 핵산 가닥으로부터 얻은 염기 서열을 비교하여 완전한 핵산 서열을 생성할 수 있다.

본 명세서에 기재된 프로세서들이 프로그램된 프로세서의 조절 하에 수행될 수 있는 반면, 상기 프로세서들은 예를 들어, 현장 프로그램가능한 게이트 어레이 (FPGA), TTL 논리, 또는 응용 주문형 직접 회로 (ASIC)와 같은 임의의 프로그램가능한 또는 하드코드된 논리에 의해 전적으로 또는 부분적으로 수행될 수도 있다. 추가로, 개시된 본 방법은 프로그램된 일반용 컴퓨터 구성요소 및/또는 통상의 하드웨어 구성요소의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다.

데이타 수집 작업 후, 데이타는 데이타 분석 작업에 보고될 수 있다. 상기 분석 작업을 용이하게 하기 위하여, 디지탈 컴퓨터를 사용하여 검출 유니트에 의해 얻은 데이타를 분석할 수 있다. 이 컴퓨터는 검출 유니트로부터 데이타를 수용 및 저장하도록 프로그램될 수 있을 뿐 아니라 모은 데이타를 분석 및 보고하도록 프로 그램될 수 있다.

통상의 디자인된 소프트웨어 팩키지를 이용하여 검출 유니트로부터 얻은 데이타를 분석할 수 있다. 데이타 분석은 정보 처리 시스템 및 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 팩키지를 이용하여 수행할 수도 있다. DNA 서열 분석에 있어서 이용가능한 소프트웨어의 비-제한적 예에는 PRISM^(상표명) DNA 시퀀싱 분석 소프트웨어 (캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems)), 시퀀쳐 (Sequencher^(상표명)) 팩키지 (미시간주 앤 하버 소재의 진 코드스 (Gene Codes)), 및 미국 생물공학 정보 시설을 통해 이용가능한 다양한 소프트웨어 팩키지가 포함된다.

실시예

실시예 1: 라만 검출 및 나노입자를 사용한 핵산 시퀀싱

도 1에 예시된 본 발명의 일부 실시양태는 반응 챔버 (101)에서 고정화 표면에 부착될 수 있는 하나 이상의 단일-가닥 핵산 분자 (109)의 시퀀싱을 수반한다. 반응 챔버 (101)는 핵산 분자 (109)의 부착되지 않은 말단으로부터 한번에 한 개의 뉴클레오티드 (110)를 순차적으로 제거하는 1종 이상의 엑소뉴클레아제를 함유할 수 있다.

뉴클레오티드 (110)가 방출될 때, 이 뉴클레오티드들은 미세유체 채널 (102)로 내려가고 검출 유니트를 지나 나노채널 (103) 또는 마이크로채널 (103) 내로 이동한다. 상기 검출 유니트는 여기 빔을 방사하는, 레이저와 같은 여기 공급원 (106)을 포함할 수 있다. 여기 빔은 전자들을 보다 높은 에너지 상태로 여기시키기 위해 방출된 뉴클레오티드 (110)와 상호작용할 수 있다. 전자들을 보다 낮은 에너지 상태로 복귀시킴으로써 발생하는 라만 방사 스펙트럼을 라만 분광 검출기 (107), 예컨대, 분광측정기, 모노크로미터 또는 하전 커플링 장치 (CCD), 예컨대, CCD 카메라로 검출할 수 있다.

뉴클레오티드 (110)가 나노채널 (103) 또는 마이크로채널 (103) 내에 조밀하게 채워진 나노입자 (111)의 영역을 통과할 때 상기 뉴클레오티드 (110)가 여기되고 검출되도록 여기 공급원 (106) 및 검출기 (107)를 배열할 수 있다. 나노입자 (111)는 가교-결합하여 라만 검출을 위한 "열점"을 형성할 수 있다. 뉴클레오티드 (110)가 나노입자 (111) 열점을 통과함으로써, 라만 검출의 감도를 많은 차수의 크기만큼 증가시킬 수 있다.

반응 챔버 , 미세유체 채널 및 마이크로채널의 제조

붕규산염 유리 웨이퍼 (캘리포니아주 산타 아나 소재의 프리시젼 글래스 & 옵틱스 (Precision Glass & Optics))를 농축된 HF (불산) 중에서 단기간 동안 미리 에칭시키고 클리닝한 후, 플라스마-증강 화학 기상 증착법 (PECVD) 시스템 (PEII-A, 캘리포니아주 산 조스 소재의 테크닉스 웨스트 (Technics West)) 중에서 비결정질 규소 희생층을 증착시켰다. 웨이퍼를 헥사메틸디실라잔 (HMDS)으로 프라이밍시키고 광레지스트 (시플레이 (Shipley ) 1818, 매샤추세츠 말보로우 소재)로 회전-코팅하고 소프트-베이킹할 수 있다. 접촉 마스크 정렬기를 사용하여 1종 이상의 마스크 디자인을 가진 광레지스트층을 노출시킬 수 있고, 마이크로포시트 현상제 농축물 (시플레이)과 물의 혼합물을 사용하여 노출된 광레지스트를 제거할 수 있다. 현상된 웨이퍼를 하드-베이킹할 수 있고, PECVD 반응기 중의 CF₄ (사불화탄소) 플라스마를 사용하여 노출된 비결정질 규소를 제거할 수 있다. 농축된 HF로 웨이퍼를 화학적으로 에칭하여 반응 챔버 (101), 미세유체 채널 (102) 및 마이크로채널 (103)을 생성할 수 있다. 남은 광레지스트를 스트립핑하고 비결정질 규소를 제거할 수 있다.

이 프로토콜의 변형 프로토콜로 나노채널 (103)을 형성할 수 있다. 표준 포토리쏘그래피를 이용하여 완전한 형태의 칩의 마이크론 스캐일 소자를 형성할 수 있다. 박층의 레지스트를 칩 상에 코팅할 수 있다. 원자력 현미경/스캐닝 터널링 프로브 팁을 사용하여 칩 표면으로부터 5 내지 10 nm 폭의 레지스트 스트립을 제거할 수 있다. 상기 칩을 희석된 HF로 짧게 에칭하여 상기 칩 표면 상에 나노미터 스캐일 홈을 생성할 수 있다. 본 발명의 비-제한적 실시예에서, 직경이 500 nm 내지 1 ㎛인 채널 (103)을 제조할 수 있다.

다이아몬드 드릴 비트 (크리스탈라이트, 오하이오주 웨스터빌 소재)를 사용하여 에칭된 웨이퍼 내로 엑세스 홀을 뚫을 수 있다. 프로그램가능한 진공 소결로 (센츄리온 VPM, 캘리포니아주 유카이파 제이. 엠. 네이 소재)에서 두 개의 상보적인 에칭 및 천공된 플레이트를 서로 열 결합시켜 완성된 칩을 제조할 수 있다. 반응 챔버 (101), 미세유체 채널 (102) 및 나노채널 (103) 또는 마이크로채널 (103)이 통합된 칩의 제작을 위한 대체가능한 예시적 방법은 미국 특허 제5,867,266호 및 제6,214,246호에 개시되어 있다. 분자량 컷오프가 2,500 달톤인 나일론 필터를 반응 챔버 (101)와 미세유체 채널 (102) 사이에 삽입시켜 엑소뉴클레아제 및/또는 핵산 (109)이 반응 챔버 (101)로부터 누출되는 것을 방지할 수 있다.

나노입자 제조

은 나노입자 (111)는 문헌 [Lee and Meisel (J. Phys. Chefs. 86: 3391-3395, 1982)에 따라 제조할 수 있다. 금 나노입자 (111)는 폴리사이언스, 인코포레이티드 (펜실베니아주 와링톤 소재), 나노프로브스 , 인코포레이티드 (뉴욕주 야판크 소재) 또는 테드-펠라 인코포레이티드 (캘리포니아주 레딩 소재)로부터 구입할 수 있다. 비-제한적 실시예에서, 60 nm의 금 나노입자 (111)를 사용할 수 있다. 당업자는 5, 10 또는 20 nm와 같은 다른 크기의 나노입자 (111)도 사용할 수 있음을 인식할 것이다.

금 나노입자 (111)는 5 nm 내지 50 nm의 쇄길이를 가진 알칸 디티올과 반응할 수 있다. 링커 화합물은 금 나노입자 (111)와 반응하기 위해 알칸의 양 말단에서 티올기를 보유할 수 있다. 링커 화합물에 비하여 과량의 나노입자 (111)를 사용할 수 있고, 링커 화합물을 나노입자 (111)에 서서히 첨가하여 큰 나노입자 응집체의 형성을 피할 수 있다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 1 M 슈크로스 중에서의 초원심분리로 나노입자 (111) 응집체를 단일 나노입자 (111)로부터 분리할 수 있다. 전자 현미경은 이 방법에 의해 만들어진 응집체가 응집체 당 2 내지 6개의 나노입자 (111)를 함유한다는 것을 보여준다. 미세유체 흐름을 이용하여, 응집된 나노입자 (111)를 마이크로채널 (103) 내에 로딩시킬 수 있다. 마이크로채 널 (103)의 말단에 있는 협착 또는 필터를 이용하여 나노입자 응집체 (111)를 제자리에 유지시킬 수 있다.

핵산 분리 및 엑소뉴클레아제 처리

인간 염색체 DNA를 문헌 (Sambrook et al. (1989))에 따라 정제할 수 있다. BamH1을 사용한 절단 후, 게놈 DNA 단편을 pBluescript II 파지미드 벡터 (스트라타진, 인코포레이티드, 캘리포니아주 라 졸라 소재)의 복수 클로닝 부위 (MCS) 내에 삽입하고 이. 콜라이에서 생장시켰다. 앰피실린-함유 아가로스 플레이트 상에 플레이팅한 후, 단일 콜로니를 선택하여 시퀀싱을 위해 생장시킬 수 있다. 헬퍼 파지를 사용한 동시-감염으로 게놈 DNA 삽입체의 단일-가닥 DNA 카피를 구조(rescue)할 수 있다. 프로테이나제 K:황산도데실나트륨 (SDS) 용액 중에서의 절단 후, DNA를 페놀로 추출한 다음 아세트산나트륨 (pH 6.5, 약 0.3 M) 및 0.8배 부피의 2-프로판올을 첨가하여 침전시킬 수 있다. DNA 함유 펠렛을 트리스-EDTA 완충제에 재현탁시키고 사용할 때까지 -20℃에 저장할 수 있다.

게놈 DNA 삽입체 옆에 위치한, 공지된 pBluescript^{(등록상표)} 서열에 상보적인 M13 전방향 프라이머를 미들랜드 서티파이드 리전트 컴파니 (Midland Certified Reagent Company; 텍사스주 미들랜드 소재)로부터 구입할 수 있다. 이 프라이머는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 부착된 바이오틴 잔기를 보유하도록 공유결합적으로 변형될 수 있다. 상기 바이오틴 기는 (CH₂)₆ 스페이서를 통해 상기 프라이머의 5'-포스페이트에 공유결합될 수 있다. 바이오틴-표지 프라이머를 pBluescript^{(등록상 표)} 벡터로부터 제조된 ssDNA 주형 분자에 혼성화시킬 수 있다. 상기 프라이머-주형 결합체를 문헌 [Dorre et al. (Bioimaging 5: 139-152, 1997)]에 따라 스트렙타비딘 코팅 비드에 부착시킬 수 있다. 적절한 DNA 희석액에서, 단일 프라이머-주형 결합체는 단일 비드에 부착된다. 단일 프라이머-주형 결합체를 보유하는 비드를 시퀀싱 장치 (100)의 반응 챔버 (101) 내에 삽입시킬 수 있다.

프라이머-주형을 변형된 T7 DNA 폴리머라제 (유나이티드 스테이트 바이오케미칼 코포레이션, 오하이오주 클레블랜드 소재)와 함께 인큐베이션시킬 수 있다. 이 반응 혼합물은 표지되지 않은 데옥시아데노신-5'-트리포스페이트 (dATP) 및 데옥시구아노신-5'-트리포스페이트 (dGTP), 디곡시제닌-표지 데옥시유리딘-5'-트리포스페이트 (디곡시제닌-dUTP) 및 로다민-표지 데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 (로다민-dCTP)를 함유할 수 있다. 중합 반응은 37℃에서 2시간 동안 진행시킬 수 있다. 디곡시제닌 및 로다민으로 표지된 핵산의 합성 후, 주형 가닥을 표지된 핵산으로부터 분리할 수 있고, 주형 가닥, DNA 폴리머라제 및 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 반응 챔버 (101)로부터 세척하여 제거할 수 있다. 별법으로, 중합에 사용되는 모든 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 표지하지 않을 수 있다. 다른 별법에서, 상보적 가닥의 중합 없이 단일 가닥 핵산을 직접 시퀀싱할 수 있다.

엑소뉴클레아제 활성은 반응 챔버 (101)에 엑소뉴클레아제 III를 첨가함으로써 개시할 수 있다. 반응 챔버는 pH 8.0 및 37℃에서 유지될 수 있다. 뉴클레오티드 (110)가 핵산의 3' 말단으로부터 방출되면, 이들은 미세유체 흐름에 의해 미 세유체 채널 (102)로 운반될 수 있다. 마이크로채널 (103)에 들어가면, 한 쌍의 전극 (104, 105)에 의해 생성된 전위 구배를 이용하여 뉴클레오티드 (110)가 미세유체 채널 (102)로부터 나와 마이크로채널 (103)로 들어가게 할 수 있다. 뉴클레오티드 (110)로 채워진 나노입자 (111)를 통과할 때, 이들은 레이저 (106)로부터 나온 여기 방사선에 노출될 수 있다. 아래에 개시된 바와 같이 라만 검출기 (107)로 라만 방사 스펙트럼을 검출할 수 있다.

뉴클레오티드의 라만 검출

실시예 2에 개시된 바와 같은 라만 검출 유니트를 사용할 수 있다. 라만 검출기 (107)는 이 검출기 (107)을 지나 이동하는 dATP, dGTP, 로다민-dCTP 및 디곡시제닌-dUTP인 단일 뉴클레오티드 (110)를 검출하고 확인할 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 검출을 위한 시간 경로에 대한 데이타를 모아 분석하여 핵산 서열을 얻을 수 있다. 대체 실시양태에서, 검출기 (107)는 표지되지 않은 단일 뉴클레오티드를 검출하고 확인할 수 있다.

실시예 2: 뉴클레오티드의 라만 검출

방법 및 장치

비-제한적 실시예에서, 라만 검출 유니트의 여기 빔은 근적외선 파장 (750~950 nm)의 티타늄:사파이어 레이저 (Mira by Coherent) 또는 785 nm 또는 830 nm의 갈륨 알루미늄 아르세나이드 다이오드 레이저 (프로세스 인스트루먼츠사의 PI-ECL 시리즈)에 의해 생성되었다. 펄스 레이저 빔 또는 연속 빔을 사용하였다. 이변색성 거울 (카이저 옵티칼의 홀로그래픽 노취 필터 또는 크로마 (Chroma) 또는 오메가 (Omega) 옵티칼의 이변색성 간섭 필터)을 통해 여기 빔을 합쳐진 빔을 가진 공선 구조 내로 전송하였다. 전송된 빔은 현미경 대물렌즈 (니콘 LU 시리즈)를 통과하여 표적 피분석물 (뉴클레오티드 또는 퓨린이나 피리미딘 염기)가 위치한 라만 활성 기판 상에 집속하였다.

피분석물로부터 나온 라만 산란 광은 동일한 현미경 대물렌즈로 모았고, 이변색성 거울을 통과하여 라만 검출기로 이동하였다. 라만 검출기는 집속 렌즈, 분광사진기 및 어레이 검출기를 포함하였다. 집속 렌즈는 분광사진기의 입구 슬릿을 통해 라만 산란 광을 집속하였다. 분광사진기 (악톤 리서치)는 그 파장으로 광을 분산시키는 격자를 포함하였다. 분산광의 이미지가 어레이 검출기 (로퍼 사이언티픽 (Roper Scientific)의 후면-조명방식의 깊은-공핍 CCD 카메라) 위에 만들어졌다. 상기 어레이 검출기는 데이타 전달 및 검출기 기능의 조절을 위한 컴퓨터에 연결된 제어 회로에 연결되었다.

표면-증강 라만 분광법 (SERS)의 경우, 라만 활성 기판은 금속성 나노입자 또는 금속-코팅 나노구조체로 구성되었다. 5 내지 200 nm 크기의 은 나노입자를 문헌 [Lee and Meisel (J. Phys. Chem., 86: 3391,1982)]의 방법으로 제조하였다. 별법으로, 현미경 대물렌즈 하의 알루미늄 기판 상에 샘플을 놓았다. 하기 논의된 도면들을 알루미늄 기판 상의 정지 샘플에서 모았다. 검출된 분자의 수는 조명된 샘플의 광학 회수 부피에 의해 결정되었다.

미세유체 채널을 사용한 SERS로 단일 뉴클레오티드를 검출할 수도 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 뉴클레오티드는 미세유체 채널 (약 5 내지 200 ㎛ 폭)을 통해 라만 활성 기판으로 전달될 수 있다. 미세유체 채널은 문헌 [Anderson et al. ("Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping, "Anal. Chem. 72: 3158-3164, 2000)에 개시된 기술을 이용하여 폴리디메틸실록산 (PDMS)을 성형하여 만들 수 있다.

SERS가 은 나노입자의 존재 하에 수행되는 경우, 뉴클레오티드, 퓨린 또는 피리미딘 피분석물을 LiCl (90 μM 최종 농도) 및 나노입자 (90.25 M 의 최종 농도 은 원자)와 혼합하였다. SERS 데이타는 실온의 피분석물 용액을 사용하여 모았다.

결과

상기 개시된 시스템을 이용하여 SERS로 뉴클레오시드 모노포스페이트, 퓨린 및 피리미딘을 분석하였다. 표 1은 관심있는 다양한 피분석물에 대한 예시적 검출 한계를 보여준다.

뉴클레오시드 모노포스페이트, 퓨린 및 피리미딘의 SERS 검출

피분석물	최종 농도	검출된 분자의 수
dAMP	9 피코몰 (pM)	~1 분자
아데닌	9 pM	~1 분자
dGMP	90 μM	6X10⁶
구아닌	909 pM	60
dCMP	909 μM	6X10⁷
시토신	90 nM	6X10³
dTMP	9 μM	6X10⁵
티민	90 nM	6X10³

조건은 아데닌 뉴클레오티드만에 대해 최적화하였다. LiCl ((90 μM의 최종 농도)를 측정하여 아데닌 뉴클레오티드의 최적 SERS 검출을 제공하였다. 다른 알칼리-금속 할로겐화물 염, 예컨대, NaCl, KCl, RbCl 또는 CsCl을 사용하여 다른 뉴클레오티드의 검출을 용이하게 할 수 있다. 청구된 방법은 사용되는 전해질 용액에 의해 제한되지 않고, MgCl, CaCl, NaF, KBr, LiI 등과 같은 다른 유형의 전해질 용액을 사용할 수 있다는 것이 예상된다. 당업자는 강한 라만 신호를 나타내지 못하는 전해질 용액이 뉴클레오티드의 SERS 검출을 최저 수준으로 방해할 것이라는 것을 인식할 것이다. 이 결과는 상기 라만 검출 시스템 및 방법이 단일 뉴클레오티드 분자 및 퓨린 염기 분자를 검출하고 확인할 수 있었다는 것을 입증한다. 이것은 단일 뉴클레오티드 수준에서 표지되지 않은 뉴클레오티드의 라만 검출의 최초 보고이다.

실시예 3. 뉴클레오티드, 퓨린 및 피리미딘의 라만 방사 스펙트럼

표시된 변형을 가진, 실시예 2의 프로토콜을 이용하여 관심있는 다양한 피분석물의 라만 방사 스펙트럼을 얻었다. 도 2는 표면 증강 및 라만 표지의 부재 하에 4가지 뉴클레오시드 모노포스페이트 각각의 100 mM 용액의 라만 방사 스펙트럼을 보여준다. LiCl을 용액에 전혀 첨가하지 않았다. 10 초 데이타 회수 시간을 이용하였다. 보다 긴 회수 시간, 표면 증강, 표지된 뉴클레오티드 및/또는 첨가된 전해질 용액을 사용하여 보다 낮은 농도의 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 여기는 514 nm에서 일어났다. 하기 도면 각각의 경우, 785 nm의 여기 파장을 이용하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 비-증강 라만 스펙트럼은 표지되지 않은 4가지 뉴클레오시드 모노포스페이트 각각에 대해 특징적인 방사 피크를 나타내었다.

도 3은 LiCl 및 은 나노입자의 존재 하에 1 nm의 구아닌 용액의 SERS 스펙트럼을 보여준다. 문헌 [Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L.B. Townsend and R. S. Tipson (eds.), Wiley-Interscience, New York, 1978]에 논의된 바와 같이, 구아닌은 산 처리에 의해 dGMP로부터 얻었다. 100 msec 데이타 회수 시간을 이용하여 SERS 스펙트럼을 얻었다.

도 4는 산 가수분해에 의해 dCMP로부터 얻은 10 nM 시토신 용액의 SERS 스펙트럼을 보여준다. 1 초 회수 시간을 이용하여 데이타를 모았다.

도 5는 dTMP의 산 가수분해에 의해 얻은 100 nM 티민 용액의 SERS 스펙트럼을 보여준다. 100 msec 회수 시간을 이용하여 데이타를 모았다.

도 6은 dAMP의 산 가수분해에 의해 얻은 100 pM 아데닌 용액의 SERS 스펙트럼을 보여준다. 1 초 동안 데이타를 모았다.

도 7은 500 nM dATP 용액 (하부 흔적) 및 500 nM 플루오레세인-표지 dATP 용액 (상부 흔적)의 SERS 스펙트럼을 보여준다. dATP-플루오레세인은 로쉐 어플라이드 사이언스 (인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 구입하였다. 도면은 플루오레세인을 사용한 표지 때문에 SERS 신호의 높은 증가를 보여준다.

실시예 4. 뉴클레오티드 및 증폭 생성물의 SERS 검출

은 나노입자 형성

SERS 검출에 사용되는 은 나노입자는 문헌 [Lee and Meisel(1982)]에 따라 제조하였다. 18 ㎎의 AgNO₃를 100 ㎖ (밀리리터)의 증류수에 용해시키고 끓을 때까지 가열하였다. 10 ㎖의 1% 구연산나트륨 용액을 10분에 걸쳐 상기 AgNO₃ 용액에 적가하였다. 용액을 다시 1시간 동안 계속 끓였다. 생성된 은 콜로이드 용액을 냉각시켜 저장하였다.

아데닌의 SERS 검출

라만 검출 시스템은 실시예 2에 개시된 바와 같았다. 1 ㎖의 은 콜로이드 용액을 2 ㎖의 증류수로 희석하였다. 알루미늄 트레이 상에서 희석된 은 콜로이드 용액 (160 ㎕) (마이크로리터)을 20 ㎕의 10 nM (나노몰) 아데닌 용액 및 40 ㎕의 LiCl (0.5 몰)과 혼합하였다. LiCl은 아데닌에 대한 라만 증강제로서 작용한다. 약 100 내지 150 펨토리터의 검출 부피에서, 대략 60개 분자의 아데닌을 함유하는 샘플 중의 아데닌의 최종 농도는 0.9 nM이었다. 785 nm 여기의 여기 공급원 및 100 밀리초 회수 시간을 이용하여 라만 방사 스펙트럼을 모았다. 도 8에 도시된 바와 같이, 이 과정은 약 833 nm 및 877 nm에서 검출된 강한 방사 피크를 가진, 60개 분자의 아데닌의 검출을 보여주었다. 실시예 2에 논의된 바와 같이, 개시된 본 방법 및 장치를 이용하여 아데닌의 단일 분자 검출을 보여주었다.

롤링 서클 증폭

1 피코몰 (pmol)의 롤링 서클 증폭 (RCA) 프라이머를 0.1 pmol의 원형 단일 가닥 M13 DNA 주형에 첨가하였다. 이 혼합물을 1X T7 폴리머라제 160 완충제 (20 mM (밀리몰) 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM 디티오트레이톨), 0.5 mM dNTP 및 2.5 유니트의 T7 DNA 폴리머라제와 함께 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 RNA 생성물을 형성시켰다. DNA 폴리머라제 없이 상기 시약들을 혼합하고 인큐베이션하여 음성 대조구를 제조하였다.

RCA 생성물의 SERS 검출

1 ㎕의 RCA 생성물 및 1 ㎕의 음성 대조 샘플을 따로 알루미늄 트레이 상에 점을 찍고 공기 건조하였다. 각 점을 5 ㎕의 1X PBS (인산염 완충 식염수)로 세정하였다. 세정을 3회 반복하였고, 최종 세정 후 상기 알루미늄 트레이를 공기 건조하였다.

상기와 같이 제조한 1 ㎖의 은 콜로이드 용액을 2 ㎖의 증류수로 희석하였다. 희석된 은 콜로이드 용액 8 ㎕를 2 ㎕의 0.5 M LiCl과 혼합하고 알루미늄 트레이 상의 RCA 생성물 점에 첨가하였다. 상기 용액을 음성 대조구 점에 첨가하였다. 라만 신호를 하기와 같이 모았다. 도 9에 도시된 바와 같이, 833 nm 및 877 nm에서 방사 피크를 가진 RCA 생성물을 SERS로 검출할 수 있었다. LiCl 증강제를 사용하는 이 프로토콜의 조건 하에, 아데닌 잔기로부터의 신호 강도는 구아닌, 시토신 및 티민으로부터의 신호 강도보다 더 강하다. 음성 대조구 (도시되지 않음)는 증폭의 부재 하에서 신호가 관찰되지 않았으므로 라만 신호가 RCA 생성물에 대한 것임을 보여주었다.

실시예 5. 핵산의 엑소뉴클레아제 절단

문헌 [Sauer et al. (J. Biotech. 86: 181- 201, 2001)에 따라 엑소뉴클레아제 처리를 행하였다. 5'-바이오티닐화 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 핵산 주형의 PCR 증폭을 통해 바이오틴으로 5' 말단을 표지한 단일 핵산 분자를 제조하였다. 원뿔 형태의 3 ㎛ 단일-방식 광학 섬유 (SMC-A0630B, 레이저 컴포넌츠 GmbH, Olching, Germany)를 제조하였다. 유리 섬유는 HF로 화학적으로 에칭하여 날카로운 팁을 형성하였다. 3-머캡토프로필트리메톡시실란으로 코팅한 후, γ-말레인이미도부티르산 N-히드록시숙신아미드 (GMBS)로 상기 팁을 처리하였다. 섬유의 팁을 스트렙타비딘으로 활성화시키고 바이오티닐화 DNA에 결합시켰다. 결합되지 않은 DNA를 세척하여 제거하였다.

결합된 단일 DNA 분자를 함유하는 섬유를 5 ㎛ 마이크로채널에 부착된 PDMS 반응 챔버 내에 삽입하였다. ssDNA의 절단을 개시하기 위해 엑소뉴클레아제 I을 상기 반응 챔버에 첨가하였다. 광학 트랩을 사용하여 상기 엑소뉴클레아제를 반응 챔버에 가두었다 [예를 들어, 문헌 (Walker et al., FEBS Lett. 459: 39-42, 1999 ; Bennink et al., Cytometry 36: 200-208, 1999; Mehta et al., Science 283: 1689-95, 1999; Smith et al., Am. J. Phys. 67: 26-35, 1999)]. 광학 트랩핑 장치는 셀 로보틱스, 인코포레이티드 (뉴멕시코주 알부퀘르크 소재), S+L GmbH (독일 하이델베르그 소재) 및 P.A.L.M. Gmbh (독일 울프라트슈아젠 소재)로부터 구입가능하다. 실시예 2에 개시된 바와 같이, 뉴클레오시드 모노포스페이트는 엑소뉴클레아제 절단에 의해 방출되고 미세유체 흐름에 의해 라만 검출기를 지나 운반되었다.

용액 중의 뉴클레오티드는 유체역학 집속을 이용하여 레이저 여기 및 검출 부피 내에서 집속하였다. 90 μM 농도의 LiCl를 상기 검출 혼합물에 첨가하고, 검출기 근처의 미세유체 채널을 문헌 [Lee and Meisel (1982)]에 따라 제조된 은 나노입자로 채웠다. 단일 뉴클레오티드가 라만 검출기를 지나 흐를 때 단일 뉴클레오티드가 검출되어 핵산 서열이 결정된다.

본 명세서에 개시되고 청구된 모든 방법 및 장치는 본 발명의 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 제조하여 사용할 수 있다. 청구된 본 발명의 개념, 기술사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 방법 및 장치에 변형을 가할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련된 일부 물질은 본 명세서에 기재된 물질을 대체할 수 있고 이 경우 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있음이 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 청구된 본 발명의 기술사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

Claims

a) 하나 이상의 핵산 분자의 한 말단으로부터 뉴클레오티드를 순차적으로 제거하는 단계;

b) 나노입자로 채워진 채널을 통해 상기 뉴클레오티드를 이동시키는 단계;

c) 라만 분광법으로 하나 이상의 뉴클레오티드를 확인하는 단계; 및

d) 상기 핵산을 특징규명하는 단계

를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제 활성에 의해 상기 핵산으로부터 제거되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 분자를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 표지되지 않은 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 표지된 것인 방법.
제3항에 있어서, 단일 아데노신 뉴클레오티드 분자를 확인하는 단계를 추가 로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드만이 확인되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 시티딘 및 티미딘 뉴클레오티드만이 확인되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드로부터 퓨린 또는 피리미딘 염기를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 분리된 퓨린 또는 피리미딘 염기가 라만 분광법에 의해 확인되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단일 핵산 분자가 시퀀싱되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 표면 증강 라만 분광법 (SERS), 표면 증강 공명 라만 분광법 (SERRS) 및/또는 가간섭성 반-스토크스 라만 분광법 (CARS)에 의해 확인되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 채널이 나노채널 또는 마이크로채널인 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산을 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 핵산 내의 단일 뉴클레오티드 다형성을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
a) 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 제조하는 단계;

b) 상기 핵산의 한 말단으로부터 뉴클레오티드를 순차적으로 제거하는 단계;

c) 나노입자로 채워진 채널을 통해 상기 뉴클레오티드를 이동시키는 단계;

d) 라만 분광법으로 하나 이상의 뉴클레오티드를 확인하는 단계; 및

e) 상기 핵산을 특징규명하는 단계

를 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 각각의 유형의 뉴클레오티드가 식별가능한 라만 표지로 표지된 것인 방법.
제18항에 있어서, 피리미딘 뉴클레오티드만이 표지된 것인 방법.
제18항에 있어서, 퓨린 뉴클레오티드만이 표지된 것인 방법.
제17항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 분자가 확인되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 단일 아데노신 뉴클레오티드 분자를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 핵산으로부터 상기 뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 채널을 통해 상기 뉴클레오티드를 이동시키기 위해 전기장을 가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 채널을 통해 각 뉴클레오티드가 통과하는 시간을 기록하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
a) 반응 챔버;

b) 이 반응 챔버와 유체 통신 상태에 있는 제1 채널;

c) 상기 제1 채널과 유체 통신 상태에 있는 제2 채널;

d) 상기 제2 채널에 채워져 있는 다수의 나노입자; 및

e) 상기 나노입자로 채워진 채널에 작동가능하게 커플링된 라만 검출기

를 포함하는 장치.
제26항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 분자를 검출할 수 있는 것인 장치.
제26항에 있어서, 뉴클레오티드를 상기 제1 채널로부터 상기 제2 채널로 이동시키기 위한 제1 전극 및 제2 전극을 추가로 포함하는 장치.
제20항에 있어서, 상기 제1 채널이 미세유체 채널인 것인 장치.
제20항에 있어서, 상기 제2 채널이 나노채널 또는 마이크로채널인 것인 장치.